專利名稱：超級(jí)細(xì)菌ndm和kpc基因雙重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及熒光定量PCR技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及檢測(cè)超級(jí)細(xì)菌耐藥基因的雙重?zé)晒舛縋CR技術(shù)及其試劑盒。
背景技術(shù)：
碳青霉烯是有著廣譜抗菌活性的一類β -內(nèi)酰胺類抗生素，常作為治療高產(chǎn)Ampc和超廣譜的β_內(nèi)酰胺酶的革蘭陰性桿菌引起的感染的最有效的藥物。但隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛使用，細(xì)菌也逐漸獲得對(duì)此類藥物的耐藥性。近年來(lái)，耐碳青霉烯的非發(fā)酵菌已成為醫(yī)院感染的嚴(yán)重問(wèn)題，而且耐碳青霉烯的腸桿菌細(xì)菌的報(bào)道也越來(lái)越多，這種耐碳青霉烯的革蘭陰性桿菌的快速傳播和流行正日益成為令人擔(dān)憂的全球性問(wèn)題。細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥主要原因是產(chǎn)生碳青霉烯酶，其包括Ambler 分子分類的Α、B、D三類酶。其中A類中的新增成員KPC (Klebsiella PneumoniaeCarbapenemase)和 B 類中新增成員 NDM (New Delhi metallo-β-lactamase),因其能夠水解除頭霉素類以外幾乎所有的β_內(nèi)酰胺類抗菌藥物而引起了世界各國(guó)抗感染專家和臨床微生物工作者的極大關(guān)注。攜帶有NDM或KPC基因的細(xì)菌也被稱為“超級(jí)細(xì)菌”。特別是攜帶有NDM的“超級(jí)細(xì)菌”目前僅對(duì)替加環(huán)素和黏菌素敏感，但是前者具有毒副作用，后者只能用于治療部分種類的細(xì)菌感染，一般不適合大規(guī)模使用而且對(duì)黏菌素耐藥的多重耐藥菌株目前已有報(bào)道。由NDM或KPC型的“超級(jí)細(xì)菌’感染造成的暴發(fā)流行，往往使治療陷入無(wú)藥可用的境地，給臨床抗感染治療帶來(lái)極大挑戰(zhàn)。因此及時(shí)檢測(cè)NDM和KPC基因，對(duì)細(xì)菌耐藥表型進(jìn)行監(jiān)測(cè)，控制和杜絕超級(jí)細(xì)菌的爆發(fā)流行顯得至關(guān)重要。目前主要利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)攜帶NDM或KPC基因的超級(jí)細(xì)菌，PCR的方法更是被譽(yù)為檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但普通PCR容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，甚至?xí)驗(yàn)椴僮鞯脑虺霈F(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性，而且普通PCR的結(jié)果判斷需要對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，操作不夠簡(jiǎn)化。目前尚缺乏一種靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)便，且能對(duì)同時(shí)對(duì)KPC和NDM基因進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種超級(jí)細(xì)菌NDM和KPC基因雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是
一種超級(jí)細(xì)菌的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法，包括以下步驟
(1)提取待檢樣本的DNA|旲板；
(2)對(duì)DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物和探針序列如下
NDM 基因上游引物 NDM-F :TTGGCGATCTGGTTTTCC (SEQ ID NO. I),
NDM 基因下游引物 NDM-R :GGTTGATCTCCTGCTTGA (SEQ ID NO. 2),NDM 基因的探針 NDM-probe :TGGCAGCACACTTCCTATCTCG (SEQ ID NO. 3),
KPC 基因上游引物 KPC-F :CGCAACTGTAAGTTACCG (SEQ ID NO. 4),
KPC 基因下游引物 KPC-R :CATGCCTGTTGTCAGATA (SEQ ID NO. 5),
KPC 基因的探針 KPC-probe :CCACTGTGCAGCTCA TTCAAGG (SEQ ID NO. 6)；
所用探針標(biāo)記的熒光基團(tuán)互不相同；
