專利名稱：南美白對(duì)蝦傳染性肌肉壞死病的檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種南美白對(duì)蝦傳染性肌肉壞死病的檢測(cè)方法及試劑盒。該檢測(cè)方法為實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。
背景技術(shù)：
近年動(dòng)物世界衛(wèi)生組織(OIE)報(bào)道了一種新發(fā)現(xiàn)的主要感染南美白對(duì)蝦的嚴(yán)重病毒，初步定名為傳染性肌肉壞死病毒(Infectious Myonecrosis Virus, IMNV),該病發(fā)現(xiàn)于南美，目前已證實(shí)傳入亞洲，并列入了亞太地區(qū)水生動(dòng)物監(jiān)測(cè)季度報(bào)告(QAAD)的病害監(jiān)測(cè)名錄，OIE將該病列入OIE的重點(diǎn)水生動(dòng)物疫病名錄。2002年巴西初次發(fā)生傳染性肌肉壞死病，主要危害南美白對(duì)蝦。引起該病的病原體為雙鏈RNA病毒簡(jiǎn)稱IMNV，為一個(gè)全新的病毒。中華人民共和國農(nóng)業(yè)部2008年12月11日發(fā)布的第1125號(hào)公告，將傳染性肌肉壞死病新增為二類動(dòng)物疫病，為甲殼類感染的六種二類動(dòng)物疫病之一。MNV能使6克左 右南美白對(duì)蝦發(fā)生高達(dá)50%的致死率。本病2004年僅在巴西就造成超過I億美元的經(jīng)濟(jì)損失。2006年已經(jīng)傳到亞洲的印度尼西亞。我國海南、福建、汕頭等地也有報(bào)道，但尚未證實(shí)。由于我國的南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖面積大，并且在養(yǎng)殖過程中苗本和親本的大規(guī)模國際、跨區(qū)域移動(dòng)現(xiàn)象十分普遍，因此，該病傳入我國并擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)很大，應(yīng)引起各級(jí)政府及廣大對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)者的高度重視。美國、印度尼西亞和我國臺(tái)灣等地的學(xué)者已經(jīng)進(jìn)行了該病毒的初步的流行病學(xué)研究，并在GenBank中發(fā)布了兩條全序列。美國亞利桑那大學(xué)(UniversityofArizona)水產(chǎn)病害實(shí)驗(yàn)室為研究該病毒國際上最權(quán)威的實(shí)驗(yàn)室之一，已經(jīng)嘗試建立該病毒的PCR鑒定方法。但在國內(nèi)除了朱澤聞和趙文武2007年提出“南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖應(yīng)警惕傳染性肌肉壞死病毒”，聞冬春2009年綜述了 “對(duì)蝦傳染性肌肉壞死病的研究進(jìn)展”外，再無其他的文獻(xiàn)報(bào)道。OIE雖然發(fā)布有該病毒的熒光PCR檢測(cè)方法，但從作者的工作實(shí)踐結(jié)果來看，其敏感性不高，擴(kuò)增效果不好，因此有必要重新設(shè)計(jì)一個(gè)快速、準(zhǔn)確的新的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足之處，提供一種南美白對(duì)蝦傳染性肌肉壞死病的檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法速度快且準(zhǔn)確率高。本發(fā)明的另一目的在于提供實(shí)現(xiàn)所述檢測(cè)方法的試劑盒。本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種南美白對(duì)蝦傳染性肌肉壞死病的檢測(cè)方法，包含以下步驟(I)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR所需要的引物和探針如下所示，方向5’ 一 3’，探針標(biāo)記熒光基團(tuán)為FAM、淬滅基團(tuán)TAMRA 正向引物CPI-603 GGGAGTAGATATAAATGTTCAG ；反向引物CPI-732 CAACCACCCAAATTCATA ；探針PCPI-712 :FAM-CACCTGCTACCACTTCTTCTCTT_TAMRA。