專利名稱：融合串聯(lián)抗菌肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗菌肽及其制備方法。
背景技術(shù)：
抗菌肽是生物體在免疫病原體刺激下，免疫防御系統(tǒng)產(chǎn)生的ー類具有生物學(xué)活性的小分子多肽，是動(dòng)植物非特異免疫系統(tǒng)的重要成分，廣泛分布于細(xì)菌、真菌、高等植物、昆蟲、兩棲類、哺乳動(dòng)物以及人類體內(nèi)?？咕木哂锌咕⒖共《?、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用。和抗生素相比，抗菌肽具有分子質(zhì)量小、抗菌譜廣、水溶性好、耐熱性強(qiáng)、無免疫原性和作用機(jī)制獨(dú)特等優(yōu)點(diǎn)，不易引起微生物的耐藥性，被認(rèn)為是一種極具應(yīng)用潛力的健康安全的抗菌物。
Fowlicidin-2是在雞體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的ー種新型陽離子抗菌肽，由31個(gè)氨基酸殘基組成，具有廣譜的抗菌活性，具有脂多糖(LPS)結(jié)合活性及免疫調(diào)節(jié)功能。與多數(shù)抗菌肽不同的是Fowlicidin-2具有很強(qiáng)的鹽離子耐受性，抗菌活性不受生理鹽濃度的影響，甚至在NaCl濃度為150mmol/L時(shí)，仍然保持著抗菌活性，對(duì)抗性菌株仍然有很強(qiáng)的抑制作用，這意味著Fowlicidin-2在抗感染治療應(yīng)用上有著很大的潛力。天蠶素B(CecropinR)是由Boman從天蠶體內(nèi)分離得到的殺菌活性多肽，由37個(gè)氨基酸殘基組成，其N端堿性很強(qiáng)，形成雙親a -螺旋結(jié)構(gòu)，具有廣譜的抗菌作用，具有較好的熱穩(wěn)定性，能選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞，對(duì)正常的哺乳動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞無不良影響。CecropinA(1-8)-Melittin (1-18)是由天蠶素A的1_8位氨基酸殘基和蜂毒素的1-18位氨基酸殘基組成的雜合分子，氨基端為天蠶素部分，羧基端為蜂毒素部分，此雜合分子具有較2個(gè)單獨(dú)親本更廣的抗菌譜，同時(shí)去除了蜂毒素的溶血作用，拓寬了的抗菌譜。除抗菌能力外，還具有殺傷癌變細(xì)胞和包被的病毒、促進(jìn)傷ロ愈合等功能。死亡素(Thanatin),又稱死亡肽，是在昆蟲斑腹刺益蜷(Podisus maculiventris)中發(fā)現(xiàn)的，是近來發(fā)現(xiàn)的抗菌譜最廣的抗菌肽之一。由21個(gè)氨基酸殘基組成，結(jié)構(gòu)簡單，對(duì)G+、G_和某些真菌都有抑制作用，但是對(duì)酵母影響不大，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞也不表現(xiàn)出溶血性?？咕牡闹苽渲饕猩锊牧咸崛》?、化學(xué)合成法和基因工程表達(dá)法三種。由于抗菌肽在生物組織中含量低、分離困難，除少數(shù)幾種昆蟲抗菌肽外，提取法制得的樣品難以滿足應(yīng)用需要，僅適用于氨基酸序列分析和初歩的抗菌試驗(yàn)?；瘜W(xué)合成法分為液相合成法、固相合成法、片段合成法等等，都需要用到大量的化學(xué)制劑，存在成本高、エ藝繁瑣的缺陷。采用基因工程的方法重組表達(dá)抗菌肽是目前比較理想的抗菌肽生產(chǎn)手段，但是由于抗菌肽分子量太小，在表達(dá)過程中的翻譯和轉(zhuǎn)錄時(shí)容易酶解，出現(xiàn)表達(dá)量低或者很難表達(dá)的問題。而且與傳統(tǒng)抗生素相比，抗菌妝的抗菌活性尚待進(jìn)一步提尚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決現(xiàn)有抗菌肽合成方法中產(chǎn)量低，生產(chǎn)成本高；特別是采用基因工程重組表達(dá)抗菌肽過程中抗菌肽分子容易被酶解，導(dǎo)致表達(dá)量低或者很難表達(dá)的問題，而提出的融合串聯(lián)抗菌肽及其制備方法。融合串聯(lián)抗菌妝由Fowlicidin-2、天香素 B、CecropinA(1-8)-Melittin(1-18)和死亡素四種抗菌肽串聯(lián)而成，F(xiàn)owlicidin-2、天蠶素B、Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)與死亡素之間用GlySerGly聯(lián)接。本發(fā)明融合串聯(lián)抗菌肽由124個(gè)氨基酸組成，根據(jù)Fowlicidin-2、天蠶素B、CecropinA(1-8)-Melittin (1-18)與死亡素聯(lián)接順序的不同共有24種組合。融合串聯(lián)抗菌肽按以下步驟制備一、融合串聯(lián)抗菌肽由四種原始小分子抗菌肽串聯(lián)而成，四種原始小分子抗菌肽之間用GlySerGly聯(lián)接，再根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性設(shè)計(jì)融合串聯(lián)抗菌肽的cDNA片段；然后在融合串聯(lián)抗菌肽cDNA片段5’端加入Kex2裂解位點(diǎn)的三個(gè)密碼子，在融合串聯(lián)抗菌肽cDNA片段3’端加入終止密碼子TAA，再在5’和3’端分別引入Xho I和Xbal I粘性末端，連接PUC59，構(gòu)建了克隆質(zhì)粒pUC57-TM ；ニ、用Xho I和Xbal I雙酶切PUC57-TM，獲得融合串聯(lián)抗菌肽的編碼基因片段，與pPICZ a C連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5 a，PCR和測(cè)序進(jìn)ー步鑒定，構(gòu)建重組表達(dá)載體pPICZa C-TM ；三、將重組表達(dá)載體pPICZ a C-TM經(jīng)Sac I線性化后，電轉(zhuǎn)入畢赤酵母SMD1168中，用100 u g/mL濃度的Zeocin (博萊霉素)和PCR法篩選獲得高拷貝的重組酵母轉(zhuǎn)化子；四、將重組酵母轉(zhuǎn)化子的單菌落接種于酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD)中，在30°C、280r/min的條件下培養(yǎng)16 17h，然后取培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到BMGY培養(yǎng)基中，在30°C、300r/min條件下培養(yǎng)到OD值為2 6，收集菌體轉(zhuǎn)接于BMMY培養(yǎng)基中，在30°C、300r/min、1%甲醇的條件下誘導(dǎo)72h，在誘導(dǎo)過程中每隔24h補(bǔ)加甲醇保持終濃度為0. 5% 1% ;誘導(dǎo)后離心收集上清液，蛋白純化系統(tǒng)純化獲得融合串聯(lián)抗菌肽；
