專利名稱：利用短同源序列進(jìn)行克雷伯氏肺炎桿菌基因重組的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因重組的方法，特別是涉及一種利用短同源序列進(jìn)行克雷伯氏肺炎桿菌基因重組的方法。
背景技術(shù)：
克雷伯氏肺炎桿菌(Klebsiellapneumoniae)是一株革蘭氏陰性細(xì)菌,是克雷伯氏菌屬的模式種，屬于腸桿菌科?？死撞戏窝讞U菌具有生長(zhǎng)速度快、可以利用多種碳源和代謝產(chǎn)物豐富等特點(diǎn)，目前主要作為2，3-丁二醇和1，3-丙二醇等化學(xué)品的生產(chǎn)用菌，同時(shí)克雷伯氏肺炎桿菌可以代謝合成3-羥基丙醛、乙醇、乙偶姻、琥珀酸、乙酸、乳酸、氫氣等化學(xué)品，克雷伯氏肺炎桿菌還可以作為宿主細(xì)胞構(gòu)建3-羥基丙酸等化合物生產(chǎn)菌，使得克雷伯 氏肺炎桿菌成為一種具有廣闊工業(yè)化應(yīng)用前景的微生物。由于克雷伯氏肺炎桿菌特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和遺傳背景，適應(yīng)于克雷伯氏肺炎桿菌的遺傳改造方法操作比較復(fù)雜。目前，對(duì)克雷伯肺炎桿菌進(jìn)行基因改造的主要方法有轉(zhuǎn)座子插入突變和同源重組敲除目的基因，而同源重組方法主要涉及到用自殺性質(zhì)粒和用線性的DNA進(jìn)行重組。轉(zhuǎn)座子插入突變是利用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)的插入染色體上，使被插入的基因失活。常見(jiàn)的轉(zhuǎn)座子有Tn5、TnlO、Tn916、Tn917等。Chang HY等利用Tn5在克雷伯氏肺炎桿菌CG43的染色體上插入失活得到莢膜缺失的菌株[Chang HY, et al. , Virulence and outermembrane properties of a galUmutant of Klebsiella pneumoniae CG43. Microbial pathogenesis，1996，20 (5) :P. 255-261]。自殺性質(zhì)粒的方法是通過(guò)向克雷伯氏菌中引入自殺性質(zhì)粒，使處于質(zhì)粒上的序列與染色體上的同源序列發(fā)生重組，從而實(shí)現(xiàn)基因的替換。利用該方法Yang等通過(guò)構(gòu)建自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)進(jìn)E. coli SMlO中，然后與產(chǎn)酸克雷伯氏菌M5al接合，進(jìn)而敲出了產(chǎn)酸克雷伯氏菌 M5al 乳酸脫氣酶基因(IdhA) [Yang G, et al. , Fermentation of I, 3propanediol by alactate deficient mutant of Klebsiella oxytoca under microaerobic conditions.Applied microbiology and biotechnology，2007，73 (5) :P. 1017-1024]。Xu 等通過(guò)自殺質(zhì)粒敲除了克雷伯氏肺炎桿菌HR526的乳酸脫氫酶基因[Xu Y.Z.，et al. , Metabolismin 1，3-propanediol fed—batch fermentation by a D-Iactate deficient mutantof Klebsiella pneumoniae. Biotechnology and bioengineering, 2009，104(5):P.965-972]。另外，Horng等利用自殺質(zhì)粒通過(guò)同源重組成功將克雷伯氏肺炎桿菌合成1，3-丙二醇途徑 dhaD 和 dhaK 兩個(gè)基因進(jìn)行了 失活[Horng, Y. T.，et al.，Inactivationof dhaD and dhaK abolishes by-product accumulation duringl，3-propanediolproduction in Klebsiella pneumoniae. Journal of Industrial Microbiology andBiotechnology,2010. 