專利名稱：一種烏雞肽鐵螯合物生物補鐵劑的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種烏雞肽鐵螯合物生物補鐵劑的制備方法，屬于現(xiàn)代食品加工生物技術領域。
背景技術：
鐵是人體必需的化學元素之一，人體缺鐵或鐵利用不良時會影響血紅蛋白的合成，引起缺鐵性貧血(iron deficiency anemia, IDA)。缺鐵性貧血對人體有很大的危害，缺鐵會顯著降低小兒的智力和生長發(fā)育，使人的免疫功能、體力、耐力下降；流行病學調查顯示母親貧血與低體重兒、早產(chǎn)兒和產(chǎn)期嬰兒的死亡率相關。全世界約有10% 30%的人群有不同程度的缺鐵，其中多為婦女、兒童和老人，而在發(fā)展中國家這個比例會更高。目前利用補鐵劑強化食品是防治IDA的主要手段。硫酸亞鐵等非血紅素鐵價格低廉，但易與食物中植酸、多酚等成分形成難溶性化合物，吸收率較低，并易產(chǎn)生內源性自由基導 致細胞膜脂質過氧化。血紅素鐵比非血紅素鐵的利用率高，但最高也只達25%左右并具有異味。我國目前大部分補鐵劑吸收利用率較低，有一定毒副作用，尋求一種口感好、高吸收、安全無毒副作用的補鐵劑非常必要?；钚噪蔫F是以蛋白質水解產(chǎn)生的分子活性肽為原料，與鐵離子絡合形成的螯合物。與氨基酸相比，肽的吸收效率更高且不易飽和。以活性肽為原料開發(fā)吸收利用率更高、生理作用更強的新型補鐵劑，正成為目前國內外研究的一個熱點。目前國內此類專利申請，如乳蛋白酶解液與亞鐵鹽螯合(200810240344. 4)、酪蛋白肽螯合鐵(201010040074.X)、椰子球蛋白亞鐵絡合物制備補鐵劑(201010203183. 9)、卵鐵離子傳遞蛋白補鐵劑(200610012762. 9)等，然而，這些物質多屬于蛋白酶解物與鐵的螯合，組成成分的分子量不清，而一般蛋白酶解物的分子量常高于5000Da，在人體吸收利用率和生理活性方面差強人意。此外，目前專利在鐵螯合物的制備上常忽視對亞鐵離子易氧化成為三價鐵離子的防護，而三價鐵離子螯合物與二價鐵離子相比具有吸收利用率低、易產(chǎn)生氧化損傷的劣勢。烏雞是我國家禽品種基因庫中具有特殊經(jīng)濟價值的珍禽，具有特殊的營養(yǎng)滋補與藥用價值?！侗静萁?jīng)疏》記載“烏骨雞補血益陰，則虛勞贏弱可除；陰回熱去，則津液自生，渴白止矣；陰平陽秘，表里固密，邪惡之氣不得入，心腹和而痛自止。益陰，則沖、任、帶三脈俱旺，故能除崩中帶下一切虜損諸疾也?！闭f明烏雞有補血益陰、除慮退熱之功效?？梢姡瑸蹼u為補血益陰之上品。烏雞主要化學成分為蛋白質、脂肪、鈣、磷、鐵、鎂、維生素B1、B2等。烏雞鮮肉中含17種氨基酸，其中13種氨基酸含量較高，是獲取生物活性肽的寶貴資源。傳統(tǒng)中醫(yī)理論表明，烏雞具有補血、益氣、滋陰等功效，近期研究還證實具有抗氧化、延緩衰老、增強抗誘變能力以及提高免疫的作用。烏雞肽，又稱烏雞低聚肽，是以烏雞蛋白為原料，酶解后獲得的低分子量肽產(chǎn)物。低聚肽吸收速度快、耗能低、易于被人體消化、吸收和利用，具有降血壓、抗氧化、抗疲勞、免疫調節(jié)等重要的生理活性?！稙蹼u低聚肽體外抗氧化活性研究》(《食品與發(fā)酵工業(yè)》，2010年第36卷第10期，2010/10，P19-22，劉文穎等)中對烏雞低聚肽的理化成分、分子量分布、氨基酸組成、自由基清除作用、還原能力等進行了深入報道。研究表明，烏雞肽中小分子蛋白質含量較高、分子量大多IOOODa以下，含量最高的是140-500Da小肽，富含抗氧化性氨基酸，具有較強的清除自由基能力和還原能力。中國專利申請201110131377. 7 “一種烏雞低聚肽的制備及其活性肽段分離、鑒定方法”，公開了一種烏雞低聚肽的制備方法，包括前處理、酶解、分離提純、干燥制得的粉末狀產(chǎn)品，相對分子質量低于IOOODa的活性肽比例占90%以上，具有抗氧化、降血壓等生物活性。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于利用小分子的烏雞低聚肽與亞鐵鹽進行螯合，提供一種新型烏雞肽鐵螯合物的制備方法。本發(fā)明補鐵劑生物吸收利用率高，由于小分子烏雞肽的絡合和