步驟一中四種原始小分子抗菌肽為Fowlicidin-2、天蠶素B、CecropinA(I-8)—Melittin(I-18)和死亡素。本發(fā)明采用畢赤酵母作為表達(dá)外源蛋白的宿主菌，畢赤酵母具有營養(yǎng)要求低，易于培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)。畢赤酵母存在酵母氧化酶A0X1，為外源基因啟動(dòng)子，受甲醇誘導(dǎo)，嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)。在表達(dá)過程中畢赤酵母自身分泌到培養(yǎng)基中的蛋白較少，簡化了后期蛋白的分離與純化。本發(fā)明利用酵母表達(dá)系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了融合串聯(lián)抗菌肽的重組制備。本發(fā)明步驟一中Kex2裂解位點(diǎn)的三個(gè)密碼子所編碼的氨基酸序列為GluLysArg，三個(gè)密碼子的堿基序列為GAGAAGAGA。本發(fā)明步驟一中根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性設(shè)計(jì)Fowlicidin-2的基因序列為 CTAGTTCAAAGGGGACGTTTTGGAAGATTTCTGAGAAAGATCCGAAGATTCAGACCAAAGGTTACAATCACTATTCAAGGTAGTGCTCGATTC根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性設(shè)計(jì)天蠶素B的基因序列為AAATGGAAAGITITTAAGAAGATTGAGAAAATGGGCAGGAACATTCGTAACGGAATCGTGAAGGCTGGGCCCGCAATTGCTGTGCTGGGTGAAGCTAAAGCCAIATTATCA ;根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性設(shè)計(jì) CecropinA(1-8)-Melittin(1-18)的基因序列為 AAATGGAAAGITITTAAGAAGAITGAGAAAATGGGCAGGAACATTCGTAACGGAATCGTGAAGGCTGGGCCCGCAATTGCTGTGCTGGGTGAAGCTAAAGCCATATTATCA ;根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性設(shè)計(jì)死亡素的基因序列為GGTTCTAAGAAACCAGTCCCCATCATATACTGCAATAGAAGAACGGGTAAGTGTCAGAGAATG。
本發(fā)明步驟一中聯(lián)接第一個(gè)和第二個(gè)原始小分子抗菌肽的GlySerGly的堿基序列為GGTTCTGGC ;聯(lián)接第二個(gè)和第三個(gè)原始小分子抗菌肽的GlySerGly的堿基序列為GGCTCCGGT ;聯(lián)接第三個(gè)和第四個(gè)原始小分子抗菌肽的GlySerGly的堿基序列為GGTTCTGGT。本發(fā)明步驟一中5’端引入Xho I粘性末端序列為CTCGAG，3’端引入Xbal I粘性末端序列為TCTAGA。對(duì)本發(fā)明獲得的融合串聯(lián)抗菌肽進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，24種不同聯(lián)接順序的融合串聯(lián)抗菌肽均對(duì)大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、鼠傷寒沙門氏菌C77-31和綠膿桿菌ATCC27853均有抑菌活性。本發(fā)明不是單一小分子抗菌肽重復(fù)性的串聯(lián)；不是將兩個(gè)不同的小分子抗菌肽基因?qū)胪毁|(zhì)粒和宿主中，分別進(jìn)行啟動(dòng)表達(dá)；而是串聯(lián)形成大分子抗菌肽。本發(fā)明融合串聯(lián)抗菌肽分子量為14kDa，不易被酶解，因此具有產(chǎn)量高(平均每升培養(yǎng)基獲得融合串聯(lián)抗菌肽約230mg)，表達(dá)量高的優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)過串聯(lián)所形成的本發(fā)明融合串聯(lián)抗菌肽其抗菌抑菌的 效果得到了顯著地提升，與四種原始小分子抗菌肽相比抑菌活性均有提高，且無溶血活性與動(dòng)物毒性。本發(fā)明采用基因工程和微生物發(fā)酵技術(shù)制備，具有成本低，生產(chǎn)投入低的特點(diǎn)。本發(fā)明利用基因工程手段進(jìn)行偏愛性設(shè)計(jì)，可以有效地提高融合串聯(lián)抗菌肽的表達(dá)量，而且聯(lián)接氨基酸也采用具有柔性的氨基酸，可以有效地區(qū)分和激發(fā)各原始小分子抗菌肽的抗菌活性。


圖I是具體實(shí)施方式
四步驟二中引物Fl與F2篩選重組質(zhì)粒pPICZaC-TM的凝膠電泳圖，圖I中“I”泳道標(biāo)樣為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，“2”泳道標(biāo)樣為以含有重組質(zhì)粒pPICZ a C-TM菌落為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，“3”泳道標(biāo)樣為含有重組質(zhì)粒pPICZ a C-TM菌落為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，“4”泳道標(biāo)樣為含有pPICZ a C菌落為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2是具體實(shí)施方式
