專利名稱：高選擇性基因突變檢測方法及其引物與引物設(shè)計(jì)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因突變的檢測，特別涉及高選擇性基因突變檢測方法及其引物與引物設(shè)計(jì)方法。
背景技術(shù)：
基因突變是指基因組DNA分子發(fā)生的突然的、可遺傳的變異現(xiàn)象。從分子水平上看，基因突變是指基因在結(jié)構(gòu)上發(fā)生堿基對組成或排列順序的改變。基因突變的研究已成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，檢測方法也隨之迅速發(fā)展。目前市面上針對基因檢測的方法有許多。但是在較高的野生型模板的背景下，針對較低含量的基因突變的檢測能力有·限，因此針對基因稀有突變的檢測還存在諸多的挑戰(zhàn)。基因稀有突變，顧名思義指的是存在大于量野生基因序列背景中的極為稀少突變基因序列。在臨床案例中，癌癥初期或是治療后病人血液中含有少量的腫瘤突變DNA ;孕婦外周血含有少量的胎兒DNA等，這些情況都屬于稀有突變。許多引起腫瘤的體細(xì)胞突變都是摻雜在野生型細(xì)胞內(nèi)的，所提的DNA也是帶有大量野生型DNA，同樣需要采用稀有突變的檢測方法。因此，基因稀有突變檢測在疾病防治醫(yī)療評價(jià)、無創(chuàng)產(chǎn)前篩查等具有十分重要的意義。目前稀有突變檢測方法中，主要有作為“金標(biāo)準(zhǔn)”的基因測序。但是測序靈敏度有限，在大量野生型基因的背景下，測序僅能檢測到含有20%的突變，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果，而且耗時(shí)較長。相較于測序，變性高效液相色譜的靈敏度有所提高，但是需要PCR后處理，容易造成實(shí)驗(yàn)室污染，容易導(dǎo)致假陽性結(jié)果，特異性也有所限制，并且操作步驟繁雜，周期長?；诤怂犭s交原理的檢測方法，比如Taqman探針，其選擇性檢測水平與測序法相當(dāng)。擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)(ARMS)是常用的稀有突變檢測方法，基于引物3’末端堿基對不同錯(cuò)配堿基的分辨能力特異性選擇擴(kuò)增突變型模板，但由于分辨能力有限導(dǎo)致選擇性一般且不同類型的突變差異性較大。2011年Life technology公司開發(fā)出一種高選擇性突變檢測技術(shù)一cast PCR技術(shù)，該技術(shù)基于ARMS技術(shù)，采用MGB探針的高特異性進(jìn)一步提高了反應(yīng)的選擇性。但是MGB探針合成難度較大，費(fèi)用較高，不利于廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明的第一目的在于提供高選擇性基因突變檢測方法，所述高選擇性基因突變檢測方法可選擇性擴(kuò)增基因突變產(chǎn)物，通過抑制野生型擴(kuò)增，達(dá)到富集稀有突變產(chǎn)物的目的，從而實(shí)現(xiàn)對稀有突變的高效檢測。本發(fā)明的第二目的在于提供高選擇性基因突變檢測引物。本發(fā)明的第三目的在于提供高選擇性基因突變檢測引物設(shè)計(jì)方法。所述高選擇性基因突變檢測方法包括根據(jù)目標(biāo)基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)的上游引物與下游引物，用所述上游引物與下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，從而檢測目標(biāo)基因突變位點(diǎn)。所述上游引物包括標(biāo)簽序列，所述標(biāo)簽序列與野生型模板的上游引物延伸序列中突變位點(diǎn)所在位置反向互補(bǔ)。所述上游引物更包括特異雜交序列，所述特異雜交序列與基因組模板序列互補(bǔ)雜交引導(dǎo)擴(kuò)增，所述下游引物與基因組模板序列互補(bǔ)雜交引導(dǎo)擴(kuò)增。所述上游引物至少分為兩個(gè)區(qū)域，所述標(biāo)簽序列位于區(qū)域1，所述特異雜交序列位于區(qū)域2。所述PCR擴(kuò)增可采用實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增并通過探針實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。所述高選擇性基因突變檢測引物包括上游引物與下游引物，其中，所述上游引物包括標(biāo)簽序列，所述標(biāo)簽序列與野生型模板的上游引物延伸序列中突變位點(diǎn)所在位置反向互補(bǔ)。所述上游引物更包括一特異雜交序列，所述特異雜交序列與基因組模板序列互補(bǔ)雜交引導(dǎo)擴(kuò)增，所述下游引物與基因組模板序列互補(bǔ)雜交引導(dǎo)擴(kuò)增。所述上游引物至少分為 兩個(gè)區(qū)域，所述標(biāo)簽序列位于區(qū)域1，所述特異雜交序列位于區(qū)域2。