(2)檢測(cè)以南美白對(duì)蝦肌肉組織為材料提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ；以cDNA為模板，在熒光PCR反應(yīng)體系中加入步驟⑴設(shè)計(jì)的引物和探針，設(shè)定實(shí)時(shí)熒光PCR儀反應(yīng)程序，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，從而檢測(cè)出所檢測(cè)的南美白對(duì)蝦是否為傳染性肌肉壞死病毒陽性；步驟⑵中所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系優(yōu)選為每25 μ L反應(yīng)體系中IOXTaq DNA 聚合酶 buffer (含 Mg2+) 2. 5 μ I、IOmM dNTPl μ L、Taq DNA 聚合酶 0.5 μ L、正向引物CPI-603、反向引物CPI-732以及探針PCPI-712 ;正向引物CPI-603和反向引物CPI-732的終濃度分別為O. I μ mol/L、探針PCPI-712的終濃度為O. 06 μ mo I/L ；步驟(2)中所述的實(shí)時(shí)熒光PCR的條件優(yōu)選為48°C 5min ；95°C 5min ；95°C 15s，60°C 15s, 40 個(gè)循環(huán)；實(shí)現(xiàn)上述南美白對(duì)蝦傳染性肌肉壞死病核酸檢測(cè)方法的試劑盒，包含正向引物、反向引物和熒光標(biāo)記探針，其中引物和探針如下正向引物CPI-603 :5' -GGGAGTAGATATAAATGTTCAG-3'；反向引物CPI-732 :5' -CAACCACCCAAATTCATA-3'；·探針PCPI-712 :5' -FAM-CACCTGCTACCACTTCTTCTCTT-TAMRA-3'；所述的試劑盒還包含RT-PCR緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)酶混合物、DEPC處理水。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果本發(fā)明為南美白對(duì)蝦傳染性肌肉壞死病毒提供一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法和試劑盒。本發(fā)明通過引物和探針的設(shè)計(jì)與篩選，得到特異性強(qiáng)、分辨率高的一組引物和探針，所建立的體系可重復(fù)性高，經(jīng)多次試驗(yàn)穩(wěn)定性好。其檢測(cè)結(jié)果與其他檢測(cè)技術(shù)相比，特異性強(qiáng)、靈敏度高，具有更大的可靠性和適應(yīng)性，提高了檢測(cè)效率，從而為南美白對(duì)蝦傳染性肌肉壞死病毒提供更有為效的檢測(cè)手段。


圖I是分別用三組引物和探針對(duì)pGMT-CPI進(jìn)行RT-PCR的結(jié)果圖；其中I是使用本發(fā)明所提供的引物和探針組得到的擴(kuò)增曲線；2是使用對(duì)照B組引物和探針得到的擴(kuò)增曲線；3是使用對(duì)照C組引物和探針得到的擴(kuò)增曲線。圖2是對(duì)三組引物和探針特異性檢測(cè)的結(jié)果圖；其中，I是本發(fā)明所提供的引物和探針對(duì)pGMT-CPI進(jìn)行RT-PCR得到的擴(kuò)增曲線；2是對(duì)照B組引物和探針對(duì)pGMT-CPI進(jìn)行RT-PCR得到的擴(kuò)增曲線；3是對(duì)照C組引物和探針對(duì)pGMT-CPI進(jìn)行RT-PCR得到的擴(kuò)增曲線；4為使用三組不同的引物和探針對(duì)不同的模板WSSVDNA, IHHNVDNA和水?dāng)U增得到的9條曲線基本重合在一起得到。圖3是本發(fā)明所提供的引物和探針對(duì)pGMT-CPI進(jìn)行RT-PCR得到的擴(kuò)增曲線，其中1是以150ng的pGET-CPI為模板的擴(kuò)增曲線；2是以15ng的pGET-CPI為模板的擴(kuò)增曲線；3是以I. 5ng的pGET-CPI為模板的擴(kuò)增曲線；4是以O(shè). 15ng的pGET-CPI為模板的擴(kuò)增曲線；5是以O(shè). 015ng的pGET-CPI為模板的擴(kuò)增曲線；6是以O(shè). 0015ng的pGET-CPI為模板的擴(kuò)增曲線-J是以O(shè). 00015ng的pGET-CPI為模板的擴(kuò)增曲線；8是以O(shè). 