37:P. 1-10]0線性DNA重組是利用電擊轉(zhuǎn)化的方法將線性DNA轉(zhuǎn)入克雷伯氏肺炎桿菌，使得位于線性DNA上的同源序列與染色體上的目的序列發(fā)生重組，實(shí)現(xiàn)重組替換。Seo等將抗性標(biāo)記兩端帶有500bp的同源臂的線性DNA片段轉(zhuǎn)入到克雷伯氏肺炎桿菌Cu中，利用細(xì)胞本身具有的重組功能，成功將菌株的甘油脫氫酶基因和1，3-丙二醇氧化還原酶基因進(jìn)行了敲除[Seo, M. Y. , et al. , Elimination of by-product formation during production ofI, 3-propanediol in Klebsiella pneumoniae by inactivation of glycerol oxidativepathway. Applied microbiology and biotechnology, 2009. 84 (3) :P. 527-534]。郝健等發(fā)明了一種利用Red重組酶輔助的用于克雷伯氏肺炎桿菌的基因重組方法，在大腸桿菌中利用攜帶短同源臂的線性DNA與質(zhì)粒進(jìn)行重組制備·具有長(zhǎng)同源臂的線性DNA，將長(zhǎng)同源臂的DNA轉(zhuǎn)入克雷伯氏肺炎桿菌，利用質(zhì)粒pDK6-red表達(dá)Red重組酶的，成功的將克雷伯肺炎桿菌中編碼二羥基丙酮激酶的基因進(jìn)行了敲除[郝健等，克雷伯氏肺炎桿菌的基因重組方法，中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?201110435825 ;Wei D. , et al. , Red recombinase assisted genereplacement in klebsiella pneumoniae. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2012. 39:P. 1219-1226]。但對(duì)于克雷伯氏肺炎桿菌基因重組，已有的技術(shù)都采用較長(zhǎng)的同源臂，需要將目的基因克隆出來(lái)用于構(gòu)建長(zhǎng)同源臂，需要更加簡(jiǎn)單、方便的方法，促進(jìn)研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種利用短同源序列進(jìn)行克雷伯氏肺炎桿菌基因重組的方法。該方法不需要克隆目的基因，同源臂直接設(shè)計(jì)在PCR引物上，簡(jiǎn)單、快捷，且能進(jìn)行多次基因操作，具有廣泛的應(yīng)用前景。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的利用短同源序列進(jìn)行克雷伯氏肺炎桿菌基因重組的方法，包括以下步驟I) PCR擴(kuò)增抗性基因片段，其中在引物上添加目的重組基因的同源序列，具體如下以攜帶第一抗性基因(抗性標(biāo)記)的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得第一抗性基因片段；其中，PCR擴(kuò)增引物的5’端設(shè)計(jì)成與需要進(jìn)行重組的基因序列同源的序列，同源序列長(zhǎng)度在39-50堿基范圍，PCR擴(kuò)增引物的3’端設(shè)計(jì)成與需要擴(kuò)增的抗性基因兩側(cè)同源的序列，使擴(kuò)增獲得的線性DNA中間為第一抗性基因，第一抗性基因的兩側(cè)連接有用于進(jìn)行基因重組的短的同源序列；所述擴(kuò)增抗性基因的引物設(shè)計(jì)方法以及攜帶抗性基因的質(zhì)粒特征見(jiàn)[Gust
B., et al. , PCR-targeting system in streptomyces coelicolor A3(2). John InnesCentre:Norwich, 2002]詳細(xì)描述。2)將擴(kuò)增的第一抗性基因片段與克隆質(zhì)粒連接后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，經(jīng)篩選，得到陽(yáng)性克隆質(zhì)粒；3) PCR制備用于基因重組的DNA片段以步驟2)的克隆質(zhì)粒上的克隆位點(diǎn)上下游序列作為保護(hù)序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，并以步驟2)得到的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到用于敲除目的基因的同源重組DNA片段；本步驟中，通過(guò)設(shè)計(jì)引物、PCR擴(kuò)增包含抗性基因、短同源臂以及相鄰的上下游序列；
