專利名稱：檢測卵巢腫瘤的血清學(xué)生物標(biāo)記物miR-93及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體而言涉及一種卵巢癌腫瘤的生物標(biāo)記物——血清microRNA-93 (miR-93)，及其篩選方法和在輔助個(gè)體卵巢腫瘤篩查與臨床診斷及病情發(fā)展中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
卵巢癌(ovarian carcinoma)是女性生殖器官常見的腫瘤之一,大多數(shù)是由于卵巢上皮細(xì)胞和包涵囊腫組織上皮細(xì)胞在多種致癌因子作用下，發(fā)生了基因突變，致使細(xì)胞增生失控。卵巢癌是死亡率極高的婦科惡性腫瘤，其組織學(xué)形態(tài)多種多樣，是一類高度異質(zhì)性的腫瘤，具有發(fā)病率高、但病程進(jìn)展緩慢、早期癥狀不易察覺；且侵襲轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)、自然生存期長等特點(diǎn)。在臨床檢查中，多采用CA-125水平檢測、超聲檢查、以及聯(lián)合CA-125動(dòng)態(tài)監(jiān)測和盆腔超聲檢查及彩色多普勒血流顯像等檢測方法盡可能的提高卵巢檢出率。但目 前80%的卵巢癌病人發(fā)現(xiàn)時(shí)已是中晚期(II -IV)，采取腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)以及化療患者的5年存活率僅為20%左右，且治療比較復(fù)雜，預(yù)后效果比較差。雖然早期診斷及輔助化療和激素治療使得卵巢癌的死亡率有所降低，但在導(dǎo)致女性死亡的惡性腫瘤中卵巢癌仍居世界前列。MicroRNA(miRNA)是一類生物體內(nèi)自然形成的小分子非編碼RNA，參與調(diào)節(jié)其特異靶基因的表達(dá)，從而控制蛋白的產(chǎn)生，具有調(diào)節(jié)發(fā)育時(shí)序，細(xì)胞增殖，分化，代謝，凋亡與應(yīng)激以及參與脊椎動(dòng)物心臟、肌肉以及神經(jīng)系統(tǒng)的形成，同時(shí)調(diào)控腫瘤發(fā)生的功能。約50%的已知人類miRNA基因定位于和腫瘤相關(guān)的染色體區(qū)域，而不斷累積的研究成果也已充分證實(shí)miRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生，發(fā)展密切相關(guān)。高通量測序是基于傳統(tǒng)的Sanger測序的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的分子生物學(xué)的分析方法之一是，雖然此技術(shù)建立時(shí)間不長，但其發(fā)展速度相當(dāng)快。該技術(shù)能夠?qū)?shù)百萬個(gè)分子進(jìn)行同時(shí)測序。這使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能。高通量測序的具有傳統(tǒng)測序法達(dá)不到的優(yōu)點(diǎn)，首先，它是利用芯片技術(shù)進(jìn)行測序，可以在數(shù)百萬個(gè)點(diǎn)上同時(shí)閱讀測序，把利用平行處理的方略讀取結(jié)果，通量較高；其次，高通量測序具有精確地樣本定量功能，其原理為樣本的DNA或者RNA被測序的次數(shù)反應(yīng)了在樣品中的豐度；同時(shí)高通量測序的成本相對(duì)較為低廉。對(duì)于miRNA序列較短、同源性高，利用芯片檢測非常困難。而利用高通量技術(shù)不僅能夠解決此問題，而且能夠發(fā)現(xiàn)新的miRNA。利用此技術(shù)對(duì)卵巢腫瘤患者血清與健康血清樣本分別進(jìn)行測序，并對(duì)比其序列組成以及表達(dá)譜特征，對(duì)于發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)記物用于卵巢疾病的早期診斷有重要的意義。生物標(biāo)記物是指能將機(jī)體的生理和病理狀態(tài)區(qū)分開來的生物分子。篩選到可用于腫瘤早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷的生物標(biāo)記物可大大提高腫瘤患者的臨床治療效果。最新數(shù)據(jù)顯示腫瘤組織普遍具有特征性的miRNA表達(dá)譜，即指腫瘤細(xì)胞某幾種miRNA的表達(dá)水平常與同一組織中的正常細(xì)胞存在顯著差異，而特征性的miRNA異常表達(dá)可望成為用于腫瘤的診斷、病理分級(jí)、臨床分期、療效與預(yù)后的生物標(biāo)記物，顯示了良好的臨床應(yīng)用前景。