所述高選擇性基因突變檢測引物設(shè)計(jì)方法包括根據(jù)目標(biāo)基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)的上游引物與下游引物，在上游引物設(shè)計(jì)標(biāo)簽序列，所述標(biāo)簽序列與野生型模板的上游引物延伸序列中突變位點(diǎn)所在位置反向互補(bǔ)。所述上游引物更包括一特異雜交序列，所述特異雜交序列與基因組模板序列互補(bǔ)雜交引導(dǎo)擴(kuò)增，所述下游引物與基因組模板序列互補(bǔ)雜交引導(dǎo)擴(kuò)增。所述上游引物至少分為兩個(gè)區(qū)域，所述標(biāo)簽序列位于區(qū)域1，所述特異雜交序列位于區(qū)域2。本發(fā)明設(shè)計(jì)了高選擇性基因突變檢測引物，通過抑制野生型擴(kuò)增，達(dá)到富集稀有突變產(chǎn)物的目的，從而實(shí)現(xiàn)對稀有突變的高效檢測。本發(fā)明中的高選擇性基因突變檢測方法具有高特異性，針對突變型模板設(shè)計(jì)的引物對可以耐受5000拷貝甚至更高拷貝數(shù)的野生型模板。同時(shí)，本發(fā)明可檢測個(gè)位數(shù)拷貝的突變型模板，具有很高的靈敏度。本發(fā)明中檢測方法選擇性高，可有效檢出突變含量為1/1000的模板。本發(fā)明成本低，僅需要一對引物即可實(shí)現(xiàn)選擇性擴(kuò)增。


圖I為本發(fā)明技術(shù)方案原理圖。在圖I中，1、2為區(qū)域I和區(qū)域2，分別為上游引物的標(biāo)簽序列與特異雜交序列所在區(qū)域，3為野生型模板的上游引物延伸序列中突變位點(diǎn)所在位置，4、7為基因組模板序列,8為雙鏈DNA,6為下游引物，I’為互補(bǔ)鏈3端序列,5為互補(bǔ)序列，GC為野生型基因位點(diǎn)，GA為突變的基因位點(diǎn)；
圖2A為野生型模板梯度稀釋檢測結(jié)果圖，在圖2A中，橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光值，野生型模板梯度濃度分別為5000拷貝、500拷貝、50拷貝、5拷貝；
圖2B為突變型模板梯度稀釋檢測結(jié)果圖，在圖2B中，橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光值，I、2、3、4分別為突變型模板梯度濃度分別為5000拷貝、500拷貝、50拷貝、5拷貝時(shí)的檢測曲線；
圖3為梯度稀釋突變型模板與野生型模板摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。在圖3中，橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光值，1、2、3、4分別為突變型與野生型比例分別為I: I、1:10、1:100、1:1000時(shí)的檢測曲線；圖4A為突變型模板梯度稀釋檢測結(jié)果圖，在圖4A中，橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光值，I、2、3、4分別為突變型模板梯度濃度分別為5000拷貝、500拷貝、50拷貝、5拷貝時(shí)的檢測曲線；
圖4B為野生型模板梯度稀釋檢測結(jié)果圖，在圖2B中，橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光值，野生型模板梯度濃度分別為5000拷貝、500拷貝、50拷貝、5拷貝；
圖5為梯度稀釋突變型模板與野生型模板摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。在圖5中，橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光值，1、2、3、4分別為突變型與野生型比例分別為I: I、1:10、1:100、1:1000時(shí)的檢測曲線。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
如圖I所示，針對待檢測的目標(biāo)基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)的上游引物與下游引物。上游引物包括區(qū)域I和區(qū)域2，區(qū)域I為標(biāo)簽序列，與野生型模板的上游引物延伸序列中突變位點(diǎn)所在位置(簡稱為延伸產(chǎn)物序列)3反向互補(bǔ)，區(qū)域2為特異雜交序列，與基因組模板序列4互補(bǔ)雜交引導(dǎo)擴(kuò)增，下游引物6與基因組模板序列7互補(bǔ)雜交引導(dǎo)擴(kuò)增?；蚪M模板序列4基因組模板序列7均來自解鏈的雙鏈DNA 8。