(3)結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)束，根據(jù)待測(cè)樣本的Ct值判斷其是否為NDM、KPC基因陽(yáng)性。上述雙重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增體系為10μ I的Premix Ex Taq (Probe qPCR)(2X)，10Mmol/L 的 NDM 和 KPC 上下游上下游引物各 O. 4μ1，5Mmol/L 的 NDM-probe 和KPC-probe 各 O. 2μ1，ROX Reference Dye II 0· 4μ1，待檢 DNA 模板或陽(yáng)性對(duì)照 DNA 或陰性對(duì)照 μ ，加滅菌去離子水補(bǔ)足體積至20μ1。上述雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性20s ;然后95°C 3s，60°C 30s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。上述探針標(biāo)記熒光為J0E-ECLIPSE和FAM-ECLIPSE。所用熒光定量PCR儀為美國(guó)ABI 7500 FAST。一種超級(jí)細(xì)菌的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒，包括如下成分Premix Ex Taq(Probe qPCR) (2X)、引物、探針、ROX Reference Dye II、陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品，其中引物和探針序列分別為
NDM 基因上游引物 NDM-F :TTGGCGATCTGGTTTTCC (SEQ ID NO. I),
NDM 基因下游引物 NDM-R :GGTTGATCTCCTGCTTGA (SEQ ID NO. 2),
NDM 基因的探針 NDM-probe :TGGCAGCACACTTCCTATCTCG (SEQ ID NO. 3),
KPC 基因上游引物 KPC-F :CGCAACTGTAAGTTACCG (SEQ ID NO. 4),
KPC 基因下游引物 KPC-R :CATGCCTGTTGTCAGATA (SEQ ID NO. 5),
KPC 基因的探針 KPC-probe :CCACTGTGCAGCTCATTCAAGG (SEQ ID NO. 6)；
所用探針標(biāo)記的熒光基團(tuán)互不相同。上述陽(yáng)性對(duì)照品為NDM和KPC基因陽(yáng)性的DNA標(biāo)本混合物，陰性對(duì)照品為滅菌去離子水。本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明方法能在同一體系同時(shí)完成KPC和NDM兩個(gè)基因的檢測(cè)，較單重?zé)晒舛縋CR更加高效、省時(shí)省力。本方法特異性好、重復(fù)性佳、靈敏性高，且可以利用已建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣本進(jìn)行定量分析。


圖I為特異性實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增曲線 圖2為敏感性實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增曲線 圖3為重復(fù)性試驗(yàn)擴(kuò)增曲線 圖4為標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖5為臨床標(biāo)本擴(kuò)增曲線圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例I
超級(jí)細(xì)菌NDM和KPC基因雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法的引物和Taqman探針的設(shè)計(jì)與合成
(I)引物和探針的設(shè)計(jì)方法
在GeneBank上下載NDM和KPC基因所有亞型的序列，到目前為止NDM共六個(gè)亞型NDM-I，NDM-2, NDM-3，NDM-4，NDM-5，NDM-6 對(duì)應(yīng)的 GeneBank 序列號(hào)分別是 AB614355，JF703135，JQ734687，JQ348841，JN104597, JN967644 ;KPC 共 11 個(gè)亞型分別為 KPC-2，KPC-3，KPC-4, KPC-5, KPC-6, KPC-7，KPC-8，KPC-9，KPC-10, KPC-II, KPC-12, GeneBank 序列號(hào)依次是 AY034847，AF395881, FJ473382, EU400222, EU555534, EU729727, FJ234412, FJ624872,GQ140348，HM066995，HQ641421。利用 Beacon Designer 7 軟件分別針對(duì) NDM 和 KPC 基因各亞型間保守的區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，使引物或探針與模板的結(jié)合點(diǎn)避開(kāi)突變區(qū)域。設(shè)計(jì)好的引物和探針通過(guò)01igo6. 44、DNAstar、Primer Premier5. 0等多種軟件進(jìn)行評(píng)估，且所有 引物在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(www. ncbi.nlm.nih. gov)上BLAST均未見(jiàn)除目的基因外的其他同源序列。(2)引物和探針序列
NDM 基因上游引物 NDM-F :TTGGCGATCTGGTTTTCC (SEQ ID NO. I),
NDM 基因下游引物 NDM-R :GGTTGATCTCCTGCTTGA (SEQ ID NO. 2),
NDM 基因的探針 NDM-probe JOE-TGGCAGCACACTTCCTATCTCG- ECLIPSE (SEQ ID NO. 3),KPC 基因上游引物 KPC-F :CGCAACTGTAAGTTACCG (SEQ ID NO. 4),
KPC 基因下游引物 KPC-R :CATGCCTGTTGTCAGATA (SEQ ID NO. 5),