其中，該同源重組DNA片段(線性DNA片段)中間為第一抗性基因，第一抗性基因兩側(cè)是短同源臂，短同源臂兩側(cè)是來(lái)源于克隆質(zhì)粒上的序列，即第一抗性基因的兩側(cè)連接有用于基因敲除的短同源臂，短同源臂外側(cè)連接有來(lái)自克隆質(zhì)粒的序列作為保護(hù)序列；該短同源臂由步驟I)中的設(shè)計(jì)于引物上的短的同源序列形成。4)將步驟3)獲得的同源重組DNA片段，電擊轉(zhuǎn)化至含有pDK6-red質(zhì)粒的克雷伯氏肺炎桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)；5)將步驟4)的轉(zhuǎn)化后的克雷伯氏肺炎桿菌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，篩選獲得陽(yáng)性重組子，從而獲得基因重組的克雷伯氏肺炎桿菌細(xì)胞。所述利用短同源序列進(jìn)行克雷伯氏肺炎桿菌基因重組的方法，還可包括6)步驟5)獲得的基因重組的克雷伯氏肺炎桿菌細(xì)胞(重組子)，通過(guò)利用攜帶第N抗性基因的質(zhì)粒，可以重新按照步驟I) 5)進(jìn)行操作，制備同時(shí)攜帶第N抗性基因(其他抗性標(biāo)記)的同源重組DNA片段，以進(jìn)行第二次或多于兩次的基因重組操作。其中，攜帶第·N抗性基因的質(zhì)粒中，N是大于或等于2的整數(shù)，且第N抗性基因不同于第一抗性基因；該攜帶第N抗性基因的質(zhì)粒包括攜帶氯霉素抗性的質(zhì)粒、攜帶四環(huán)素抗性的質(zhì)粒、攜帶鏈霉素抗性的質(zhì)?；驍y帶安普霉素抗性的質(zhì)粒；即第N抗性基因包括氯霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因、鏈霉素抗性基因或安普霉素抗性基因。另外，本發(fā)明利用短同源序列進(jìn)行克雷伯氏肺炎桿菌基因重組的方法中，當(dāng)需要重組后將抗性基因消除時(shí)，可在步驟I)中加入如下步驟在抗性基因(抗性標(biāo)記)的兩端添加 FRT 序列 gaagttcctatactttcta gagaataggaacttc (如 SEQ ID NO. I 所不)。所述步驟I)中，攜帶第一抗性基因的質(zhì)粒包括攜帶安譜霉素抗性的質(zhì)粒(如攜帶安譜霉素抗性的PU773質(zhì)粒)，攜帶鏈霉素(壯觀霉素)抗性的質(zhì)粒，攜帶四環(huán)素抗性的質(zhì)粒，或攜帶氯霉素抗性的質(zhì)粒。步驟I)中，短的同源序列是指可以設(shè)計(jì)在PCR引物上的、與需要進(jìn)行重組的目的基因同源的序列，長(zhǎng)度在39到50堿基。所述步驟3)中，保護(hù)序列可以是任意的DNA序列，如長(zhǎng)度為200-2000堿基對(duì)的保護(hù)序列，其中優(yōu)選長(zhǎng)度為400-700堿基對(duì)的保護(hù)序列。所述步驟5)中的陽(yáng)性重組子，能通過(guò)卡那霉素篩選質(zhì)粒pDK6-red丟失的克雷伯氏肺炎桿菌的菌株，然后，轉(zhuǎn)進(jìn)pDK6-flp質(zhì)粒來(lái)消除插入染色體的兩端連接有FRT序列的抗性基因，獲得消除抗性標(biāo)記的菌株。其中，該消除抗性標(biāo)記的菌株，再通過(guò)卡那霉素篩選丟失質(zhì)粒pDK6-flp的菌株后,再轉(zhuǎn)進(jìn)質(zhì)粒pDK6-red后,可以按照上述步驟1)_6)重新進(jìn)行基因同源重組操作。上述pDK6_red質(zhì)粒和pDK6_flp質(zhì)粒是攜帶卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒，受乳糖操縱子調(diào)控，分別表達(dá)Red重組酶和Flp重組酶，見(jiàn)[Wei D. , et al. , Red recombinaseassisted gene replacement in klebsiella pneumoniae. Journal of IndustrialMicrobiology & Biotechnology, 2012. 