四步驟三中PCR方法篩選酵母轉(zhuǎn)化子pPICZ a C-TM的凝膠電泳圖，圖2中“I”泳道標(biāo)樣為含有重組質(zhì)粒pPICZ a C-TM菌落為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，“2”泳道標(biāo)樣為含有重組質(zhì)粒pPICZ a C-TM菌落為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，“3”泳道標(biāo)樣為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，“4”泳道標(biāo)樣為含有pPICZ a C菌落為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，“5”泳道標(biāo)樣為含有pPICZ a C菌落為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖3是具體實(shí)施方式
四步驟四中pPICZ a -TM轉(zhuǎn)化子表達(dá)產(chǎn)物的Trincine-SDS-PAGE分析圖，圖3中“ I”泳道標(biāo)樣為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，“2”泳道標(biāo)樣為陰性對(duì)照，“3”泳道標(biāo)樣為融合串聯(lián)抗菌肽蛋白，“4”泳道標(biāo)樣為融合串聯(lián)抗菌肽蛋白，“5”泳道標(biāo)樣為融合串聯(lián)抗菌肽蛋白。圖4是具體實(shí)施方式
五步驟二中引物Fl與F2篩選重組質(zhì)粒pPICZ a C-TM的凝膠電泳圖，圖4中“ I ”泳道標(biāo)樣為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，“2”泳道標(biāo)樣為以含有重組質(zhì)粒pPICZ a C-TM菌落為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，“3”泳道標(biāo)樣為含有重組質(zhì)粒pPICZ a C-TM菌落為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，“4”，泳道標(biāo)樣為含有pPICZ a C菌落為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖5是具體實(shí)施方式
五步驟三中PCR方法篩選酵母轉(zhuǎn)化子pPICZ a C-TM的凝膠電泳圖，圖5中“I”泳道標(biāo)樣為含有重組質(zhì)粒pPICZ a C-TM菌落為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，“2”泳道標(biāo)樣為含有重組質(zhì)粒pPICZ a C-TM菌落為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，“3”泳道標(biāo)樣為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，“4”泳道標(biāo)樣為含有pPICZ a C菌落為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，“5”泳道標(biāo)樣為含有pPICZ a C菌落為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖6是具體實(shí)施方式
五步驟四中pPICZ α -TM轉(zhuǎn)化子表達(dá)產(chǎn)物的Trincine-SDS-PAGE分析圖，圖6中“I”泳道標(biāo)樣為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，“ 2 ”泳道標(biāo)樣為陰性對(duì)照，“ 3 ”泳道標(biāo)樣為融合串聯(lián)抗菌肽蛋白，“ 4 ”泳道標(biāo)樣為融合串聯(lián)抗菌肽蛋白，“ 5 ”泳道標(biāo)樣為融合串聯(lián)抗菌肽蛋白。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式融合串聯(lián)抗菌肽由Fowl icidin-2、天蠶素B、CecropinA (1-8)-Melittin (1-18)和死亡素四種抗菌肽串聯(lián)而成，F(xiàn)owlicidin-2、天蠶素B、CecropinA(1-8)-Melittin (1-18)與死亡素之間用 GlySerGly 聯(lián)接。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式融合串聯(lián)抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所
/Jn ο具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式融合串聯(lián)抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :4所
/Jn ο具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式融合串聯(lián)抗菌肽按以下步驟制備一、融合串聯(lián)抗菌肽由四種原始小分子抗菌肽串聯(lián)而成，四種原始小分子抗菌肽之間用GlySerGly聯(lián)接，再根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性設(shè)計(jì)融合串聯(lián)抗菌肽的cDNA片段；然后在融合串聯(lián)抗菌肽cDNA片段5’端加入Kex2裂解位點(diǎn)的三個(gè)密碼子，在融合串聯(lián)抗菌肽cDNA片段3’端加入終止密碼子TAA，再在5’和3’端分別引入Xho I和Xbal I粘性末端，連接PUC59，構(gòu)建了克隆質(zhì)粒pUC57-TM ；二、用Xho I和Xbal I雙酶切pUC57_TM，獲得融合串聯(lián)抗菌肽的編碼基因片段，與pPICZ a C連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5 