KPC 基因的探針 KPC-probe :CCACTGTGCAGCTCATTCAAGG (SEQ ID NO. 6)；
所用探針標(biāo)記的熒光基團(tuán)互不相同；
(3)引物和Taqman探針均由大連Takara生物公司合成并進(jìn)行突光標(biāo)記。實(shí)施例2 Cl)菌株
選取南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院微生物室臨床分離的耐碳青霉烯的腸桿菌科細(xì)菌和耐碳青霉烯的非發(fā)酵菌中的不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌，同一病人多次分離的菌株若屬種相同則只留取一株，共166株，其中大腸埃希菌I株、陰溝腸桿菌I株、肺炎克雷伯菌9株、產(chǎn)酸克雷伯菌I株、鮑曼不動(dòng)桿菌73株和84株銅綠假單胞菌。臨床分離的菌株利用BDPhoenixlOO全自動(dòng)微生物分析儀分析系統(tǒng)及其配套細(xì)菌鑒定卡進(jìn)行菌種鑒定和藥敏試驗(yàn)，頭孢哌酮/舒巴坦和米諾環(huán)素藥敏試驗(yàn)采用K-B法，藥敏紙片購(gòu)自英國(guó)0X0ID公司。NDM和KPC基因的陽(yáng)性對(duì)照株(編號(hào)分別是856和432)為本發(fā)明人常規(guī)PCR法檢測(cè)并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證的陽(yáng)性標(biāo)本，GeneBank序列號(hào)分別為JN711113和JF431928。陰性株為大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC70060和金黃色葡萄球菌ATCC25923。(2)試劑和儀器
常規(guī)PCR反應(yīng)試劑和熒光定量PCR反應(yīng)試劑及細(xì)菌DNA提取試劑盒均購(gòu)自寶生物工程Takara大連有限公司。質(zhì)粒DNA提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司。Thermo公司核酸分析儀。Bio-Rad GeldocXR凝膠成像儀。德國(guó)eppendorf公司的Mastercycler梯度PCR儀。美國(guó)ABI 7500 FAST熒光定量PCR儀。DNA測(cè)序服務(wù)由北京六合華大基因公司提供。(3)擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件
①雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件
擴(kuò)增反應(yīng)在AB17500 FAST熒光定量PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系為20μ1 =Premix Ex Taq(Probe qPCR) (2 X) 10μ1 ; 10Mmol/L 的 NDM 和 KPC 上下游引物各 O. 4μ1 ;5Mmol/L 的NDM-probe 和 KPC-probe 各 O. 2μ1 ；R0X Reference Dye II 0. 4μ1 ;待檢 DNA 模板或陽(yáng)性對(duì)照DNA或陰性對(duì)照 μ ，加滅菌去離子水補(bǔ)足20μ1體積。反應(yīng)條件95°C預(yù)變性20s ；95°C變性3s，60°C退火并延伸30s，40個(gè)循環(huán)。②普通PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件
NDM和KPC兩基因普通PCR反應(yīng)在德國(guó)印pendorf公司的Mastercycler梯度PCR儀上進(jìn)行。所用引物序列如下
Endm-F CACCTCATGTTTGAATTCGCC (SEQ ID NO. 7)；
Endm-R CTCTGTCACATCGAAATCGC (SEQ ID NO. 8)；
Ekpc-F ATGTCACTGTATCGCCGTCT (SEQ ID NO. 9)；
Ekpc-R TTTTCAGAGCCTTACTGCCC (SEQ ID NO. 10)；
擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μ1 含Mg2+的10 X buffer 2 μ I，dNTP終濃度為200 μ mol/L,10 μ mol/L的上下游引物各為0. 8 μ 1，DNA模板I μ 1，TaqDNA聚合酶I U，加入滅菌去離子水至20 μ I。反應(yīng)條件95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，57°C退火40s并72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)。取5μ1擴(kuò)增產(chǎn)物與 μ 6 X Loading buffer上樣緩沖液混勻,在1%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳緩沖液為0. 5 X TBE,電壓為5V/cm，電泳20分鐘。通過(guò)Bio-Rad GeldocXR凝膠成像儀自動(dòng)讀取電泳結(jié)果。(4)實(shí)驗(yàn)步驟 ①質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建