39:P. 1219-1226]詳細(xì)描述。本發(fā)明通過(guò)兩輪PCR和一步克隆制備用于克雷伯氏肺炎桿菌同源重組的DNA片段，該片段攜帶短的同源臂，短同源臂外側(cè)添加保護(hù)序列的。短同源臂是直接設(shè)計(jì)到PCR引物上，通過(guò)引物合成而不用通過(guò)基因克隆獲得。將制備的線性DNA片段轉(zhuǎn)進(jìn)攜帶pDK6-red質(zhì)粒的克雷伯肺炎桿菌制作的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞中，在Red重組酶的幫助下，即可實(shí)現(xiàn)基因的重組替換。因此，本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)單、快速，能進(jìn)行多次基因重組操作等優(yōu)點(diǎn)，使克雷伯氏肺炎桿菌容易進(jìn)行基因的敲除以及在染色體上添加基因，改變出發(fā)菌株的性能。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中使用的核酸內(nèi)切酶、連接酶、一些基本質(zhì)粒、PCR試劑以及DNA片段回收等采用商業(yè)產(chǎn)品，具體操作按照說(shuō)明書進(jìn)行。其他未注明的實(shí)驗(yàn)操作按照常規(guī)分子操作方法進(jìn)行。本發(fā)明通過(guò)用于同源重組的線性DNA片段的同源臂只有39到50堿基對(duì)，同源臂兩側(cè)連接有保護(hù)序列，保護(hù)序列是任意的DNA序列。在Red重組酶的輔助下，將上述線性DNA片段轉(zhuǎn)化入克雷伯氏肺炎桿菌細(xì)胞，進(jìn)行基因重組，通過(guò)抗性篩選獲得重組子。具體的操作如下 克雷伯氏肺炎桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制作參照“J.莎姆布魯克著，黃培堂譯《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》科學(xué)出版社2005”中的所述大腸桿菌電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞制作方法制作，而區(qū)別在于當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)30min后加入終濃度為0. 7mmol/L的EDTA (乙二胺四乙酸)繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，直到0D600達(dá)到0.7時(shí)收集細(xì)胞制作感受態(tài)細(xì)胞。具體詳見(jiàn)[魏東，等.克雷伯氏肺炎桿菌電擊轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，中國(guó)釀造，2012. 31(4) :18-20]。攜帶pDK6_red質(zhì)粒的克雷伯氏肺炎桿菌菌株感受態(tài)細(xì)胞的制備與不攜帶pDK6-red質(zhì)粒的克雷伯氏肺炎桿菌菌株感受態(tài)制備相似，只是在細(xì)胞培養(yǎng)30min后不僅加A EDTA還要加入終濃度0. 8mmol/L的IPTG來(lái)誘導(dǎo)Red重組酶的表達(dá)。pDK6-red質(zhì)粒轉(zhuǎn)入克雷伯氏肺炎桿菌菌株取pDK6_red質(zhì)粒與克雷伯氏肺炎桿菌感受態(tài)細(xì)胞混合，使用2mm的電轉(zhuǎn)杯在2kV的電壓下電擊轉(zhuǎn)化，見(jiàn)[魏東,等.克雷伯氏肺炎桿菌電擊轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，中國(guó)釀造，2012. 31(4): 18-20]，利用卡那霉素抗性篩選，獲得攜帶pDK6-red質(zhì)粒的克雷伯氏肺炎桿菌菌株。而線性DNA電擊轉(zhuǎn)化攜帶pDK6_red質(zhì)粒的克雷伯氏肺炎桿菌與質(zhì)粒轉(zhuǎn)入克雷伯肺炎桿菌中的方法相同，轉(zhuǎn)化后用線性DNA片段上攜帶的抗性標(biāo)記進(jìn)行篩選，獲得線性DNA與基因組染色體發(fā)生替換的重組菌株。