a，PCR和測(cè)序進(jìn)一步鑒定，構(gòu)建重組表達(dá)載體pPICZa C-TM ；三、將重組表達(dá)載體pPICZ a C-TM經(jīng)Sac I線性化后，電轉(zhuǎn)入畢赤酵母SMD1168中，用100 μ g/mL濃度的Zeocin (博萊霉素)和PCR法篩選獲得高拷貝的重組酵母轉(zhuǎn)化子；四、將重組酵母轉(zhuǎn)化子的單菌落接種于5ml酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD)中，在30°C、280r/min的條件下培養(yǎng)16 17h，然后取50 μ I培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到25ml的BMGY培養(yǎng)基中，在30°C、300r/min條件下培養(yǎng)到OD值為2 6，收集菌體轉(zhuǎn)接于50ml的BMMY培養(yǎng)基中，在30°C、300r/min、l%甲醇的條件下誘導(dǎo)72h，在誘導(dǎo)過程中每隔24h補(bǔ)加甲醇保持終濃度為O. 5% 1% ;誘導(dǎo)后離心收集上清液，蛋白純化系統(tǒng)純化獲得融合串聯(lián)抗菌肽；步驟一中四種原始小分子抗菌肽為Fowlicidin-2、天蠶素B、CecropinA(1-8)-Melittin(1-18)和死亡素，聯(lián)接順序?yàn)?Fowlicidin-2、CecropinA (1-8) -Melittin (1-18)、天香素 B 和死亡素。本實(shí)施方式步驟一中Kex2裂解位點(diǎn)的三個(gè)密碼子所編碼的氨基酸序列為GluLysArg,三個(gè)密碼子的堿基序列為GAGAAGAGA。本實(shí)施方式步驟一中根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性設(shè)計(jì)Fowlicidin-2的基因序列為 CTAGTTCAAAGGGGACGTTTGGAAGATTTCTGAGAAAGATCCGAAGATTCAGACCAAAGGTTACAATCACTATTCAAGGTAGTGCTCGATTC ;根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性設(shè)計(jì)天蠶素B的基因序列為AAATGGAAAGTTTTTAAGAAGATTGAGAAAATGGGCAGGAACATTCGTAACGGAATCGTGAAGGCTGGGCCCGCAATTGCTGTGCTGGGTGAAGCTAAAGCCATATIATCA ;根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性設(shè)計(jì) CecropinA (1-8) -Melittin (1-18)的基因序列為 AAATGGAAAGITITTAAGAAGATTGAGAAAATGGGCAGGAACATTCGTAACGGAATCGTGAAGGCTGGGCCCGCAATTGCTGTGCTGGGTGAAGCTAAAGCCATATTATCA ;根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性設(shè)計(jì)死亡素的基因序列為GGTTCTAAGAAACCAGTCCCCATCATATACTGCAATAGAAGAACGGGTAAGTGTCAGAGAATG。本實(shí)施方式步驟一中聯(lián)接第一個(gè)和第二個(gè)原始小分子抗菌肽的GlySerGly的堿基序列為GGTTCTGGC ;聯(lián)接第二個(gè)和第三個(gè)原始小分子抗菌肽的GlySerGly的堿基序列為GGCTCCGGT ;聯(lián)接第三個(gè)和第四個(gè)原始小分子抗菌肽的GlySerGly的堿基序列為GGTTCTGGTο本實(shí)施方式步驟一中5’端引入Xho I粘性末端序列為CTCGAG，3’端引入Xbal I粘性末端序列為TCTAGA。
本實(shí)施方式步驟二中PCR篩選陽性克隆，所用引物Fl 5’ -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’ ；F2 :5’ -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’，PCR 反應(yīng)條件為94C、5min ;95°C、30s，58°C、30s，72°C lmin，32 個(gè)循環(huán)后 72°C延伸 5min,引物 Fl 與 F2 分別與pPICZ a C的第855 875和1423 1443間的堿基互補(bǔ)，以引物Fl與F2篩選重組質(zhì)粒，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，如圖I所示。含有質(zhì)粒pPICZ a C的菌落為模板的PCR產(chǎn)物DNA條帶為588bp，而陽性重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNA條帶為882bp。經(jīng)Xhol I、Xba I雙酶切鑒定、測(cè)序驗(yàn)證后，陽性重組質(zhì)粒堿基序列與設(shè)計(jì)完全一致，說明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pPICZ a C-TM。本實(shí)施方式步驟三限制性內(nèi)切酶Sac I酶切線性化pPICZ a C-TM (5 10 μ g)，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母SMD1168，轉(zhuǎn)化條件3000V、25 μ F、200 Ω電擊5ms，30°C溫育復(fù)性I I. 5h后涂MD平板，30°C培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落。PCR方法鑒定重轉(zhuǎn)化子，用凍-煮-凍法制備PCR模板，所用引物為 Fl 與 F2，反應(yīng)條件94°C、5min ;94°C、lmin，59°C、lmin，72°C、lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C 5min。PCR篩選結(jié)果如圖2所示，陽性對(duì)照，即以含有質(zhì)粒pPICZ a C的酵母菌落為模板的PCR產(chǎn)物為588bp的DNA條帶，而陽性重組質(zhì)粒，即以含有重組質(zhì)粒pPICZ a C-TM的酵母菌落為模板擴(kuò)增產(chǎn)物為882bp的DNA條帶，說明目的基因已成功轉(zhuǎn)入畢赤酵母SMD1168中。