000015ng的PGET-CPI為模板的擴(kuò)增曲線；9為陰性對(duì)照。圖4是對(duì)照B組引物和探針對(duì)pGMT-CPI進(jìn)行RT-PCR得到的擴(kuò)增曲線，其中1是以150ng的pGET-CPI為模板的擴(kuò)增曲線；2是以15ng的pGET-CPI為模板的擴(kuò)增曲線；3是以I. 5ng的pGET-CPI為模板的擴(kuò)增曲線；4是以O(shè). 15ng的pGET-CPI為模板的擴(kuò)增曲線；5是以O(shè). 015ng的pGET-CPI為模板的擴(kuò)增曲線；6是以O(shè). 0015ng的pGET-CPI為模板的擴(kuò)增曲線；7是以O(shè). 00015ng的pGET-CPI為模板的擴(kuò)增曲線；8是陰性對(duì)照。圖5是對(duì)照C組引物和探針對(duì)pGMT-CPI進(jìn)行RT-PCR得到的擴(kuò)增曲線，其中1是以150ng的pGET-CPI為模板的擴(kuò)增曲線；2是以15ng的pGET-CPI為模板的擴(kuò)增曲線；3是以I. 5ng的pGET-CPI為模板的擴(kuò)增曲線；4是以O(shè). 15ng的pGET-CPI為模板的擴(kuò)增曲線；5是以O(shè). 015ng的pGET-CPI為模板的擴(kuò)增曲線；6是以O(shè). 0015ng的pGET-CPI為模板的擴(kuò)增曲線是以O(shè). 00015ng的pGET-CPI為模板的擴(kuò)增曲線；8是以O(shè). 000015ng的pGET-CPI為模板的擴(kuò)增曲線；9為陰性對(duì)照。圖6是本發(fā)明所提供的引物和探針組與OIE方法引物和探針組對(duì)cDNA擴(kuò)增的區(qū)別圖；其中1為本發(fā)明提供的引物和探針，以pGET-CPI為模板的陽性對(duì)照；2為本發(fā)明提供的引物和探針，以頂NV cDNA為模板；3為OIE方法引物和探針，以MNV cDNA為模板；4為本發(fā)明提供的引物和探針，以H20為模板的陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例I(I)根據(jù) Areerat Kunanopparat 等(Journal of Virological Methods, 2010,171(1) :141-148)文獻(xiàn)方法，委托大連寶生物技術(shù)有限公司合成CP-I的擴(kuò)增引物，以魯東大學(xué)生命科學(xué)院聞冬春博士饋贈(zèng)的傳染性肌肉壞死病毒(InfectiousMyonecrosis Virus)IMNV cDNA (IMNV cDNA 已在文獻(xiàn) “Borsa Μ.等，Detection of infectious myonecrosisvirus in penaeid shrimps using immunoassays usefulnessof monoclonal antibodiesdirected to the viral maj or capsid protein. Arch Virol,published2010-09_23，，中公開)為模板，經(jīng)PCR (反應(yīng)體系為10倍PCR緩沖液5 μ 1，IOmM dNTPs2 μ 1，20 μ M正反引物(正向引物5’ -GCTGCAAAAGAGGGTGCTCG-3’ ；反向引物5’ -TTGCATTGAACTCCACGAAAAC-3’ )各1μ 1，Taq聚合酶O. 5 μ 1，cDNA2y 1，用ddH20補(bǔ)足50 μ I。反應(yīng)條件為94°C 3分鐘；940C 15秒，550C 30秒，72°C I分鐘34個(gè)循環(huán)；72°C延伸5分鐘，10°C保溫。擴(kuò)增獲得CP-I全長(zhǎng)，將CP-I全長(zhǎng)克隆到質(zhì)粒pGMT(天根生化科技(北京有限公司)，編號(hào)為VT202-02)，得到重組載體pGMT-CPI。