同源重組片段的制備分為兩輪PCR和一步克隆完成。第一輪PCR :參照文獻(xiàn)[Gust B. , et al. , PCR-targeting system instreptomyces coelicolor A3 (2). John Innes Centre:Norwich, 2002.]的描述設(shè)計(jì)引物，引物的5’端是短的同源序列，以攜帶抗性基因的質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增抗性基因，如果需要重組后消除抗性標(biāo)記，則待擴(kuò)增的抗性基因兩端需添加FRT序列?？寺⒌谝惠哖CR擴(kuò)增的片段通過(guò)TA克隆與克隆質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選陽(yáng)性重組子。第二輪PCR :在克隆位點(diǎn)上下游設(shè)計(jì)引物，以克隆篩選得到的陽(yáng)性重組子為模板，擴(kuò)增得到同源臂兩端分別添加保護(hù)序列的同源重組片段。利用電擊的方法將同源重組片段轉(zhuǎn)化入攜帶pDK6-red質(zhì)粒的克雷伯氏肺炎桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，利用抗性或其他標(biāo)記對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行篩選，挑出重組子。篩選得到的重組子可以進(jìn)行下一輪的基因重組操作重組子再次按照上述方法制備感受態(tài)細(xì)胞。選用攜帶其他抗性或選擇標(biāo)記的質(zhì)粒為模板，按照上述的方法制備敲除其他基因的同源重組片段。這樣就可以在同一株菌中進(jìn)行多次基因重組，得到一株具有多種選擇標(biāo)記的重組子。 下面再舉具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明方法予以說(shuō)明。實(shí)例I利用本發(fā)明的方法，在克雷伯氏肺炎桿菌GMCC1. 6366菌株(GMCC1. 6366菌株為中國(guó)普通微生物保藏中心保藏，具有氨芐青霉素抗性)中敲除依賴于ATP的二羥基丙酮激酶基因dhakl,具體步驟如下I) GMCCI. 6366感受態(tài)細(xì)胞的制備按照如上所述的具體實(shí)施方式
中的“克雷伯氏肺炎桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制作”進(jìn)行
操作。 2) pDK6-red 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 GMCC1. 6366 菌株取pDK6_red質(zhì)粒2 ii L，與制備好的100 U L GMCCI. 6366感受態(tài)細(xì)胞混合，設(shè)定電壓2000伏特，利用2mm電轉(zhuǎn)杯進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化操作。轉(zhuǎn)化后，細(xì)胞加入Iml的LB液體培養(yǎng)基37°C搖床，200轉(zhuǎn)/min復(fù)蘇I小時(shí)。然后，涂布在含有50mg/L卡那霉素的LB固體平板上，37 °C過(guò)夜培養(yǎng)，挑選長(zhǎng)出的菌落10個(gè)，提取質(zhì)粒，通過(guò)電泳進(jìn)行驗(yàn)證，10個(gè)菌落都正確，命名為 GMCC1. 6366-pDK6-red。3) GMCCI. 6366-pDK6_red 感受態(tài)細(xì)胞的制備與GMCC1. 6366感受態(tài)細(xì)胞制備方法相同，僅在細(xì)胞培養(yǎng)30min后添加IPTG(異丙基-3-D-硫代半乳糖苷)至終濃度0. 8mmol/L04)用于進(jìn)行染色體上dhakl基因重組的DNA片段制備。具體操作如下a.設(shè)計(jì)引物dhakl-FRT-sl和dhakl-FTR-al，引物的5’端是與目的基因同源的39或40bp的堿基，而3’端是含有與抗性盒同源的序列，序列分別為ATGTCTCAATTCTTTTTTAACCAGCGCGCCAGCCTCGT CATTCCGGGGATCCGTCGACC (如 SEQ ID NO. 2 所示)和 GGCGATGGTGGAGGCGCCAGGTTCGCCGTGGATGCCCATT TGTAGGCTGGAGCTGCTTC (如 SEQ ID NO. 3 所示)。