本實(shí)施方式步驟四誘導(dǎo)后離心收集上清,取樣Tricine-SDS-PAGE分析,如圖3所示，重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZ a C-TM轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生了一條約為14kDa的特異的蛋白帶，與預(yù)期融合串聯(lián)抗菌肽蛋白的大小一致。獲得的上清液利用AKTA explorer蛋白純化儀凝膠過濾層析純化蛋白，流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液(O. 5mol/L Na2HPO4,0. 15mol/L NaCl, ρΗ7· O)，收集目的峰。然后進(jìn)行脫鹽，以去離子水為流動(dòng)相，分離除去鹽峰，利用Bradford方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，計(jì)算融合串聯(lián)抗菌肽的產(chǎn)率，平均每升培養(yǎng)基能獲得融合串聯(lián)抗菌肽232. 7mg，真空冷凍干燥后獲得重組抗菌肽干粉。本實(shí)施方式步驟一中用于制備融合串聯(lián)抗菌肽的人工合成堿基序列如SEQ IDNO 1所示。本實(shí)施方式融合串聯(lián)抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本實(shí)施方式融合串聯(lián)抗菌肽抑菌試驗(yàn)融合串聯(lián)抗菌肽最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定
以對(duì)數(shù)生長中期的大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、鼠傷寒沙門氏菌C77-31和綠膿桿菌ATCC27853為指示菌，測(cè)定本實(shí)施方式融合串聯(lián)抗菌肽的抑菌活性。稱取純化凍干后的本實(shí)施方式融合串聯(lián)抗菌肽，以及化學(xué)合成的四種原始小分子抗菌肽 Fowl icidin-2、天蠶素 B、Cecropin A (1-8) -Melittin (1-18)與死亡素,用 PBS 溶解后,稀釋得到以下不同濃度的肽溶液:2560 μ g/ml> 1280 μ g/ml>640 μ g/ml>320 μ g/ml> 160 μ g/ml、80 μ g/ml、40 μ g/ml、20 μ g/ml、10 μ g/ml 和 5 μ g/mL· 利用微量肉湯稀釋法測(cè)定 MIC,將測(cè)試菌過夜培養(yǎng)物釋至2 X IO5 7X 105CFU/ml，分別取100 μ I加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每行的I至10號(hào)孔，11號(hào)孔加入100 μ I的新鮮MHB培養(yǎng)基作為對(duì)照，再將按梯度稀釋的抗菌肽11 μ I對(duì)應(yīng)加到I至10號(hào)孔。37°C培養(yǎng)18至24h后，用酶標(biāo)儀測(cè)490nm吸光值。吸光度比10號(hào)孔低50%以上的孔內(nèi)的濃度即定義為對(duì)該測(cè)試菌的最小抑菌濃度MIC。由表I可見，本實(shí)施方式融合串聯(lián)抗菌肽對(duì)四種測(cè)試菌均具有明顯的抑制作用，與四種原始小分子抗菌肽相比，除本實(shí)施方式融合串聯(lián)抗菌肽與Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)對(duì)四種細(xì)菌的抗菌活性沒有差異外，較其他三種原始小分子抗菌肽抗菌活性都有一定程度的提高，與Fowlicidin-2相比，對(duì)金黃色葡萄球菌的活性有所提高，與天蠶素B相比，對(duì)金黃色葡萄球菌的活性顯著提高，對(duì)大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌也有提高。與死亡素相比，對(duì)金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌的活性顯著提高。 表I本實(shí)施方式融合串聯(lián)抗菌肽對(duì)四種測(cè)試菌的MIC
~mm11:色葡萄I··I綠膿桿菌滕艦
ATCC25923 ATCC25922 ATCC27853 菌 C77-31
合串聯(lián)抗菌狀 8^ml16pg/ml32 μ^ιη 32 pg/ml
Fowlicidin-2 16 μ^ιη 16 pg/mi32 μ^ηι 32 pg/ml
夭蠶素 B 128 μδ/πι 32 μ^ιη 32 μ^ιη 64 μ^ιη
Cecropin
A(l-8)-Melittin 8 pg/ml 16 pg/ml 32 μ^ιη 32 μ^ιη (1-18)______
死亡素256 pg/ml 32 pg/ml128 pg/ml32 pg/ml本實(shí)施方式融合串聯(lián)抗菌肽的體外溶血活性檢測(cè)，檢測(cè)用血液樣品取自正常人血液，檢測(cè)步驟如下新鮮血液ImL, 3000r/min離心5min收集紅細(xì)胞,PBS洗漆3遍,再用IOmL PBS重懸制成8% (V/V)血細(xì)胞懸浮液，取100 μ L紅細(xì)胞懸浮液與100 μ L用PBS溶解的不同濃度的本實(shí)施方式融合串聯(lián)抗菌肽溶液混合，37°C孵育lh。3000r/min離心5min，取上清液，力口入到96孔板中，酶標(biāo)儀測(cè)定540nm吸光值，重復(fù)三次，取平均值，PBS作為陰性對(duì)照，O. I %的Triton-100做陽性對(duì)照。檢測(cè)結(jié)果為，在256 μ g/ml濃度下未表現(xiàn)出溶血活性。本實(shí)施方式融合串聯(lián)抗菌肽的動(dòng)物體內(nèi)急性毒性試驗(yàn)采用昆明白小鼠60只，雌雄各半，體重26±0. 40g，按照lmg/kg劑量肌肉注射本實(shí)施方式融合串聯(lián)抗菌肽，每日一次，連續(xù)7天，觀察小鼠毒性反應(yīng)，結(jié)果表明，肌注本實(shí)施方式融合串聯(lián)抗菌肽7天后，小鼠無異常反應(yīng)，活動(dòng)正常，60只小鼠全部存活，證明本實(shí)施方式融合串聯(lián)抗菌肽無毒副作用。