近年來研究人員發(fā)現(xiàn)在血漿和血清中也存在獨(dú)立于細(xì)胞之外并且即使在嚴(yán)酷環(huán)境下也能明顯保持穩(wěn)定的miRNA分子，而作為生物檢測樣本，血清具有取材方便、無創(chuàng)傷性、并可連續(xù)的體外檢測的優(yōu)點(diǎn)，使得基于miRNA定性和定量檢測技術(shù)尋找癌癥特異性的血清miRNA作為分子標(biāo)記的方法比傳統(tǒng)的蛋白分子標(biāo)記方法將更加有效，進(jìn)而可以克服分子標(biāo)記在抗體制備和定量分析上發(fā)展所遇到的瓶頸。因此，開發(fā)一種可輔助卵巢癌篩查和診斷的血清miRNA作為生物標(biāo)記物，具有廣泛的科研價(jià)值和臨床應(yīng)用前景。目前已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，microRNA在血液中被有效地保護(hù)，使其免受在血液中大量存在的RNase的降解,表現(xiàn)出高度的穩(wěn)定 性。對(duì)于血液microRNA能否作為一種無創(chuàng)性檢測手段，目前的研究主要集中在癌癥的早期診斷方面。然而，目前還沒有將血清/血漿microRNA應(yīng)用于卵巢疾病的輔助判斷、危險(xiǎn)度評(píng)價(jià)等方面的報(bào)道，若能篩選與卵巢組織病理狀態(tài)有關(guān)的特異或異常表達(dá)的血清/血漿microRNA作為疾病檢測的生物標(biāo)志物，并研制相應(yīng)的檢測試劑盒，將會(huì)大大提升卵巢腫瘤疾病的檢測水平。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種具有較高靶向性、穩(wěn)定性及高效率檢測卵巢腫瘤的血清學(xué)生物標(biāo)記物miR-93及其用途。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種檢測卵巢腫瘤的血清學(xué)的生物標(biāo)記物miR-93，其 miRNA 序列為miR-93 caaagugcuguucgugcagguag0本發(fā)明還同時(shí)提供了上述血清學(xué)生物標(biāo)記物miR-93的用途制備用于篩查卵巢腫瘤或輔助卵巢腫瘤病理鑒定和臨床診斷的試劑盒。作為本發(fā)明的血清學(xué)生物標(biāo)記物的用途的改進(jìn)試劑盒包括反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)和引物系統(tǒng)/引物探針系統(tǒng)(即，引物系統(tǒng)、引物探針系統(tǒng)任選其一)；反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)包括反轉(zhuǎn)錄酶、反轉(zhuǎn)錄體系緩沖液和RNA酶抑制劑；引物系統(tǒng)由miR-93的莖環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物、cDNA擴(kuò)增引物以及miR_16的莖環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物、擴(kuò)增引物組成；引物探針系統(tǒng)由miR-93的莖環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物、cDNA擴(kuò)增引物和探針以及miR-16的莖環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物、擴(kuò)增引物和探針組成。作為本發(fā)明的血清學(xué)生物標(biāo)記物的用途的進(jìn)一步改進(jìn)試劑盒還包括擴(kuò)增系統(tǒng)；擴(kuò)增系統(tǒng)包括含Taq酶的miRNA表達(dá)定量檢測混合液。備注說明擴(kuò)增系統(tǒng)僅在引物探針系統(tǒng)中被用到。作為本發(fā)明的血清學(xué)生物標(biāo)記物的用途的進(jìn)一步改進(jìn)檢測該標(biāo)志物(標(biāo)記物)的技術(shù)為基于莖環(huán)的反轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR技術(shù)。