CP-I全長(zhǎng)克隆序列如下GCTGCAAAAGAGGGTGCTCGAACATTGGCAATGTATGTTTTAATGTTTGCAGAATGGCCATTTGGTATGTATACAAAAACTAAACAAACAACAGACAATGCTGGTAATAACCAATCAGATCAAATTTTCATTCACTCCGAATCTACTGTACATATTCCAGGACAAAAACAAATGCATATTGTGCTGCCAAGAAAAGTGAACATGGTGAACCCCACTACAATTGCAGAAGCAAATGCACGTGTAGTAATTCAACCAACATACGGTACAGTGGCAGCTGGGGCAGGTGTCGCAAATGGTAATATTAACGTAGCTGCTGTTGGTGTGGCCCTGCCAACTGTAAATTTGACTGACTATCTTGTATCCTGGGCAACCGATTTCACACTTGGCGACATAAAACAATTGGTTGAAAGAATGAAAACAACACTGCCAATTAGTCGAGACTTGATGGCAGCACGTCAAAATGCTATGTTATTAAGTACTCTATTTCCTCCACTAATTCAGAGCAATGTGGCTTCAGACACAAAGGAAGTCCCAGGAACAGCTGGAGCATACACTGCATGTCTTGCAAACTTAGGTATTCCTGAAACACTAACAGTTAACTGGGGAGTAGATATAAATGTTCAGCCATTGTATCAGCTACTTGAAACGGACATCACAGCCCACAATCGGTACGTATTAAACCTGTTCAAAAGAGAAGAAGTGGTAGCAGGTGCATATGAATTTGGGTGGTTGGGACACATGGCCAGTTATATGATGGGACTCCTTCTAACAATGAATATATCATCAGTGTTTAACGTTTGGTATTCAACAAGACGTATTTCAACAAAGGCGTGGGACACGGCATATGATAGTAACATCCAAGCATATCAGGACATGCATTACCAAATGTTTTCGTGGAGTTCAATGCAA。(2)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR所需要的三組引物和探針，如下所示，方向均為5，一 3，本發(fā)明所提供的引物對(duì)及探針正向引物CPI-603 GGGAGTAGATATAAATGTTCAG ；反向引物CPI-732 CAACCACCCAAATTCATA ；探針PCPI-712 FAM-CACCTGCTACCACTTCTTCTCTT-TAMRA ；對(duì)照B組引物和探針正向引物CPI-490 CCACTAATTCAGAGCAAT ； 反向引物CPI-642 AAGTAGCTGATACAATGG ；探針PCPI-567 FAM-AAACTTAGGTATTCCTGAAACACTA-TAMRA ；對(duì)照C組引物和探針正向引物 CPI-490 CCACTAATTCAGAGCAAT ；反向引物CPI-642 AAGTAGCTGATACAATGG ；探針PCPI-596 :FAM-TTAACTGGGGAGTAGATATAAATGT_TAMRA ；(3)對(duì)引物和探針有效性的熒光PCR檢測(cè)以pGMT-CPI質(zhì)粒為模板，分別加入上述設(shè)計(jì)的3對(duì)引物和探針，配制成25 μ T反應(yīng)體系，含有 IOXTaq DNAbuffer (含 Mg2+) 2. 5 μ IUOmMdNTPl μ l、Taq DNA 聚合酶(TAKARA公司)0. 5 μ L，模板DNA為150ng，正、反向引物終濃度分別為O. I μ mol/L、探針的終濃度為
O.06ymol/L，用雙蒸水將體積調(diào)整為25 μ L。PCR的反應(yīng)條件為48°C 5min ；95°C 5min ；95°C 15s，60。。15s，40 個(gè)循環(huán)。三組引物和探針都能分別對(duì)pGMT-CPI質(zhì)粒進(jìn)行有效擴(kuò)增，如圖I所示，但在完全相同的反應(yīng)條件下，本發(fā)明所提供的引物和探針組的擴(kuò)增有效性最好，說明該組引物和探針在對(duì)CPI特異性擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度、Tm值、匹配特異性及有效性等因素上都是最優(yōu)化的。實(shí)施例2三組引物探針特異性的熒光PCR檢測(cè)分別以pGMT-CPI質(zhì)粒、WSSV (對(duì)蝦白斑綜合癥病毒)DNA、IHHNV (對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病)DNA為模板(對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(WSSVDNA和IHHNV DNA在文獻(xiàn)“楊冰等，對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV) PCR檢測(cè)方法的建立.