其中，弓丨物dhakl-FRT-sl 的ATGTCTCAAITCmTTTAACCAGCGCGCCAGCCTCGT序列和引物dhakl-FTR-al的 GGCGATGGTGGAGGCGCCAGGITCGCCGTGGATGCCCAIT 序列與 dhakl 基因同源。利用引物dhakl-FRT-sl和dhakl-FTR-al，以質(zhì)粒pIJ773為模板，利用PCR擴(kuò)增出長(zhǎng)約I. 5kb的DNA片段A。該片段的兩端分別具有與dhakl上游和下游部分序列同源的同源臂，中間包含了來(lái)源于PIJ773的安普霉素抗性基因aac (3) IV，并且在aac (3) IV基因兩側(cè)具有FRT序列(如SEQ ID NO. I 所示)。b.回收上一步擴(kuò)增的抗性基因，按照寶生物工程有限公司的pMD18_t simple試劑盒的方法進(jìn)行連接。c.篩選陽(yáng)性克隆。將步驟b獲得的連接產(chǎn)物加入到制作好的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后，涂布在含氨芐青霉素的LB平板上過(guò)夜培養(yǎng)，氨芐青霉素用量為50mg/L。待平板上長(zhǎng)出單菌落后，挑取單菌落接種在氨芐青霉素的試管中培養(yǎng)，然后，提質(zhì)粒進(jìn)行電泳驗(yàn)證。提取的6個(gè)質(zhì)粒中有一個(gè)為假陽(yáng)性，其余5個(gè)均為陽(yáng)性克隆，得到的陽(yáng)性克隆命名為pMD18-t-kl。d.設(shè)計(jì)引物 pMD18t-s4 和 pMD18t_a4，序列分別為GACGGTGAAAACCTCTGACACATGC(如 SEQ ID NO. 4 所示)和 TGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTC (如 SEQ ID NO. 5 所示)。利用引物pMD18t-s4和pMD18t-a4，以質(zhì)粒pMD18_t_kl為模板進(jìn)行PCR，獲得2. 3kb的DNA片段，即同源重組片段。引物的位點(diǎn)分別位于TA克隆位點(diǎn)上下游各409bp處，因此擴(kuò)增得到的DNA片段兩端是來(lái)源于pMD18-t simple的409bp保護(hù)序列，與保護(hù)序列連接的是與dhakl同源的39或40bp的同源臂，同源臂的內(nèi)側(cè)連接的是FRT序列，而FRT序列之間的是aac (3) IV基因。5)上述獲得的同源重組DNA片段電擊轉(zhuǎn)化GMCC1. 6366-pDK6_red感受態(tài)細(xì)胞。取DNA片段2 ii L，與制備好的100 u L GMCCI. 6366-pDK6_red感受態(tài)細(xì)胞(菌體OD6tltl值30)混合，使用2mm電轉(zhuǎn)杯,設(shè)定電壓2kv進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后,加入Iml的LB液體培養(yǎng)基于37°C, 200轉(zhuǎn)/min搖床復(fù)蘇I小時(shí)。然后，涂布在添加有50mg/L的安普霉素的LB固體平 板，37 °C過(guò)夜培養(yǎng)。6)重組菌的驗(yàn)證。設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物dhakls和Yanzheng773z,序列分別為CCGATGCACTGCGGCTAT (如 SEQ ID NO. 6 所示)和 GCAAATACGGCATCAGTTACC (如 SEQ ID NO. 7所示)。其中，Yanzheng773z對(duì)應(yīng)安譜霉素抗性基因aac (3) IV中間的一段序列。利用引物dhakls和Yanzheng773z，以長(zhǎng)出的菌株總DNA為模板進(jìn)行PCR，產(chǎn)物DNA片段為700bp，而以出發(fā)菌株(CGMCC1. 6366)總DNA為模板進(jìn)行PCR無(wú)特異性條帶，表明獲得的重組菌為陽(yáng)性，命名為 GMCC1. 6366-pDK6-red-dhakl。通過(guò)以上過(guò)程獲得的GMCC1. 6366-pDK6-red-dhakl菌株，是克雷伯氏肺炎桿菌GMCC1. 