作為本發(fā)明的血清學(xué)生物標(biāo)記物的用途的進(jìn)一步改進(jìn)莖環(huán)是指反轉(zhuǎn)錄過程中使用的莖環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物，miR-93莖環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物由以下核苷酸序列組成miR-93 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTACCT。作為本發(fā)明的血清學(xué)生物標(biāo)記物的用途的進(jìn)一步改進(jìn)熒光定量PCR技術(shù)為DNA染料法或TaqMan探針法。作為本發(fā)明的血清學(xué)生物標(biāo)記物的用途的進(jìn)一步改進(jìn)基于DNA染料法的熒光定量PCR檢測方法，其中所使用的特異性PCR引物(即miR-93的cDNA擴(kuò)增引物)為miR-93 PCR 正向引物CGCGGCAAAGTGCTGTTCmiR-93 PCR 反向引物CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT。作為本發(fā)明的血清學(xué)生物標(biāo)記物的用途的進(jìn)一步改進(jìn)基于TaqMan探針法的熒光定量PCR檢測方法，其中所使用的引物為上述PCR引物(即miR-93的cDNA擴(kuò)增引物)，其中所使用的探針由以下核苷酸序列組成miR-93 (6-FAM) ACTGGATACGACCTACCT (MGB)。 以上括號(hào)內(nèi)的內(nèi)容代表探針合成方式。作為本發(fā)明的血清學(xué)生物標(biāo)記物的用途的進(jìn)一步改進(jìn)在熒光定量PCR檢測方法中，使用保守性miRNA(miR-16)作為內(nèi)參照基因，miR-16的序列、莖環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物、擴(kuò)增引物及探針為序列uauugcacuugucccggccugu ；莖環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCCAATA ； PCR 正向引物ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACGTAAATA ；PCR 反向引物TGGTGTCGTGGAGTCG ；探針(6-FAM)TTCAGTTGAGCGCCAATA (MGB)。本發(fā)明的標(biāo)志物可單獨(dú)用于卵巢腫瘤的篩查，也可輔助卵巢腫瘤病理鑒定和臨床診斷。本發(fā)明的卵巢腫瘤的血清學(xué)生物標(biāo)記物microRNA-93 (miR-93)的篩選方法為對(duì)卵巢癌血清及正常血清進(jìn)行Solexa/illumina高通量測序，根據(jù)其表達(dá)譜特征進(jìn)行篩選和鑒定；從而獲得檢測卵巢腫瘤的血清學(xué)的生物標(biāo)記物microRNA-93 (miR-93)。本發(fā)明所述的miRNA能在血清中穩(wěn)定存在，該miRNA在卵巢正常血清，卵巢良性病變患者血清和卵巢惡性腫瘤患者血清中表達(dá)具有差異性，因此，能用于卵巢腫瘤篩查及輔助卵巢腫瘤病理鑒定及臨床診斷。本發(fā)明主要是以miRNA為中心，基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測和分析血清miRNA的差異性表達(dá)，主要通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(a)制備卵巢腫瘤血清樣本；(b)酸性酚/氯仿法抽提血清總RNA ；(c)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA ；(d)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miRNA在不同樣本中的表達(dá)變化量。本發(fā)明是針對(duì)現(xiàn)有卵巢腫瘤標(biāo)志物敏感性和特異性不能滿足臨床診斷的需要，在研究miRNA在卵巢腫瘤血清中的差異性表達(dá)及與臨床病理指數(shù)的相關(guān)性的基礎(chǔ)上所獲得的。本發(fā)明所述的腫瘤血清標(biāo)志物為miR-93 ;其應(yīng)用主要表現(xiàn)在目標(biāo)miR-93在卵巢癌患者與正常人群血清中顯示出差異性表達(dá),在良性腫瘤血清樣本和惡性腫瘤血清樣本中表達(dá)具有顯著性差異，可單獨(dú)用來對(duì)卵巢癌患者進(jìn)行無創(chuàng)性篩查，用于輔助卵巢腫瘤病理鑒定及臨床診斷。