上游引物在擴(kuò)增的前兩個(gè)循環(huán)無差別的擴(kuò)增野生型模板及突變型模板，第三個(gè)循環(huán)開始，上游引物區(qū)域I的標(biāo)簽序列在退火階段與其延伸產(chǎn)物序列3形成內(nèi)部頸環(huán)結(jié)構(gòu)，野生型模板中，其互補(bǔ)鏈3端序列I’與序列5完全互補(bǔ)雜交形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)，該3端以自身序列為模板延伸下去形成非常穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，該產(chǎn)物在之后的循環(huán)中不能被擴(kuò)增，其中頸部(區(qū)域I)長度為6-18nt，形成二級結(jié)構(gòu)的Tm值為60°C _75°C，環(huán)部長度為25_60nt ;突變型模板中，其互補(bǔ)鏈3端序列I’與序列5仍可雜交形成頸環(huán)，但3端第一個(gè)堿基與突變位點(diǎn)堿基不匹配(如圖I中，GC突變?yōu)镚A)，不能延伸形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)。因此，突變型模板擴(kuò)增產(chǎn)物可持續(xù)被有效擴(kuò)增，從而達(dá)到抑制野生型擴(kuò)增，富集突變產(chǎn)物的目的。實(shí)施例I
選擇SNP (rsl3182883)為研究對象，其基因型A為野生型，基因型G為突變型，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物和探針如下
引物 F TGAGGATTTGCTGGCCTGCAGTGAGCATT引物 R CTGACAATCCTTGGTCTGCT檢測探針FAM-GAAGAAAGTAACGGAGAGCCTG-BHQ
為了考察該方法的特異性，10倍梯度稀釋純合野生的模板1，得到濃度分別為1000拷貝/ μ L、100拷貝/ μ L、10拷貝/ μ L、I拷貝/ μ L的野生型模板；為了考察該方法靈敏度，10倍梯度稀釋純合突變的模板2，得到濃度分別為1000拷貝/ μ L、100拷貝/ μ L、10拷貝/ μ L、I拷貝/ μ L的突變型模板。25 μ L PCR 反應(yīng)體系內(nèi)含 5μ L 人基因組模板，75 mmol/L Tris-HCl pH 9. 0,20mmol/L(NH4)2S04,0. 01% Tween 20，50 mmol/L KCl, I U 熱啟動(dòng) Taq 酶，3. 5 mmol/L Mg2+，0. 2 μπιοΙ/L檢測探針,0. 04ymol/L上游引物,0.4 μπιο /下游引物。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C 3分鐘；95°C 15秒，52°C 25秒，72°C 20秒，50個(gè)循環(huán)；52°C退火階段采集熒光信號。圖2A顯示結(jié)果為梯度稀釋的野生型模板均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，而同一次實(shí)驗(yàn)的梯度稀釋的突變型模板出現(xiàn)梯度擴(kuò)增曲線，其Ct值(每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))隨著模板量的減少而變大，無模板的陰性質(zhì)控未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。該體系中的引物理論上應(yīng)選擇性擴(kuò)增突變型模板，抑制野生型模板的擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論推測較一致，說明該技術(shù)具有較高的特異性，即野生型模板的擴(kuò)增被有效抑制，突變型的模板擴(kuò)增良好；圖2B顯示該技術(shù)可以最低檢測到個(gè)位數(shù)拷貝的突變型模板，體現(xiàn)較高的靈敏度。
實(shí)施例2
模擬稀有突變型模板檢測的摻入實(shí)驗(yàn)如下稀釋一組濃度分別為2000拷貝/ μ L、200拷貝/μ L、20拷貝/μ L、2拷貝/μ L的突變型模板，該組突變型模板分別摻入等體積的濃度為2000拷貝/ μ L野生型模板中，得到突變型與野生型比例分別為I: I、1:10、1:100、1:1000的模板。25 μ L PCR 反應(yīng)體系內(nèi)含 5μ L 人基因組模板，75 mmol/L Tris-HCl pH 9. 0,20 mmol/L(NH4)2S04,0. 01% Tween 20，50 mmol/L KCl, I U 熱啟動(dòng) Taq 酶，3. 5 mmol/L Mg2+，0. 2 μπιο /L檢測探針,0. 04ymol/L上游引物,0.4 μπιο /下游引物。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C 3分鐘；95°C 15秒，52°C 25秒，72°C 20秒，50個(gè)循環(huán)；52°C退火階段采集熒光信號。圖3顯示四組摻入的模板擴(kuò)增曲線良好，呈現(xiàn)一定的梯度，其線性關(guān)系良好，無模板的陰性質(zhì)控未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，該模擬實(shí)驗(yàn)說明本技術(shù)方案可以檢測到突變型與野生型比例為1:1000的模板，且仍有潛力實(shí)現(xiàn)更高的選擇性。實(shí)施例3
選擇K-ras基因第12密碼子基因突變?yōu)檠芯繉ο?，該密碼子野生型為GGT，突變型為CGT，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要合成基因序列如下