利用本發(fā)明人已建立的NDM和KPC常規(guī)PCR擴(kuò)增法對(duì)測(cè)序確認(rèn)的陽(yáng)性DNA標(biāo)本分別進(jìn)行NDM和KPC擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)目的條帶有擴(kuò)增，分別將NDM和KPC基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體上，挑取陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化至DH5a大腸桿菌中，增殖后提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行序列測(cè)定以鑒定插入序列，并測(cè)定質(zhì)粒DNA濃度以進(jìn)行拷貝數(shù)的換
笪
ο②模板DNA的提取
按照 TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver. 3· O 的說(shuō)明利用此試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA。通過(guò)Thermo公司核酸分析儀測(cè)定0D260 / 0D280值以確定DNA濃度。③敏感性
分別將構(gòu)建的NDM和KPC質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，使起始濃度均為IO8拷貝數(shù)/μ 終濃度均為10拷貝數(shù)/μι (IO8、107、IO6、105、IO4、103、IO2、10)。以上述一系列稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，按照上述反應(yīng)體系進(jìn)行多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，在同一體系內(nèi)同時(shí)擴(kuò)增NDM和KPC基因，并以稀釋倍數(shù)的log值為橫坐標(biāo)，擴(kuò)增的Ct值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)曲線參數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。④特異性對(duì)NDM和KPC基因均陰性的標(biāo)準(zhǔn)株大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC70060和金黃色葡萄球菌ATCC25923進(jìn)行雙重PCR體系特異性性實(shí)驗(yàn)。并將NDM (編號(hào)為856)和KPC (編號(hào)為432)基因陽(yáng)性的DNA標(biāo)本等比例混合后取混合的DNA樣本作為陽(yáng)性對(duì)照品，以滅菌去離子水空白作為陰性對(duì)照同時(shí)進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。⑤重復(fù)性
以濃度為IO5拷貝/μ 的NDM和KPC質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品I: I混合作為模板重復(fù)8次，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算變異系數(shù)(CV)。⑥檢測(cè)臨床分離菌株
對(duì)臨床分離的166株耐碳青霉烯革蘭陰性桿菌提取基因組DNA后，利用已經(jīng)建立的雙重?zé)晒舛縋CR法進(jìn)行KPC和NDM基因檢測(cè)，通過(guò)NDM和KPC普通PCR檢測(cè)法和測(cè)序技術(shù)·對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證并且陽(yáng)性標(biāo)本經(jīng)測(cè)序可進(jìn)一步確定其基因亞型。(4)結(jié)果 ①特異性
NDM和KPC等比例混合的陽(yáng)性對(duì)照DNA標(biāo)本按照已建立的反應(yīng)體系擴(kuò)增后可見(jiàn)兩條S型曲線即NDM的擴(kuò)增曲線和KPC的擴(kuò)增曲線，指數(shù)期明顯，且基線無(wú)上揚(yáng)現(xiàn)象。大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC70060和金黃色葡萄球菌ATCC25923均無(wú)擴(kuò)增，見(jiàn)圖I。此結(jié)果表明本發(fā)明建立的雙重?zé)晒舛縋CR法有良好的特異性。②敏感性
在同一擴(kuò)增體系中同時(shí)加入10倍梯度稀釋的NDM和KPC質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，起始濃度均為IO8拷貝數(shù)/μ ，終濃度均為10拷貝數(shù)/μι ( ο8、 ο7、 ο6、 ο5、 ο4、 ο3、io2、10)。結(jié)果顯示ndm和KPC —系列稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品均有良好的S型擴(kuò)增曲線，基線無(wú)上揚(yáng)現(xiàn)象，指數(shù)期明顯，并且有較好的平行性，見(jiàn)圖2。說(shuō)明NDM和KPC基因均能至少檢測(cè)到10個(gè)拷貝數(shù)的質(zhì)粒，表明該方法敏感性高。③重復(fù)性
以IO5拷貝/μ 的I: I混合的NDM和KPC質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，重復(fù)做8次試驗(yàn)，計(jì)算各重復(fù)樣品反應(yīng)Ct值之間的變異系數(shù)，擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖3。NDM的結(jié)果為I. 8%,KPC的結(jié)果為