本發(fā)明提供的一種用于篩查卵巢腫瘤患者和鑒定卵巢腫瘤病理特征的試劑盒，其由反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，擴(kuò)增系統(tǒng)和引物探針系統(tǒng)(或者引物系統(tǒng))組成，其中，反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)由反轉(zhuǎn)錄酶，反轉(zhuǎn)錄體系緩沖液和RNA酶抑制劑組成；擴(kuò)增系統(tǒng)由含Taq酶的miRNA表達(dá)定量檢測混合液組成；引物探針系統(tǒng)由miR-16，miR-93的莖環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物和PCR擴(kuò)增引物及探針組成(引物系統(tǒng)由miR-16，miR-93的莖環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物和PCR擴(kuò)增引物組成)。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)得出以下結(jié)論，確定了 miR-93目標(biāo)miRNA可單獨(dú)作為卵巢腫瘤篩查的血清學(xué)生物標(biāo)記物，也可輔助卵巢腫瘤臨床病理鑒定及診斷。I. miRNA-93在血清中的特異性表達(dá)目標(biāo)miRNA-93通過Solexa/iIIumina測序篩查,在測序報(bào)告中表達(dá)差異進(jìn)行分析，測序結(jié)果miRNA-93在腫瘤中無表達(dá)，僅在正常樣本血清中有表達(dá)，說明了目標(biāo)miR-93在卵巢癌患者和正常血清中呈現(xiàn)差異性表達(dá)。2. miRNA-93在良性腫瘤患者血清和正常血清中表達(dá)的差異性分析 本發(fā)明運(yùn)用SPSS 17. O軟件中單樣本T檢驗(yàn)和獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，分析了目標(biāo)miRNA在收集到的23例卵巢良性腫瘤患者血清樣本和8例正常血清樣本中表達(dá)的差異性，結(jié)果表明目標(biāo)miRNA在卵巢腫瘤血清和正常血清中的表達(dá)水平明顯上調(diào)，且差異性顯著(RQ=L 85，P < O. 000)。結(jié)果表明miRNA在血清中的表達(dá)水平可反映卵巢的病理特點(diǎn)，進(jìn)而確定了 miRNA在血清學(xué)水平上可作為卵巢腫瘤的生物標(biāo)記物來指示腫瘤的臨床病理情況。3. miRNA-93在卵巢惡性腫瘤血清與正常血清中表達(dá)的差異性分析如圖所示，目標(biāo)miRNA在31例卵巢惡性腫瘤患者的血清及其8例正常血清樣本對(duì)照中表達(dá)的差異性分析，表明miR-93 (RQ=2. 12，P < O. 000)，在卵巢癌血清中顯著表達(dá)，且已達(dá)到了極顯著水平。因此根據(jù)miRNA在卵巢血清中的表達(dá)情況可明顯區(qū)分癌血清和正常血清，也具有較好的參考價(jià)值。結(jié)果表明，miR-93在血清水平上來區(qū)分卵巢良、惡性病變腫瘤，進(jìn)而無創(chuàng)傷性地篩查良性腫瘤患者以得到積極的早期診斷，進(jìn)而積極采取適合的診療措施。因此在血清中檢測這些miRNA的表達(dá)變化量對(duì)卵巢腫瘤快速篩查，臨床診斷和治療具有重要作用，有望作為卵巢診斷和治療的生物標(biāo)記物。4.在不同病理指標(biāo)下，miR-93在卵巢腫瘤患者的血清和卵巢正常血清中表達(dá)的相關(guān)性分析。在不同年齡組、病理分期以及CA-125水平上對(duì)miR_22的表達(dá)相關(guān)性的分析(如圖2、圖3)可用于早期卵巢腫瘤的診斷。對(duì)低年齡組的24例樣本和高年齡組的29例樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)miR-93在低年齡組的相對(duì)表達(dá)量(RQ=L 86)中要比高年齡組的相對(duì)表達(dá)量(RQ=L 81)要高，但未達(dá)到顯著水平(P=O. 8)。對(duì)卵巢癌血清病理分期I和II (7例)，III和IV (24例)樣本進(jìn)行miR-93表達(dá)量的分析，miR-93在卵巢癌晚期(III和IV )中表達(dá)比癌癥早中期(I和II )表達(dá)要高；在CA-125-/+水平上，miR-93在CA-125+(>35U/ml)的相對(duì)表達(dá)量(RQ=O. 73)要比CA-125-(彡35U/ml)中的相對(duì)表達(dá)量(RQ=L 62)要低。