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式融合串聯(lián)抗菌肽按以下步驟制備一、融合串聯(lián)抗菌肽由四種原始小分子抗菌肽串聯(lián)而成，四種原始小分子抗菌肽之間用GlySerGly聯(lián)接，再根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性設(shè)計(jì)融合串聯(lián)抗菌肽的cDNA片段；然后在融合串聯(lián)抗菌肽cDNA片段5’端加入Kex2裂解位點(diǎn)的三個(gè)密碼子，在融合串聯(lián)抗菌肽cDNA片段3’端加入終止密碼子TAA，再在5’和3’端分別引入Xho I和Xbal I粘性末端，連接PUC59，構(gòu)建了克隆質(zhì)粒pUC57-TM ；二、用Xho I和Xbal I雙酶切pUC57_TM，獲得融合串聯(lián)抗菌肽的編碼基因片段，與pPICZ a C連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5 a，PCR和測(cè)序進(jìn)一步鑒定，構(gòu)建重組表達(dá)載體 pPICZa C-TM ；三、將重組表達(dá)載體pPICZ a C-TM經(jīng)Sac I線性化后，電轉(zhuǎn)入畢赤酵母SMD1168中，用100 μ g/mL濃度的Zeocin (博萊霉素)和PCR法篩選獲得高拷貝的重組酵母轉(zhuǎn)化子；四、將重組酵母轉(zhuǎn)化子的單菌落接種于5ml酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD)中，在30°C、280r/min的條件下培養(yǎng)16 17h，然后取50 μ I培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到25ml的BMGY培養(yǎng)基中，在30°C、300r/min條件下培養(yǎng)到OD值為2 6，收集菌體轉(zhuǎn)接于50ml的BMMY培養(yǎng)基中，在30°C、300r/min、l%甲醇的條件下誘導(dǎo)72h，在誘導(dǎo)過程中每隔24h補(bǔ)加甲醇保持終濃度為O. 5% 1% ;誘導(dǎo)后離心收集上清液，蛋白純化系統(tǒng)純化獲得融合串聯(lián)抗菌肽；步驟一中四種原始小分子抗菌肽為Fowlicidin-2、天蠶素B、CecropinA(1-8) -Melittin (1-18)和死亡素，聯(lián)接順序?yàn)?Cecropin A(1-8) -Melittin (1-18) >Fowlicidin-2、死亡素和天蠶素B。本實(shí)施方式步驟一中Kex2裂解位點(diǎn)的三個(gè)密碼子所編碼的氨基酸序列為GluLysArg,三個(gè)密碼子的堿基序列為GAGAAGAGA。本實(shí)施方式步驟一中根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性設(shè)計(jì)Fowlicidin-2的基因序列為 CTAGTTCAAAGGGGACGTTTTGGAAGATTTCTGAGAAAGATCCGAAGATTCAGACCAAAGGTTACAATCACTATTCAAGGTAGTGCTCGATTC ;根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性設(shè)計(jì)天蠶素B的基因序列為 AAATGGAAAGTTTTTAAGAAGATTGAGAAAATGGGCAGGAACATTCGTAACGGAATCGTGAAGGCTGGGCCCGCAATTGCTGTGCTGGGTGAAGCTAAAGCCATATATCA ;根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性設(shè)計(jì) CecropinA (1-8) -Melittin (1-18)的基因序列為 AAATGGAAAGITITTAAGAAGATTGAGAAAATGGGCAGGAACATTCGTAACGGAATCGTGAAGGCTGGGCCCGCAATTGCTGTGCTGGGTGAAGC TAAAGCCATATTATCA ;根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性設(shè)計(jì)死亡素的基因序列為GGTTCTAAGAAACCAGTCCCCATCATATACTGCAATAGAAGAACGGGTAAGTGTCAGAGAATG。本實(shí)施方式步驟一中聯(lián)接第一個(gè)和第二個(gè)原始小分子抗菌肽的GlySerGly的堿基序列為GGTTCTGGC ;聯(lián)接第二個(gè)和第三個(gè)原始小分子抗菌肽的GlySerGly的堿基序列為GGCTCCGGT ;聯(lián)接第三個(gè)和第四個(gè)原始小分子抗菌肽的GlySerGly的堿基序列為GGTTCTGGTο本實(shí)施方式步驟一中5’端引入Xho I粘性末端序列為CTCGAG，3’端引入XbalI粘性末端序列為TCTAGA。
本實(shí)施方式步驟二中PCR篩選陽性克隆，所用引物Fl 5’ -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’ ；F2 :5’ -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’，PCR 反應(yīng)條件為94°C、5min ;95°C、30s，58°C、30s，72°C lmin, 32 個(gè)循環(huán)后 72°C延伸 5min,引物 Fl 與 F2 分別與pPICZ a C的第855 875和1423 1443間的堿基互補(bǔ)，以引物Fl與F2篩選重組質(zhì)粒，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，如圖4所示。含有質(zhì)粒pPICZ a C的菌落為模板的PCR產(chǎn)物DNA條帶為588bp，而陽性重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNA條帶為882bp。經(jīng)Xhol I、Xba I雙酶切鑒定、測(cè)序驗(yàn)證后，陽性重組質(zhì)粒堿基序列與設(shè)計(jì)完全一致，說明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pPICZ a C-TM。