野生型模板
TCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCACCAGCTCCAACTACCACAAGTTTATATTCAGTCATTTTCAGCAGGCCTTATAATAAAAATAATGAAAATGTGACTATATTAGAACATGTCACACATAAGGTTAATACACTATCAAATACTCCACCAGTACCTTTTAATA突變型模板
TCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCACGAGCTCCAACTACCACAAGTTTATATTCAGTCATTTTCAGCAGGCCTTATAATAAAAATAATGAAAATGTGACTATATTAGAACATGTCACACATAAGGTTAATACACTATCAAATACTCCACCAGTACCTTTTAATA設(shè)計(jì)引物、探針序列如下
上游引物GGTGGCGTAGGTATCGTCAAGGCACTCTTGC 下游引物GGAGTAITTG ATAGTGTATTAACCTTATGT 檢測探針FAM-CTCCAACTACCACAAGITTATATTCAGTC-BHQ
10倍梯度稀釋純合野生型模板3，得到濃度分別為1000拷貝/ μ L、100拷貝/ μ L、10拷貝/ μ L、I拷貝/ μ L的野生型模板；10倍梯度稀釋純合突變的模板4，得到濃度分別為1000拷貝/y L、100拷貝/ μ L、10拷貝/ μ L、1拷貝/ μ L的突變型模板，以此進(jìn)一步驗(yàn)證該技術(shù)的特異性和靈敏度。25 μ L PCR 反應(yīng)體系內(nèi)含 5μ L 人基因組模板，75 mmol/L Tris-HCl pH 9. 0,20mmol/L (NH4) 2S04，O. 01% Tween 20，50 mmol/L KCl, I U 熱啟動(dòng) Taq 酶，3mmol/L Mg2+，O. 25 μ mol/L檢測探針，O. 04 ymol/L上游引物，O. 4 μπιο /下游引物。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95°C 3分鐘；95°C 15秒，55°C 25秒，72°C 20秒，50個(gè)循環(huán)；55°C退火階段采集熒光信號。圖4A顯示結(jié)果為梯度稀釋的野生型模板均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，而同一次實(shí)驗(yàn)的梯度稀釋的突變型模板出現(xiàn)梯度擴(kuò)增曲線，其Ct值隨著模板量的減少而變大，無模板的陰性質(zhì)控未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。該體系中的引物理論上應(yīng)選擇性擴(kuò)增突變型模板，抑制野生型模板的擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論推測較一致，再次體現(xiàn) 該技術(shù)具有較高的特異性；圖4B顯示該技術(shù)可以最低檢測到個(gè)位數(shù)拷貝的突變型模板，體現(xiàn)較高的靈敏度。
實(shí)施例4
模擬稀有突變模板檢測的摻入實(shí)驗(yàn)如下稀釋一組濃度分別為2000拷貝/ μ L、200拷貝/ μ L、20拷貝/ μ L、2拷貝/ μ L的K_ras突變型模板，該組突變型模板分別摻入等體積的濃度為2000拷貝/ μ L的K-ras野生型模板中，得到突變型與野生型比例分別為I: I、1:10、1:100、1:1000 的模板。25 μ L PCR 反應(yīng)體系內(nèi)含 5μ L 人基因組模板，75 mmol/L Tris-HCl pH 9. 0,20mmol/L (NH4) 2S04，O. 01% Tween 20，50 mmol/L KCl, I U 熱啟動(dòng) Taq 酶，3mmol/L Mg2+，
0.25 μ mol/L檢測探針，0.04 μ mol/L上游引物，0.4 μπιο /下游引物。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95°C 3分鐘；95°C 15秒，55°C 25秒，72°C 20秒，50個(gè)循環(huán)；55°C退火階段采集熒光信號。圖5顯示四組摻入的模板擴(kuò)增曲線良好，呈現(xiàn)一定的梯度，無模板的陰性質(zhì)控未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，該模擬實(shí)驗(yàn)再次說明本技術(shù)方案可以檢測到突變型與野生型比例為1:1000的模板，且仍有潛力實(shí)現(xiàn)更高的選擇性。本發(fā)明的關(guān)鍵在于野生型模板的上游引物中的標(biāo)簽序列與上游引物擴(kuò)增產(chǎn)物的部分序列形成內(nèi)部頸環(huán)結(jié)構(gòu)，該頸環(huán)結(jié)構(gòu)在擴(kuò)增過程中形成非常穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，阻止野生型模板的擴(kuò)增，并實(shí)現(xiàn)對模板中稀有突變的富集，從而高選擇性地檢測稀有突變。