這對(duì)于癌癥病人分期診斷有重要的指導(dǎo)意義。5.用Iog2scale法反映卵巢腫瘤血清中miRNA的變化Iog2scale是目標(biāo)miRNA相對(duì)于內(nèi)參基因而言產(chǎn)生的變化以對(duì)數(shù)反映出來的一種分析方法，用于揭示目標(biāo)miRNA是否可作為區(qū)分患者和正常人血清的生物標(biāo)記物。Iog2scale法即Log2 {CtmiRNA/Ctmean (miR-16)},用于反映miRNA在卵巢腫瘤血清相對(duì)于正常血清中產(chǎn)生的差異變化。其中C miRNA代表熒光定量檢測到的目標(biāo)miRNA在卵巢血清樣本中的Ct值，而Ctmean(miR-16)代表內(nèi)參基因miR-16在卵巢血清樣本中的平均Ct值。用Iog2 scale法分析可得miR-93在惡性(Ρ=0· 000)和良性(Ρ=0· 000)腫瘤血清相對(duì)于正常血清的表達(dá)均有顯著性差異，且在良性腫瘤與正常血清中達(dá)到了極顯著水平。在本發(fā)明中本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次鑒別和分離了與卵巢腫瘤相關(guān)的血清miR-93，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明；首次通過miRNA實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)在卵巢癌血清中對(duì)miR-93的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，進(jìn)一步驗(yàn)證這些血清miRNA與卵巢腫瘤各臨床病理指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性，所提供的試劑盒專門針對(duì)于血清miR-93的檢測優(yōu)化，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為⑴本發(fā)明確定的miR-93與卵巢腫瘤臨床病例指標(biāo)的密切相關(guān)性，能夠作為生物標(biāo)記物對(duì)卵巢腫瘤病人進(jìn)行篩查和診斷，為臨床個(gè)體化干預(yù)治療提供有效依據(jù)。(2)由于血清具有取材方便，無創(chuàng)傷性，并可連續(xù)體外檢測的優(yōu)點(diǎn)，因此從血清中尋 找生物標(biāo)記物可以將卵巢腫瘤的篩查和診斷提高至一個(gè)新的水平，進(jìn)而提高治愈率和降低死亡率。(3)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)卵巢腫瘤病人的血清水平miR-93的檢測，定量準(zhǔn)確。相對(duì)于芯片技術(shù)或者分子雜交，該方法簡便快速且經(jīng)濟(jì)實(shí)用。(4)可與其他分子指標(biāo)相結(jié)合，為卵巢腫瘤篩查，診斷，治療與預(yù)后提供新的綜合性試劑盒，方便臨床應(yīng)用。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖I :miR-93在卵巢良性腫瘤、惡性腫瘤血清樣本中與正常血清相比表達(dá)差異倍數(shù)。左側(cè)代表惡性腫瘤血清與正常血清相比的平均差異倍數(shù)，右側(cè)代表良性腫瘤血清與正常血清相比的平均差異倍數(shù)。圖2 miR-93在卵巢良性腫瘤、惡性腫瘤以及正常對(duì)照的血清樣本中差異性表達(dá)的相關(guān)性。(相關(guān)性分析在p=0. 01水平上，SPSS17. O軟件，以及origin8. O軟件)。圖3 :在不同病理指標(biāo)下，miR-93在卵巢腫瘤患者的血清和卵巢正常血清中表達(dá)的相關(guān)性。其中age彡51/ < 51 :miR_93在卵巢腫瘤血清中的差異性表達(dá)與患病年齡的相關(guān)性分析，即miR-93在年齡小于51和年齡大于或等于51的卵巢腫瘤患者血清中的表達(dá)差異性分析。其中Grade (病理分期)I - II / III - IV miRNA在卵巢腫瘤血清中的差異性表達(dá)與卵巢腫瘤病理分級(jí)的相關(guān)性分析，即miR-93在卵巢腫瘤血清在I和II與III和IV之間的表達(dá)差異相關(guān)性。其中CA-125-/+ :miR_93在卵巢腫瘤血清中的差異性表達(dá)與CA-125水平的相關(guān)性分析。即miR-93在卵巢腫瘤血清CA-125-( ( 35U/ml)和CA-125+( > 35U/ml)上表達(dá)差異相關(guān)性。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所提供的血清miRNA標(biāo)記物在制備檢測卵巢腫瘤的臨床診斷試劑盒中應(yīng)用的具體方法如下一、實(shí)驗(yàn)樣本