6366染色體上依賴于ATP的二羥基丙酮激酶基因dhakl與制備的含有同源臂的線性DNA片段的發(fā)生同源重組，使得染色體上的dhakl基因部分序列被安普霉素抗性基因替換，實(shí)現(xiàn)了菌株染色體上dhakl基因的敲除。由于該菌株具有核酸外切酶的活性，所以在同源臂的5’端添加了 400bp左右的保護(hù)序列以供宿主消化，而宿主的消化能力有限，同源臂受到了保護(hù)。這樣即可以發(fā)生同源重組。本發(fā)明獲得的GMCC1. 6366-pDK6-red-dhakl菌株，由于該菌株染色體dhakl基因敲除失活，是研究依賴于ATP的二羥基丙酮激酶功能的材料。綜上所述，本發(fā)明主要通過(guò)1)利用PCR擴(kuò)增抗性基因DNA片段，其中在PCR引物上設(shè)計(jì)添加需要進(jìn)行重組的基因的同源序列，獲得兩端連接有目的重組基因短同源臂的抗性基因DNA片段；2)將擴(kuò)增的抗性基因片段連接到克隆質(zhì)粒，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，經(jīng)篩選，得到陽(yáng)性克隆質(zhì)粒；3)設(shè)計(jì)PCR引物，以步驟2)得到的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增包含抗性基因、短同源臂以及相鄰的上下游序列，得到用于敲除目的基因的同源重組DNA片段；4)將步驟3)獲得的同源重組DNA片段，電擊轉(zhuǎn)化至含有pDK6red質(zhì)粒的克雷伯氏肺炎桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)抗性篩選獲得陽(yáng)性重組子。該方法不需要將目的重組基因克隆，簡(jiǎn)單、快捷，且能進(jìn)行多次基因操作。因此，具有廣泛的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.一種利用短同源序列進(jìn)行克雷伯氏肺炎桿菌基因重組的方法，其特征在于，包括以下步驟 O以攜帶第一抗性基因的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得第一抗性基因片段； 其中，PCR擴(kuò)增引物的5’端設(shè)計(jì)成與需要進(jìn)行重組的基因序列同源的序列，PCR擴(kuò)增引物的3’端設(shè)計(jì)成與需要擴(kuò)增的抗性基因兩側(cè)同源的序列，使擴(kuò)增獲得的DNA中間為第一抗性基因，第一抗性基因的兩側(cè)連接有用于進(jìn)行基因重組的短的同源序列； 2)將擴(kuò)增的第一抗性基因片段與克隆質(zhì)粒連接后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，經(jīng)篩選，得到陽(yáng)性克隆質(zhì)粒； 3)以步驟2)的克隆質(zhì)粒上的克隆位點(diǎn)上下游序列作為保護(hù)序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，并以步驟2)得到的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到用于敲除目的基因的同源重組DNA片段，該同源重組DNA片段中間為抗性基因，抗性基因兩側(cè)是短同源臂，短同源臂兩側(cè)是來(lái)源于克隆質(zhì)粒上的序列； 4)將步驟3)獲得的同源重組DNA片段，電擊轉(zhuǎn)化至含有pDK6-red質(zhì)粒的克雷伯氏肺炎桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)； 5)將步驟4)的轉(zhuǎn)化后的克雷伯氏肺炎桿菌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，抗性篩選獲得陽(yáng)性重組子，從而獲得基因重組的克雷伯氏肺炎桿菌細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟I)中，攜帶第一抗性基因的質(zhì)粒包括攜帶安譜霉素抗性的質(zhì)粒，攜帶鏈霉素抗性的質(zhì)粒，攜帶四環(huán)素抗性的質(zhì)粒，或攜帶氯霉素抗性的質(zhì)粒。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟I)中，短的同源序列是指設(shè)計(jì)在PCR引物上的、與需要進(jìn)行重組的目的基因同源的序列，長(zhǎng)度在39到50堿基。