海洋水產(chǎn)研究，2005,26(2) :1_5”公開)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組，陰性對(duì)照中模板用雙蒸水替代。分別加入上述設(shè)計(jì)的3對(duì)引物和探針，配制成25 μ L反應(yīng)體系，共有12組。其中，每25 μ L反應(yīng)體系含有10Xbuffer (含Mg2+) 2. 5 μ I、dNTPl μ I、Taq DNA聚合酶O. 5 μ L，正、反向引物終濃度分別為O. I μ mol/L、探針的終濃度為O. 06 μ mol/L,模板DNA為150ng，用雙蒸水將體積調(diào)整為 25yL。PCR 的反應(yīng)條件為48°C 5min ；95°C 5min ；95°C 15s，60°C 15s，40 個(gè)循環(huán)。如圖2所示，三對(duì)引物探針均只能對(duì)以pGMT-CPI質(zhì)粒為模板時(shí)進(jìn)行有效擴(kuò)增，對(duì)其他蝦病毒沒有有效性擴(kuò)增，且仍然為本發(fā)明推薦組引物和探針效果最好，說明該組引物和探針對(duì)南美白對(duì)蝦傳染性肌肉壞死病毒核酸的熒光PCR檢測(cè)具有特異性。實(shí)施例3三對(duì)引物探針敏感性的熒光PCR檢測(cè)
(I)以CPI-603、CPI-732為引物，PCPI-712為探針，以不同濃度的pGMT-CPI質(zhì)粒為模板的擴(kuò)增曲線。配制成25 μ L反應(yīng)體系，含有10Xbuffer (含Mg2+) 2. 5 μ l、dNTPl μ I、Taq DNA聚合酶O. 5 μ L，引物終濃度分別為O. I μ mol/L、探針的終濃度為O. 06 μ mol/L，用雙蒸水將體積調(diào)整為25 μ L。PCR的反應(yīng)條件為48°C 5min ；95°C 5min ；95°C 15s，60°C 15s，40個(gè)循環(huán)。如圖3所示，CPI-603、CPI-732、PCPI-712的引物探針組，對(duì)從低達(dá)O. 000015ng至高達(dá)150ng的病毒核酸均有有效性擴(kuò)增，能定量反映模板的濃度梯度，其檢測(cè)靈敏度非常高。鑒于對(duì)O. 000015ng的病毒核酸檢測(cè)時(shí)Ct值已接近35，(更低稀釋度的模板DNA在溶液中不穩(wěn)定，容易產(chǎn)生不穩(wěn)定的擴(kuò)增信號(hào)，)因此不建議使用濃度低于此值的核酸作為模板。(2)以CPI-490、CPI-642、PCPI-567為引物探針組，以不同濃度的pGMT-CPI質(zhì)粒為模板的擴(kuò)增曲線。配制成25 μ L反應(yīng)體系，含有10Xbuffer (含Mg2+) 2. 5 μ l、dNTPl μ I、Taq DNA聚合酶O. 5 μ L，引物終濃度分別為O. I μ mol/L、探針的終濃度為O. 06 μ mol/L，用雙蒸水將體積調(diào)整為25 μ L。PCR的反應(yīng)條件為48°C 5min ；95°C 5min ；95°C 15s，60°C 15s，40個(gè)循環(huán)。 如圖4所示，CPI-490、CPI-642, PCPI-567引物探針組，對(duì)CPI標(biāo)準(zhǔn)分子有有效擴(kuò)±曾，但相比較與本發(fā)明推薦引物探針組，僅能對(duì)高濃度模板擴(kuò)增效果明顯，檢測(cè)低限至少要高一個(gè)數(shù)量級(jí)，在模板濃度O. 00015ng時(shí)擴(kuò)增信號(hào)已不穩(wěn)定。(3)以CPI-490、CPI-642、PCPI-596為引物探針組，以不同濃度的pGMT-CPI質(zhì)粒為模板的擴(kuò)增曲線。配制成25 μ L反應(yīng)體系，含有10Xbuffer (含Mg2+) 2. 5 μ l、dNTPl μ I、Taq DNA聚合酶O. 5 μ L，引物終濃度分別為O. I μ mol/L、探針的終濃度為0. 06 μ mol/L，用雙蒸水將體積調(diào)整為25 μ L。PCR的反應(yīng)條件為48°C 5min ；95°C 5min ；95°C 15s，60°C 15s，40個(gè)循環(huán)。如圖5所示，CPI-490、CPI-642、PCPI-596引物探針組，僅能對(duì)高濃度CPI模板進(jìn)行有效擴(kuò)增，但模板濃度梯度反應(yīng)的定量檢測(cè)效果不好。對(duì)從低達(dá)0. 000015ng至高達(dá)150ng的病毒核酸均有有效性擴(kuò)增，其敏感性非常強(qiáng)，鑒于對(duì)0. 