本發(fā)明所使用的腫瘤組織和血清樣本來自2007年11月 2008年12月間在浙江省腫瘤醫(yī)院接受治療的卵巢腫瘤患者的全血。入住患者要求有明確的細(xì)胞學(xué)診斷，手術(shù)前未經(jīng)任何放療、化療及內(nèi)分泌治療，手術(shù)后有完整的臨床及病理資料。本發(fā)明所采用的正常對(duì)照樣本來自卵巢腫瘤患者的癌旁正常組織，正常血清對(duì)照樣本來自健康志愿者。入組志愿者均經(jīng)問卷調(diào)查和嚴(yán)格體檢無卵巢腫瘤及其相關(guān)婦科腫瘤家族病理史且無卵巢腫瘤患病風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)臨床分期、分化程度、CA-125水平對(duì)卵巢惡性腫瘤與良性腫瘤患者的樣本信息分類匯總?cè)绫鞩所示?；颊吣挲g21-76歲，中位年齡為51歲，小于51歲的患者24例(惡性7例)，大于和等于51歲的患者29例(惡性24例)，年齡不清的I例。在31例惡性腫瘤病例中卵巢漿液性腺癌為17例，卵巢漿液性乳頭狀腺癌為8
例，卵巢黏液性腺癌為4例，卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌為2例；病理分級(jí)I級(jí)者3例，病理分級(jí)II級(jí)者4例，III級(jí)者20例，病理IV級(jí)患者4例；低分化為9例，中低分化為10例，中分化I例，高分化為I例，分化程度不明者為10例；在CA-125水平上，低于35U/ml為2例，高于35U/ml為29例ο在23例良性腫瘤患者中，漿液性腫瘤為5例，黏液性為4例，子宮內(nèi)膜樣腫瘤為10例，卵巢冠囊腫為2例，卵巢卵泡細(xì)胞瘤為I例，卵巢乳頭性腫瘤為I例。在CA-125水平上，低于35U/ml為11例，高于35U/ml為12例。表I卵巢腫瘤病人的臨床病理信息
權(quán)利要求
1.一種檢測卵巢腫瘤的血清學(xué)生物標(biāo)記物miR-93，其特征是miRNA序列為 miR-93 :caaagugcuguucgugcagguag。
2.如權(quán)利要求I所述的檢測卵巢腫瘤的血清學(xué)生物標(biāo)記物miR-93的用途，其特征是制備用于篩查卵巢腫瘤或輔助卵巢腫瘤病理鑒定和臨床診斷的試劑盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測卵巢腫瘤的血清學(xué)生物標(biāo)記物的用途，其特征是所述試劑盒包括反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)和引物系統(tǒng)/引物探針系統(tǒng)； 所述反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)包括反轉(zhuǎn)錄酶、反轉(zhuǎn)錄體系緩沖液和RNA酶抑制劑； 所述引物系統(tǒng)由miR-93的莖環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物、cDNA擴(kuò)增引物以及miR-16的莖環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物、擴(kuò)增引物組成； 所述引物探針系統(tǒng)由miR-93的莖環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物、cDNA擴(kuò)增引物和探針以及miR-16的莖環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物、擴(kuò)增引物和探針組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測卵巢腫瘤的血清學(xué)生物標(biāo)記物的用途，其特征是所述試劑盒還包括擴(kuò)增系統(tǒng)；所述擴(kuò)增系統(tǒng)包括含Taq酶的miRNA表達(dá)定量檢測混合液。