本實(shí)施方式步驟三限制性內(nèi)切酶Sac I酶切線性化pPICZ a C-TM (5 10 μ g)，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母SMD1168，轉(zhuǎn)化條件3000V、25 μ F、200 Ω電擊5ms，30°C溫育復(fù)性I I. 5h后涂MD平板，30°C培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落。PCR方法鑒定重轉(zhuǎn)化子，用凍-煮-凍法制備PCR模板，所用引物為 Fl 與 F2，反應(yīng)條件94°C、5min ;94°C、lmin，59°C、lmin，72°C、lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C 5min。 PCR篩選結(jié)果如圖5所示，陽性對(duì)照，即以含有質(zhì)粒pPICZ a C的酵母菌落為模板的PCR產(chǎn)物為588bp的DNA條帶，而陽性重組質(zhì)粒，即以含有重組質(zhì)粒pPICZ a C-TM的酵母菌落為模板擴(kuò)增產(chǎn)物為882bp的DNA條帶，說明目的基因已成功轉(zhuǎn)入畢赤酵母SMD1168中。本實(shí)施方式步驟四誘導(dǎo)后離心收集上清,取樣Tricine-SDS-PAGE分析,如圖6所示，重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZ a C-TM轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生了一條約為14kDa的特異的蛋白帶，與預(yù)期融合串聯(lián)抗菌肽蛋白的大小一致。獲得的上清液利用AKTA explorer蛋白純化儀凝膠過濾層析純化蛋白，流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液(O. 5mol/L Na2HPO4,0. 15mol/L NaCl, ρΗ7· O)，收集目的峰。然后進(jìn)行脫鹽，以去離子水為流動(dòng)相，分離除去鹽峰，利用Bradford方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，計(jì)算融合串聯(lián)抗菌肽的產(chǎn)率，平均每升培養(yǎng)基能獲得融合串聯(lián)抗菌肽233. 8mg，真空冷凍干燥后獲得重組抗菌肽干粉。本實(shí)施方式步驟一中用于制備融合串聯(lián)抗菌肽的人工合成堿基序列如SEQ IDNO 3所示。本實(shí)施方式融合串聯(lián)抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。本實(shí)施方式融合串聯(lián)抗菌肽抑菌試驗(yàn)融合串聯(lián)抗菌肽最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定以對(duì)數(shù)生長中期的大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、鼠傷寒沙門氏菌C77-31和綠膿桿菌ATCC27853為指示菌，測(cè)定本實(shí)施方式融合串聯(lián)抗菌肽的抑菌活性。稱取純化凍干后的本實(shí)施方式融合串聯(lián)抗菌肽，以及化學(xué)合成的四種原始小分子抗菌肽 Fowl icidin-2、天蠶素 B、Cecropin A (1-8) -Melittin (1-18)與死亡素,用 PBS 溶解后,稀釋得到以下不同濃度的肽溶液:2560 μ g/ml、1280 μ g/ml、640 μ g/ml、320 μ g/ml、160 μ g/ml、80 μ g/ml>40 μ g/ml>20 μ g/ml、10 μ g/ml 和 5 μ g/ml。利用微量肉湯稀釋法測(cè)定 MIC,將測(cè)試菌過夜培養(yǎng)物釋至2 X IO5 7X 105CFU/ml，分別取100 μ I加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每行的I至10號(hào)孔，11號(hào)孔加入100 μ I的新鮮MHB培養(yǎng)基作為對(duì)照，再將按梯度稀釋的抗菌肽11 μ I對(duì)應(yīng)加到I至10號(hào)孔。37°C培養(yǎng)18至24h后，用酶標(biāo)儀測(cè)490nm吸光值。吸光度比10號(hào)孔低50%以上的孔內(nèi)的濃度即定義為對(duì)該測(cè)試菌的最小抑菌濃度MIC。由表2可見，本實(shí)施方式融合串聯(lián)抗菌肽對(duì)四種測(cè)試菌均具有明顯的抑制作用，與四種原始小分子抗菌肽相比，除本實(shí)施方式融合串聯(lián)抗菌肽與Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)對(duì)四種細(xì)菌的抗菌活性沒有差異外，較其他三種原始小分子抗菌肽抗菌活性都有一定程度的提高，與Fowlicidin-2相比，對(duì)金黃色葡萄球菌的活性有所提高，與天蠶素B相比，對(duì)金黃色葡萄球菌的活性顯著提高，對(duì)大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌也有提高。與死亡素相比，對(duì)金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌的活性顯著提高。表2本實(shí)施方式融合串聯(lián)抗菌肽對(duì)四種測(cè)試菌的MIC
權(quán)利要求