000015ng的病毒核酸檢測(cè)時(shí)ct值超過30接近35，不建議用過低的濃度低于此值的核酸作為模板。(4)分別以CPI-603、CPI-732和PCPI-712引物探針組，及OIE提供的引物探針(引物 MNV412F :5’-GGACCTATCATACATAGCGTTTGCA-3’ ；引物 MNV545R :5’-AACCCATATCTATTGTCGCTGGAT-3’ ；探針 MNVpl : 5 ’-FAM-CCACCTTTACTTTCAATACTACATCATCCCCGG-TAMRA-3’)配制成 25 μ L 反應(yīng)體系，含有 10 Xbuffer (含 Mg2+) 2. 5 μ UdNTPl μ l、TaqDNA聚合酶0. 5 μ L，引物終濃度分別為0. I μ mol/L、探針的終濃度為0. 06 μ mol/L,模板為75ng，用雙蒸水將體積調(diào)整為25 μ L。PCR的反應(yīng)條件為48°C 5min ；95°C 5min ；95°C 15s，60°C 15s,40 個(gè)循環(huán)。如圖6所示，本發(fā)明所提供的引物和探針組與OIE方法引物和探針組對(duì)cDNA擴(kuò)增的區(qū)別；本方法推薦的引物和探針與OIE方法引物和探針，在反應(yīng)體系一致、模板濃度一致、反應(yīng)條件一致的情況下，本發(fā)明所提供的引物探針比OIE推薦的引物探針的反應(yīng)循環(huán)數(shù)明顯低。檢測(cè)實(shí)例取去殼的新鮮南美白對(duì)奸奸肉(中山市阜沙鎮(zhèn)永健養(yǎng)殖場(chǎng)采集)IOOmg,用天根病毒檢測(cè)用提取試劑盒(離心柱型SD101)提取病毒RNA，用天根QuantcDNA第一鏈合成試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以pGMT-CPI為模板作為陽性對(duì)照，以雙蒸去離子水為模板作為陰性對(duì)照，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板為檢測(cè)反應(yīng)，加入實(shí)施例I中的引物對(duì)及探針，配制成25 μ L反應(yīng)體系，含有10Xbuffer (含Mg2+) 2. 5 μ I、dNTPl μ I, Taq DNA聚合酶
O.5 μ L，引物終濃度分別為O. I μ mol/L、探針的終濃度為O. 06 μ mol/L，用雙蒸水將體積調(diào)整為 25 μ L。PCR 的反應(yīng)條件為48°C 5min ;95°C 5min ;95°C 15s，60°C 15s，40 個(gè)循環(huán)。陽性對(duì)照呈明顯擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照在35個(gè)Ct值下無明顯擴(kuò)增為體系反應(yīng)正常；如果檢測(cè)反應(yīng)在35Ct值以下有明顯擴(kuò)增曲線，則判斷為陽性，在35Ct值以下無明顯擴(kuò)增曲線，則判斷為陰性。由于該病在國內(nèi)尚沒有爆發(fā)案例發(fā)生，因此采用添加陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的方式，驗(yàn)證其檢測(cè)的有效性。試驗(yàn)實(shí)施中添加標(biāo)準(zhǔn)分子DNA低達(dá)O. 0015ng，Ct值為25左右。實(shí)驗(yàn)中共提取了 30組對(duì)蝦樣品總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后，其中18個(gè)樣品的cDNA模板添加了陽性對(duì)照質(zhì)粒，12個(gè)沒有添加，結(jié)果18個(gè)添加樣品的陽性擴(kuò)增率為100%。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的·限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種南美白對(duì)蝦傳染性肌肉壞死病的檢測(cè)方法，其特征在于包含以下步驟 (1)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR所需要的引物和探針如下所示，方向5’一 3’ 正向引物 CPI-603 GGGAGTAGATATAAATGTTCAG ；反向引物 CPI-732 CAACCACCCAAATTCATA ；探針 PCPI-712 FAM-CACCTGCTACCACTTCTTCTCTT-TAMRA ； (2)檢測(cè)以南美白對(duì)蝦肌肉組織為材料提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA；以cDNA為模板，在熒光PCR反應(yīng)體系中加入步驟⑴設(shè)計(jì)的引物和探針，設(shè)定實(shí)時(shí)熒光PCR儀反應(yīng)程序，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，從而檢測(cè)出所檢測(cè)的南美白對(duì)蝦是否為傳染性肌肉壞死病毒陽性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的南美白對(duì)蝦傳染性肌肉壞死病的檢測(cè)方法，其特征在于步驟(2)中所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系為每25 μ L反應(yīng)體系中含有10倍濃度的含鎂離子的TaqDNA聚合酶緩沖液2. 5 μ l、10mM dNTPly I、TaqDNA聚合酶O. 5 μ L、正向引物CPI-603、反向引物CPI-732以及探針PCPI-712 ;正向引物CPI-603和反向引物CPI-732的終濃度分別為O. I μ mol/L、探針PCPI-712的終濃度為O. 06 μ mol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的南美白對(duì)蝦傳染性肌肉壞死病的檢測(cè)方法，其特征在于步驟(2)中所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的條件為48°C 5min ；95°C 5min ；95°C 15s，60°C 15s，40個(gè)循環(huán)。
4.實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求I 3任一項(xiàng)所述的南美白對(duì)蝦傳染性肌肉壞死病核酸的檢測(cè)方法的試劑盒，其特征在于包含正向引物、反向引物和熒光標(biāo)記探針，其中引物和探針如下 正向引物 CPI-603 5' -GGGAGTAGATATAAATGTTCAG-3'； 反向引物 CPI-732 5' -CAACCACCCAAATTCATA-3'；探針 PCPI-712 :5' -FAM-CACCTGCTACCACTTCTTCTCTT-TAMRA-3'。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒還包含RT-PCR緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)酶混合物和DEPC處理水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種南美白對(duì)蝦傳染性肌肉壞死病的檢測(cè)方法及試劑盒。本發(fā)明以南美白對(duì)蝦肌肉組織的cDNA為模板，在熒光PCR反應(yīng)體系中加入引物和探針，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，能夠有效檢測(cè)南美白對(duì)蝦是否被傳染性肌肉壞死病毒感染；引物對(duì)為5′-GGGAGTAGATATAAATGTTCAG-3′和5′-CAACCACCCAAATTCATA-3′；探針為5′-FAM-CACCTGCTACCACTTCTTCTCTT-TAMRA-3′。實(shí)現(xiàn)該方法的試劑盒主要包含該引物對(duì)和探針。本發(fā)明提供的方法和試劑盒準(zhǔn)確、快速，其檢測(cè)結(jié)果與其他檢測(cè)技術(shù)相比，特異性好，檢測(cè)靈敏度高，具有更大的可靠性和適應(yīng)性，提高了檢測(cè)效率，從而為南美白對(duì)蝦傳染性肌肉壞死病毒提供更有為效的檢測(cè)手段。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102888468SQ20121038412
公開日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2012年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月11日
發(fā)明者岳巧云, 邱德義, 蔡先全, 王一飛, 閆冬春, 胡佳, 劉國雄, 汪小東, 魏曉雅, 劉德星 申請(qǐng)人:中華人民共和國中山出入境檢驗(yàn)檢疫局