專利名稱：一種以dsf為底物的降解菌的篩選方法
技術領域：
本發(fā)明涉及篩選降解可擴散性信號分子(DSF)為底物的降解菌的篩選方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
黃單胞菌(Xanthomonas spp.)是分布最廣泛的與植物相關的細菌性病原物之一。研究表明，這個屬的成員可以侵染124種單子葉植物和268種雙子葉植物(Leyns etal. , 1984)。其中最具有經(jīng)濟意義的幾個種,如野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)是絕對優(yōu)勢種，它至少有141個致病變種，能侵染許多植物，包括重要的農作物，如甘藍、花椰菜、椰菜、番爺、胡椒、棉花、大豆和胡桃等(Hayward, 1993);稻黃單胞(Xanthomonas oryzae)包含2個致病變種，侵染水稻引起嚴重損失；地毯草黃單胞柑橘致病變種是危害柑橘最為嚴重的病原細菌。針對植物細菌病害，目前生產(chǎn)上尚無十分有效的控制措施。種子處理雖然能有效地阻止病害通過種子傳播，但對老病區(qū)而言，控病效果并不理想；目前仍沒有十分有效地化學藥劑；因此，一旦細菌病害大面積發(fā)生和流行。短時間內難以拿出有效的防控措施。日益增加的證據(jù)表明細菌不是一個孤立的有機體，而是利用一些小的化學信號分子進行積極的信息交流。群體感應(Quorum Sensing, QS)就是細胞間信息交流機制之一，細菌通過QS機制來監(jiān)測其分泌到環(huán)境中的信號分子的積累情況，從而做出應答，計算它的群體數(shù)量(Whitehead et al. , 2001 ；Fuqua and Greenberg, 2002)。與其他細菌相似，黃單胞也進化出了再群體水平上進行遺傳調節(jié)的QS系統(tǒng)。早期的轉座子誘變分析揭示了一個野油菜黃單胞菌的基因簇，并定義為rpfABCDEFG，該基因簇調節(jié)致病因子，包括EPS和胞外酶的產(chǎn)生(Tanget al. , 1991)。此后,將rpfF突變株靠近野生型菌株聯(lián)合培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)rpfF突變體蛋白酶的產(chǎn)生量恢復到野生型水平，這個結果表明，野油菜黃單胞野生型菌株能夠產(chǎn)生一種可擴散的信號因子(Diffusible singal factor, DSF) (Barber et al·, 1997)。目前已經(jīng)確定DSF是一種短鏈脂肪酸,其結構為順式-11-甲基-2-十二碳烯酸(Wang et al.,2004)。DSF代表了細菌中一個新的QS信號分子家族。近年來，已經(jīng)從多種黃單胞菌包括木質部小菌屬中檢測到DSF活性，并明確其對致病性的顯著調控作用(Newman et al.，2004)。近期的研究表明，黃單胞產(chǎn)生的QS信號分子DSF能夠被多種細菌降解，這些細菌包括 Bacillus, Paenibacillus, Microbacterium, Staphylococcus 和 Pseudomonas 等屬?；诩毦鶴S系統(tǒng)的特殊功能，科學家研究的焦點集中在抑制細菌群體感應系統(tǒng)上。通過抑制QS信號分子的產(chǎn)生、降解QS信號分子，阻斷QS系統(tǒng)的級聯(lián)反應等多種途徑來減弱細菌的致病性。主要參考文獻Barber C. E.，Tang J. L，F(xiàn)eng J. X.，et al. 1997. a novel regulatory systemrequired for pathogenicity ofXanthomonas campestris is mediated by a smalldiffusible signal molecule. Mol Microbiol24 :556-566.
Fuqua C&Greenberg EP (2002)Listening in on bacteria acylhomoserinelactone signaling. Nat RevMol Biol3 :685-695Leyns et al. 1984. The host range of the genus Xanthomonas. Bot Rev50 308-355Newman et al. 2008. virulence of planthogenic bacteria attenuated bydegration of fatty acidcell—to—celI signaling factors. Mol Plant MicrobeInteract 21 :326-334.