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的檢測卵巢腫瘤的血清學(xué)生物標(biāo)記物的用途，其特征是檢測該標(biāo)志物的技術(shù)為基于莖環(huán)的反轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR技術(shù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測卵巢腫瘤的血清學(xué)生物標(biāo)記物的用途，其特征是miR-93莖環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物由以下核苷酸序列組成GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTACCTo
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測卵巢腫瘤的血清學(xué)生物標(biāo)記物的用途，其特征是所述熒光定量PCR為DNA染料法或TaqMan探針法。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測卵巢腫瘤的血清學(xué)生物標(biāo)記物的用途，其特征是miR-93的cDNA擴(kuò)增引物為 miR-93 PCR 正向引物CGCGGCAAAGTGCTGTTC ； miR-93 PCR 反向引物CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測卵巢腫瘤的血清學(xué)生物標(biāo)記物的用途，其特征是miR-93的探針由以下核苷酸序列組成(6-FAM) ACTGGATACGACCTACCT (MGB)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測卵巢腫瘤的血清學(xué)生物標(biāo)記物的用途，其特征是在熒光定量PCR方法中，使用保守性miRNA的miR-16作為內(nèi)參照基因，miR-16的序列、莖環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物、擴(kuò)增引物及探針為序列uauugcacuugucccggccugu ； 莖環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCCAATA ； PCR 正向引物ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACGTAAATA ； PCR 反向引物TGGTGTCGTGGAGTCG ；探針(6-FAM) TTCAGTTGAGCGCCAATA (MGB)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測卵巢腫瘤的血清學(xué)生物標(biāo)記物miR-93，其miRNA序列為caaagugcuguucgugcagguag。本發(fā)明還同時(shí)公開了上述標(biāo)記物miR-93的用途，制備用于篩查卵巢腫瘤或輔助卵巢腫瘤病理鑒定和臨床診斷的試劑盒。試劑盒包括反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)和引物系統(tǒng)/引物探針系統(tǒng)；反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)包括反轉(zhuǎn)錄酶、反轉(zhuǎn)錄體系緩沖液和RNA酶抑制劑；引物系統(tǒng)由miR-93的莖環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物、cDNA擴(kuò)增引物以及miR-16的莖環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物、擴(kuò)增引物組成；引物探針系統(tǒng)由miR-93的莖環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物、cDNA擴(kuò)增引物和探針以及miR-16的莖環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物、擴(kuò)增引物和探針組成。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102851389SQ201210382160
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月9日
發(fā)明者丁先鋒, 紀(jì)婷, 蔣理想, 李瑞東, 陳瑩 申請(qǐng)人:浙江理工大學(xué)