0.5%。對(duì)于檢測(cè)方法來(lái)說(shuō)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果的變異系數(shù)CV值〈5%即可以認(rèn)為該方法的重復(fù)性良好。從本實(shí)施例的結(jié)果CV值〈5%，因此該方法具有較好的重復(fù)性。④標(biāo)準(zhǔn)曲線
為了準(zhǔn)確定量未知的待檢模板的濃度，利用模板濃度和陽(yáng)性擴(kuò)增的Ct值之間的相關(guān)關(guān)系，建立的NDM和KPC基因擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖4，NDM基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Υ=_3. 273X log (X)+40. 357，KPC 基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線為 Y=-2. 997 X log (X)+34. 248，其中 Y 為 Ct 值，X為拷貝數(shù)，R2分別為O. 971和O. 992，擴(kuò)增效率分別是102. 066%和115. 615%。上述結(jié)果表明本發(fā)明建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系較好，能夠通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知濃度的樣本進(jìn)行定量。⑤臨床分離菌株檢測(cè)
對(duì)臨床分離的166株耐碳青霉烯革蘭陰性桿菌基因組DNA為模板分別進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)和雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)，雙重?zé)晒舛縋CR法檢測(cè)結(jié)果9株肺炎克雷伯菌檢出KPC基因；1株產(chǎn)酸克雷伯菌NDM陽(yáng)性，I株陰溝腸桿菌NDM陽(yáng)性，不動(dòng)桿菌中有兩株NDM陽(yáng)性；其余標(biāo)本KPC和NDM均陰性，未見(jiàn)同時(shí)攜帶有兩個(gè)基因的標(biāo)本，擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖5。這與常規(guī)PCR法檢測(cè)結(jié)果完全一致。NDM和KPC陽(yáng)性PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示，4株NDM陽(yáng)性菌株均攜帶NDM-I基因，9株KPC陽(yáng)性的菌株均攜帶KPC-2基因，此外兩株NDM陽(yáng)性的不動(dòng)桿菌進(jìn)一步經(jīng)16S-23S rRNA測(cè)序驗(yàn)證分別為不動(dòng)3和13TU種，其余攜帶KPC和NDM的陽(yáng)性菌株經(jīng)16srRNA測(cè)序技術(shù)菌種鑒定結(jié)果與BD PhoenixlOO全自動(dòng)微生物分析儀鑒定結(jié)果一致。本發(fā)明建立的雙重?zé)晒舛縋CR法，對(duì)于NDM基因，其引物和Taqman探針均針對(duì)所有亞型保守區(qū)設(shè)計(jì)，可檢測(cè)到所有NDM亞型，同樣地KPC基因也可以檢測(cè)到所有的亞型。本發(fā)明已經(jīng)檢出的陽(yáng)性標(biāo)本經(jīng)測(cè)序分析，KPC基因均為KPC-2，NDM基因均為NDM-1，兩基因檢測(cè)出的亞型都是我國(guó)乃至全球最為常見(jiàn)的類型。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，本方法特異性好、重復(fù)性佳、靈敏性高，至少能檢測(cè)到10個(gè)拷貝數(shù)的質(zhì)粒。質(zhì)?？截悢?shù)和擴(kuò)增Ct值之間相關(guān)性較好，可利用已建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板濃度進(jìn)行定量。 總之本發(fā)明建立的基于Taqman探針的雙重?zé)晒舛縋CR法同時(shí)針對(duì)NDM和KPC基因能在同一體系同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)基因，可準(zhǔn)確快速地進(jìn)行NDM和KPC基因的篩選，有效防止NDM和KPC型的超級(jí)細(xì)菌傳播導(dǎo)致的暴發(fā)流行，較已報(bào)道的相應(yīng)單重?zé)晒舛縋CR法提高了診斷的敏感性，更高效、快捷、省時(shí)省力。另外，本發(fā)明建立的方法意在全面檢出所有類型的NDM和KPC基因，大大提高了檢測(cè)效率，若需精確分型可結(jié)合DNA測(cè)序技術(shù)。
權(quán)利要求