發(fā)明內容
技術問題本發(fā)明的目的是發(fā)明一種利用四唑紫為指示標記的能夠快速、靈敏、準確的以DSF為底物的降解菌的篩選方法。技術方案“碳源一四唑紫-96孔細胞培養(yǎng)板”篩選方法的建立本篩選方法是根據(jù)BI0L0G細菌鑒定系統(tǒng)原理自行設計的。四唑紫(tetrazoliumviolet)是一種氧化還原指示劑，能夠競爭氧化還原反應中的電子，獲得電子后，四唑紫由無色變?yōu)樽仙?，獲得的電子越多，紫色越深。本研究以DSF(diffusible signal factor)作為待測碳源，若細菌能夠利用該碳源就能發(fā)生氧化還原反應，有電子轉移，通過四唑紫由無色變?yōu)樽仙?，進而篩選能夠降解DSF的陽性菌株。試驗材料四唑紫(tetrazoliumviolet)購自 SIGMA 公司(69H1223), DSF 標準品購自Cayman公司(10008123)，96孔細胞培養(yǎng)板購自BOYANG公司，菌株G來自Karyn L. Newman,已報道能夠降解DSF。試驗方法接種液的配制I)將菌株G于NA培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)24h后，取無菌棉簽在接種液(0.4% NaCl水溶液)中蘸濕。2)將棉簽在菌落表面滾動，粘取菌體，注意不要帶出培養(yǎng)基。3)在接種液管液面上沿內壁轉動棉簽，使菌體附著在內壁上，同時將菌體均勻打散。4)傾斜接種液管，用棉簽將菌體分散于接種液中。5)調整 0D_ = 0.6。篩選液的配制DSF (diffusible signal factor)是一種短鏈脂肪酸,在水中的溶解度為0. 5mg/mL(25°C )，因此，將 DSF依次配制成濃度為 0. 025,0. 05,0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5mg/mL 的水溶液，分別取100 μ L加入96孔細胞培養(yǎng)板內，并以無菌水作為陰性對照。每孔加入50 μ L的四唑紫(0. lmg/mL, H20)以及150 μ L的接種液，置于28°C培養(yǎng)12_16h后觀察顏色變化。(四)說明書附I. “碳源一四唑紫-96孔細胞培養(yǎng)板”篩選方法的靈敏度檢測結果。圖2. “碳源一四唑紫-96孔細胞培養(yǎng)板”篩選方法的特異性檢測結果。
1-10 :已報道的不能夠降解DSF的菌株，11 G菌，12 :無菌水。圖3.利用“碳源一四唑紫-96孔細胞培養(yǎng)板”篩選方法對實際樣品的檢測結果。1-94 :分離的待測菌株；95 G菌，96 :無菌水。
具體實施例方式對不同生境細菌的篩選取樣地點I)從發(fā)生水稻白葉枯病的稻田取土樣及發(fā)病的水稻植株；2)從加油站油料污染的土壤取土樣； 3)從池塘水取水樣；4)從陰溝附近取土樣；5)從飯店抽油煙機外排管正對的油污地面取土樣。6)將待測菌株于NA培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)24h后，取無菌棉簽在接種液(O. 4% NaCl水溶液)中蘸濕。7)將棉簽在菌落表面滾動，粘取菌體，注意不要帶出培養(yǎng)基。8)在接種液管液面上沿內壁轉動棉簽，使菌體附著在內壁上，同時將菌體均勻打散。9)傾斜接種液管，用棉簽將菌體分散于接種液中。10)調整 OD600 = 0 . 6。篩選液的配制DSF (diffusible signal factor)是一種短鏈脂肪酸,在水中的溶解度為O. 5mg/mL (25°C )，因此，將DSF配制成濃度為O. 5mg/mL的水溶液，分別取100 μ L加入96孔細胞培養(yǎng)板內，并以無菌水作為陰性對照。每孔加入50 μ L的四唑紫(O. lmg/mL,H20)以及150 μ L的接種液，置于28°C培養(yǎng)12-16h后觀察顏色變化。篩選結果目前為止，從不同生境獲得5000余株細菌中，共篩選出57株具有降解DSF的陽性菌株，經(jīng) 16SrRNA 測序鑒定分別屬于 Bacillus、Paenibacillus、Microbacterium、Staphylococcus、Pseudomonas 屬。
權利要求
1.用于篩選可擴散的信號因子即DSF降解菌的方法，其篩選方法主要利用的是四唑紫的顏色變化，若細菌能夠利用DSF為碳源就能發(fā)生氧化還原反應，有電子轉移，通過四唑紫由無色變?yōu)樽仙?，進而篩選能夠降解DSF的陽性菌株。
2.權利要求I的篩選方法，其步驟為 (I)將待測菌株于NA培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)24h后，取無菌棉簽在接種液即O. 4% NaCl水溶液中蘸濕；(2)將棉簽在菌落表面滾動，粘取菌體，轉移于接種液中，調整0D_ = 0.6 ； (3)取100 μ L O. 5mg/mL的DSF水溶液，加入96孔細胞培養(yǎng)板內，每孔加入50 μ L的O. lmg/mL四唑紫水溶液，加入150 μ L的接種液，置于28°C培養(yǎng)12-16h后觀察顏色變化。
全文摘要
本發(fā)明涉及篩選降解可擴散性信號分子(DSF)為底物的降解菌的篩選方法，屬于生物技術領域。本篩選方法是根據(jù)BIOLOG細菌鑒定系統(tǒng)原理自行設計的，以DSF(diffusible signalfactor)作為待測碳源，若細菌能夠利用該碳源就能發(fā)生氧化還原反應，有電子轉移，通過四唑紫由無色變?yōu)樽仙?，進而篩選能夠降解DSF的陽性菌株。圖為利用本方法對不同生境細菌的降解DSF的篩選結果。
文檔編號C12R1/07GK102876613SQ20121038852
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月15日 優(yōu)先權日2012年10月15日
發(fā)明者胡白石, 田艷麗, 趙玉強, 劉鳳權 申請人:南京農業(yè)大學