1.融合串聯(lián)抗菌肽，其特征在于融合串聯(lián)抗菌肽由Fowlicidin-2、天蠶素B、CecropinA (1-8)-Melittin (1-18)和死亡素四種抗菌肽串聯(lián)而成，F(xiàn)owlicidin-2、天蠶素B、CecropinA(1-8)-Melittin (1-18)與死亡素之間用 GlySerGly 聯(lián)接。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的融合串聯(lián)抗菌肽的制備方法，其特征在于融合串聯(lián)抗菌肽按以下步驟制備 一、融合串聯(lián)抗菌肽由四種原始小分子抗菌肽串聯(lián)而成，四種原始小分子抗菌肽之間用GlySerGly聯(lián)接，再根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性設(shè)計(jì)融合串聯(lián)抗菌肽的cDNA片段；然后在融合串聯(lián)抗菌肽cDNA片段5’端加入Kex2裂解位點(diǎn)的三個(gè)密碼子，在融合串聯(lián)抗菌肽cDNA片段3’端加入終止密碼子TAA，再在5’和3’端分別引入Xho I和Xbal I粘性末端，連接pUC59，構(gòu)建了克隆質(zhì)粒pUC57-TM ； 二、用XhoI和Xbal I雙酶切PUC57-TM，獲得融合串聯(lián)抗菌肽的編碼基因片段，與PPICZaC連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5a，PCR和測(cè)序進(jìn)一步鑒定，構(gòu)建重組表達(dá)載體pPICZa C-TM ； 三、將重組表達(dá)載體pPICZa C-TM經(jīng)Sac I線性化后，電轉(zhuǎn)入畢赤酵母SMD1168中，用100 μ g/mL濃度的博萊霉素Zeocin和PCR法篩選獲得高拷貝的重組酵母轉(zhuǎn)化子； 四、將重組酵母轉(zhuǎn)化子的單菌落接種于酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基中，在30°C、280r/min的條件下培養(yǎng)16 17h，然后取培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到BMGY培養(yǎng)基中，在30°C、300r/min條件下培養(yǎng)到OD值為2 6，收集菌體轉(zhuǎn)接于BMMY培養(yǎng)基中，在30°C、300r/min、I %甲醇的條件下誘導(dǎo)72h，在誘導(dǎo)過程中每隔24h補(bǔ)加甲醇保持終濃度為O. 5% 1% ;誘導(dǎo)后離心收集上清液，蛋白純化系統(tǒng)純化獲得融合串聯(lián)抗菌肽； 步驟一中四種原始小分子抗菌肽為Fowlicidin-2、天蠶素B、CecropinA(1-8)-Melittin(1-18)和死亡素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的融合串聯(lián)抗菌肽的制備方法，其特征在于步驟一中Kex2裂解位點(diǎn)的三個(gè)密碼子所編碼的氨基酸序列為GluLysArg，三個(gè)密碼子的堿基序列為GAGAAGAGA0
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的融合串聯(lián)抗菌肽的制備方法，其特征在于步驟一中根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性設(shè)計(jì)Fowlicidin-2的基因序列為CTAGTTCAAAGGGGACGTTTTGGAAGATTTCTGAGAAAGATCCGAAGATTCAGACCAAAGGTTACAATCACTATTCAAGGTAGTGCTCGATTC ;根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性設(shè)計(jì)天蠶素B的基因序列為AAATGGAAAGITITTAAGAAGATTGAGAAAATGGGCAGGAACATTCGTAACGGAATCGTGAAGGCTGGGCCCGCAATTGCTGTGCTGGGTGAAGCTAAAGCCATATTATCA ;根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性設(shè)計(jì)Cecropm A(1-8)-Melittin(1-18)的基因序列為AAATGGAAAGTTTTTAAGAAGATTGAGAMATGGGCAGGAACATTCGTAACGGMTCGTGAAGG°CTGGGCCCGCMTTGCTGTGCTGGGTGAAGCTAAAGCCATATTATCA ;根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性設(shè)計(jì)死亡素的基因序列為GGTTCTAAGAAACCAGTCCCCATCATATACTGCAATAGAAGAACGGGTAAGTGTCAGAGAATG。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的融合串聯(lián)抗菌肽的制備方法，其特征在于步驟一中聯(lián)接第一個(gè)和第二個(gè)原始小分子抗菌肽的GlySerGly的堿基序列為GGTTCTGGC ;聯(lián)接第二個(gè)和第三個(gè)原始小分子抗菌肽的GlySerGly的堿基序列為GGCTCCGG%聯(lián)接第三個(gè)和第四個(gè)原始小分子抗菌肽的GlySerGly的堿基序列為GGTTCTGGT。
6.根據(jù)權(quán)利要求2、3、4或5所述的融合串聯(lián)抗菌肽的制備方法，其特征在于步驟一中·5’端引入Xho I粘性末端序列為C TCGAG，3’端引入Xbal I粘性末端序列為TCTAGA。
全文摘要
融合串聯(lián)抗菌肽及其制備方法，它涉及抗菌肽及其制備方法。本發(fā)明解決了現(xiàn)有抗菌肽合成方法中產(chǎn)量低，生產(chǎn)成本高；特別是采用基因工程重組表達(dá)抗菌肽過程中抗菌肽分子容易被酶解，導(dǎo)致表達(dá)量低或者很難表達(dá)的問題。融合串聯(lián)抗菌肽由Fowlicidin-2、天蠶素B、Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)和死亡素四種抗菌肽串聯(lián)而成。制備方法一、設(shè)計(jì)cDNA片段；二、構(gòu)建重組表達(dá)載體；三、獲得轉(zhuǎn)化子；四、誘導(dǎo)，收集上清液，蛋白純化。本發(fā)明用于抗菌肽制備領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12R1/84GK102863539SQ20121038235
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月11日
發(fā)明者馮興軍, 李仲玉, 程寶晶, 李靜 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)