1.一種超級(jí)細(xì)菌的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法，其特征在于所述方法包括以下步驟 (I)提取待檢樣本的DNA |旲板； (2 )對(duì)DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物和探針序列如下 NDM 基因上游引物 NDM-F :TTGGCGATCTGGTTTTCC (SEQ ID NO. I), NDM 基因下游引物 NDM-R :GGTTGATCTCCTGCTTGA (SEQ ID NO. 2),NDM 基因的探針 NDM-probe :TGGCAGCACACTTCCTATCTCG (SEQ ID NO. 3), KPC 基因上游引物 KPC-F :CGCAACTGTAAGTTACCG (SEQ ID NO. 4), KPC 基因下游引物 KPC-R :CATGCCTGTTGTCAGATA (SEQ ID NO. 5),KPC 基因的探針 KPC-probe :CCACTGTGCAGCTCATTCAAGG (SEQ ID NO. 6)； 所用探針標(biāo)記的熒光基團(tuán)互不相同； (3)結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)束，根據(jù)待測(cè)樣本的Ct值判斷其是否為NDM、KPC基因陽(yáng)性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種超級(jí)細(xì)菌的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法，其特征在于所述雙重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增體系為10 μ I的Premix Ex Taq (Probe qPCR) (2X)，10Mmol/L 的 NDM 和 KPC 上下游上下游引物各 O. 4μ1，5Mmol/L 的 NDM-probe 和 KPC-probe 各O.2μ1, ROX Reference Dye II 0. 4μ1，待檢DNA模板或陽(yáng)性對(duì)照DNA或陰性對(duì)照 μ ，加滅菌去離子水補(bǔ)足體積至20μ1。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種超級(jí)細(xì)菌的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法，其特征在于所述雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性20s ;然后95°C 3s, 60°C 30s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種超級(jí)細(xì)菌的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法，其特征在于所述探針標(biāo)記熒光為J0E-ECLIPSE和FAM-ECLIPSE。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種超級(jí)細(xì)菌的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法，其特征在于所用熒光定量PCR儀為美國(guó)ABI 7500 FAST。
6.一種超級(jí)細(xì)菌的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒，包括如下成分Premix Ex Taq(Probe qPCR) (2X)、引物、探針、ROX Reference Dye II、陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品，其中引物和探針序列分別為 NDM 基因上游引物 NDM-F :TTGGCGATCTGGTTTTCC (SEQ ID NO. I), NDM 基因下游引物 NDM-R :GGTTGATCTCCTGCTTGA (SEQ ID NO. 2),NDM 基因的探針 NDM-probe :TGGCAGCACACTTCCTATCTCG (SEQ ID NO. 3), KPC 基因上游引物 KPC-F :CGCAACTGTAAGTTACCG (SEQ ID NO. 4), KPC 基因下游引物 KPC-R :CATGCCTGTTGTCAGATA (SEQ ID NO. 5),KPC 基因的探針 KPC-probe :CCACTGTGCAGCTCATTCAAGG (SEQ ID NO. 6)； 所用探針標(biāo)記的熒光基團(tuán)互不相同。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種超級(jí)細(xì)菌的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述陽(yáng)性對(duì)照品為NDM和KPC基因陽(yáng)性的DNA標(biāo)本混合物，陰性對(duì)照品為滅菌去離子水。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種超級(jí)細(xì)菌NDM和KPC基因雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法及其試劑盒，利用特異性設(shè)計(jì)的引物和探針，優(yōu)化擴(kuò)增體系和條件，能在同一體系同時(shí)完成KPC和NDM兩個(gè)基因的檢測(cè)，較單重?zé)晒舛縋CR更加高效、省時(shí)省力，本方法特異性好、重復(fù)性佳、靈敏性高，且可以利用已建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣本進(jìn)行定量分析。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102899414SQ20121038309
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月10日
發(fā)明者芮勇宇, 鄭芬, 孫靜靜, 王前 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)