以上只是本發(fā)明技術(shù)方案的具體舉例，只要引物符合上述結(jié)構(gòu)，本發(fā)明同樣適應(yīng)于除實(shí)施例外的其它基因突變的檢測，因此，本發(fā)明實(shí)施例不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.高選擇性基因突變檢測方法，其特征在于，所述高選擇性基因突變檢測方法包括根據(jù)目標(biāo)基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)的上游引物與下游引物，所述上游引物包括標(biāo)簽序列，所述標(biāo)簽序列與野生型模板的上游引物延伸序列中突變位點(diǎn)所在位置反向互補(bǔ)；用所述上游引物與下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，從而檢測目標(biāo)基因突變位點(diǎn)。
2.如權(quán)利要求I所述的高選擇性基因突變檢測方法，其特征在于，所述上游引物更包括特異雜交序列，所述特異雜交序列與基因組模板序列互補(bǔ)雜交引導(dǎo)擴(kuò)增，所述下游引物與基因組模板序列互補(bǔ)雜交引導(dǎo)擴(kuò)增。
3.如權(quán)利要求I所述的高選擇性基因突變檢測方法，其特征在于，所述上游引物至少分為兩個(gè)區(qū)域，所述標(biāo)簽序列位于區(qū)域1，所述特異雜交序列位于區(qū)域2。
4.如權(quán)利要求I所述的高選擇性基因突變檢測方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增采用實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增并通過探針實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
5.高選擇性基因突變檢測引物，包括上游引物與下游引物，其特征在于，所述上游引物包括標(biāo)簽序列，所述標(biāo)簽序列與野生型模板的上游引物延伸序列中突變位點(diǎn)所在位置反向互補(bǔ)。
6.如權(quán)利要求5所述的高選擇性基因突變檢測引物，其特征在于，所述上游引物更包括一特異雜交序列，所述特異雜交序列與基因組模板序列互補(bǔ)雜交引導(dǎo)擴(kuò)增，所述下游引物與基因組模板序列互補(bǔ)雜交引導(dǎo)擴(kuò)增。
7.如權(quán)利要求5所述的高選擇性基因突變檢測引物，其特征在于，所述上游引物至少分為兩個(gè)區(qū)域，所述標(biāo)簽序列位于區(qū)域1，所述特異雜交序列位于區(qū)域2。
8.高選擇性基因突變檢測引物設(shè)計(jì)方法，其特征在于，包括根據(jù)目標(biāo)基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)的上游引物與下游引物，在上游引物設(shè)計(jì)標(biāo)簽序列，所述標(biāo)簽序列與野生型模板的上游引物延伸序列中突變位點(diǎn)所在位置反向互補(bǔ)。
9.如權(quán)利要求8所述的高選擇性基因突變檢測引物設(shè)計(jì)方法，其特征在于，所述上游引物更包括一特異雜交序列，所述特異雜交序列與基因組模板序列互補(bǔ)雜交引導(dǎo)擴(kuò)增，所述下游引物與基因組模板序列互補(bǔ)雜交引導(dǎo)擴(kuò)增。
10.如權(quán)利要求8所述的高選擇性基因突變檢測引物設(shè)計(jì)方法，其特征在于，所述上游引物至少分為兩個(gè)區(qū)域，所述標(biāo)簽序列位于區(qū)域1，所述特異雜交序列位于區(qū)域2。
全文摘要
高選擇性基因突變檢測方法及其引物與引物設(shè)計(jì)方法，涉及基因突變的檢測，提供高選擇性基因突變檢測方法，所述高選擇性基因突變檢測方法包括根據(jù)目標(biāo)基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)的上游引物與下游引物，用所述上游引物與下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，從而獲知目標(biāo)基因突變位點(diǎn)。所述高選擇性基因突變檢測引物包括上游引物與下游引物，其中，所述上游引物包括標(biāo)簽序列，所述標(biāo)簽序列與野生型模板的上游引物延伸序列中突變位點(diǎn)所在位置反向互補(bǔ)。本發(fā)明設(shè)計(jì)了高選擇性基因突變檢測引物，通過抑制野生型擴(kuò)增，達(dá)到富集稀有突變產(chǎn)物的目的，從而實(shí)現(xiàn)對稀有突變的高效檢測。
文檔編號C12N15/10GK102876795SQ20121038340
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月11日
發(fā)明者王小波 申請人:廈門基科生物科技有限公司