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟3)中，保護(hù)序列是任意的DNA序列。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述保護(hù)序列是長(zhǎng)度為200-2000堿基對(duì)的保護(hù)序列。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述保護(hù)序列是長(zhǎng)度為400-700堿基對(duì)的保護(hù)序列。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于還包括步驟5)獲得的基因重組的克雷伯氏肺炎桿菌細(xì)胞，通過(guò)利用攜帶第N抗性基因的質(zhì)粒，重新按照步驟I) 5)進(jìn)行操作，制備同時(shí)攜帶第N抗性基因的同源重組DNA片段，以進(jìn)行第二次或多于兩次的基因重組操作； 其中，攜帶第N抗性基因的質(zhì)粒中，N是大于或等于2的整數(shù)，且第N抗性基因不同于第一抗性基因；該攜帶第N抗性基因的質(zhì)粒包括攜帶氯霉素抗性的質(zhì)粒、攜帶四環(huán)素抗性的質(zhì)粒、攜帶鏈霉素抗性的質(zhì)?；驍y帶安普霉素抗性的質(zhì)粒。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述利用短同源序列進(jìn)行克雷伯氏肺炎桿菌基因重組的方法中，當(dāng)需要重組后將抗性基因消除時(shí)，在步驟I)中加入如下步驟 在抗性基因的兩端添加如SEQ ID NO. I所示的FRT序列。
9.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟5)中的陽(yáng)性重組子，能通過(guò)卡那霉素篩選質(zhì)粒pDK6-red丟失的克雷伯氏肺炎桿菌的菌株，然后，轉(zhuǎn)進(jìn)pDK6-flp質(zhì)粒來(lái)消除插入染色體的兩端連接FRT序列的抗性基因，獲得消除抗性標(biāo)記的菌株；其中 ，該消除抗性標(biāo)記的菌株，再通過(guò)卡那霉素篩選丟失質(zhì)粒pDK6-flp的菌株后，再轉(zhuǎn)進(jìn)質(zhì)粒pDK6-red后，能按照如權(quán)利要求I所述的方法，重新進(jìn)行基因同源重組操作。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用短同源序列進(jìn)行克雷伯氏肺炎桿菌基因重組的方法，包括1)PCR擴(kuò)增抗性基因片段，其中在引物上添加目的重組基因的同源序列；2)抗性基因片段與克隆質(zhì)粒連接后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，經(jīng)篩選得到克隆質(zhì)粒；3)以步驟2)得到的克隆質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增包含抗性基因、短同源臂以及相鄰的上下游序列，得到用于敲除目的基因的同源重組DNA片段；4)將同源重組DNA片段電擊轉(zhuǎn)化至含有pDK6-red質(zhì)粒的克雷伯氏肺炎桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)；5)轉(zhuǎn)化后的克雷伯氏肺炎桿菌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，篩選獲得陽(yáng)性重組子。該方法不需要將目的重組基因克隆，簡(jiǎn)單、快捷，且能進(jìn)行多次基因操作，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102952793SQ20121038854
公開(kāi)日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2012年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月12日
發(fā)明者郝健, 魏東, 柳鵬福, 史吉平, 姜標(biāo) 申請(qǐng)人:上海中科高等研究院