促進吸收作用，具有補鐵率高的優(yōu)勢，還具有抗氧化、免疫調節(jié)的功能。本發(fā)明是通過將烏雞肽溶液與亞鐵鹽恒溫下螯合來實現(xiàn)的。因此，本發(fā)明制備方法的技術方案包括在烏雞肽溶液中加入抗壞血酸，并且在PH3-6的條件下，將烏雞肽溶液與亞鐵鹽恒溫下螯合。本發(fā)明方法中，關鍵是烏雞肽與亞鐵離子的螯合步驟中，添加抗壞血酸，并且螯合過程在PH3-6下恒溫進行，以便防止亞鐵離子被氧化為三價鐵離子。具體說，本發(fā)明提供一種烏雞肽鐵螯合物的制備方法，包括如下步驟I)配制配制烏雞肽溶液；2)螯合加入抗壞血酸，加入亞鐵鹽，調節(jié)pH值至3-6，恒溫下螯合；3)沉淀將螯合液用無水乙醇進行沉淀，得到烏雞肽鐵螯合物。其中，烏雞肽與亞鐵離子的螯合需要在溶液中進行，可以直接使用烏雞肽溶液來實施本發(fā)明方法。通常，烏雞肽產(chǎn)品是以烏雞肽干粉的形式存在，因此需要進行烏雞肽溶液的配制。溶液的配置可以按照常規(guī)方法配制，例如，稱取一定量的烏雞肽置于反應容器中，加入定量水，攪拌使其充分溶解。烏雞肽的濃度可以是任意的，只要是肽螯合鐵技術中的常用的肽溶液濃度即可。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，將烏雞肽與水按照2 100-6 100比例進行配制，制得濃度為2%-6% (單位為g/mL)的烏雞肽溶液，更有利于烏雞肽與亞鐵離子的充分有效螯合。首選，烏雞肽的濃度為3%-5%。螯合亞鐵離子的步驟中，首先加入一定質量的抗壞血酸，溶解于烏雞肽溶液中，防止后面加入的亞鐵離子在溶液中被氧化為三價鐵離子，抗壞血酸是很好的抗氧化劑?？箟难岬臐舛仁潜绢I域技術人員任意選擇的，只要達到能夠防止亞鐵離子在溶液中被氧化為三價鐵離子的濃度即可。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，加入抗壞血酸于烏雞肽溶液中溶解，使其在溶液中的濃度達到O. 5% -I. 5% (重量百分比)，濃度過高容易影響烏雞肽與亞鐵離子的螯合效果，濃度過低不能充分防止亞鐵離子的氧化，首選，抗壞血酸在烏雞肽溶液的濃度是
O.8% -I. 2%。然后，加入亞鐵鹽，攪拌使其充分溶解，調整pH值為3-6，恒溫進行螯合反應。
烏雞肽與亞鐵鹽的比例可以是任意的，只要是肽螯合鐵技術中的常用比例即可。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，烏雞肽與亞鐵鹽的質量比為3 1-1 I。螯合反應在恒溫下進行是必需的，如果需要的話，反應過程中可以保持密閉環(huán)境，以避免亞鐵離子被氧化。螯合反應的溫度和時間是本領域技術人員可以確定的，可以在肽螯合鐵技術中的常用條件范圍內選擇，能夠達到肽與亞鐵離子的螯合即可。優(yōu)選，螯合在30-60°C下恒溫反應20_40min。本發(fā)明螯合步驟中所用的亞鐵鹽可以是本領域常用的任何亞鐵鹽，優(yōu)選選自硫酸亞鐵或氯化亞鐵。沉淀步驟包括將螯合液用無水乙醇進行沉淀，沉淀的目的是用無水乙醇對螯合物進行沉淀洗滌，以便除去未反應的游離亞鐵離子。 無水乙醇的添加量可以是任意的，只要能夠達到去除游離亞鐵離子的效果即可。在一個優(yōu)選方案中，用螯合液2-4倍體積的無水乙醇進行沉淀，沉淀過程可以是靜置沉淀l_2h，得到烏雞肽鐵螯合物沉淀物，在本發(fā)明的一個優(yōu)選方法中，在螯合步驟2)和沉淀步驟3)之間包括濃縮步驟，即螯合之后將螯合液濃縮，然后再進行沉淀處理。具體說，濃縮步驟包括將螯合液冷卻，在45_55°C下將螯合液濃縮，以便更有利于進行沉淀處理。為使產(chǎn)品易于銷售或保存，優(yōu)選，將獲得的螯合物進行干燥，得到烏雞肽鐵螯合物干粉。本發(fā)明中獲得的烏雞肽鐵螯合物中鐵離子含量經(jīng)檢測為95. 9-124. 55mg/g，溶解性實驗表明，烏雞肽鐵螯合物在中性水溶液中溶解度較小，在弱堿條件下溶解度增加。溶液澄清透明，呈淡黃褐色。經(jīng)紅外光譜鑒定分析表明，本發(fā)明中獲得的烏雞肽鐵螯合物中亞鐵離子與烏雞肽中NH2+以及-COO—形成配位鍵，是一種新型肽鐵螯合物。因此，本發(fā)明還提供一種通過本發(fā)明方法或任一種優(yōu)選方法制備而成的烏雞肽鐵螯合物。本發(fā)明的烏雞肽鐵螯合物相比現(xiàn)有技術中的蛋白酶解物與鐵的螯合物，具有補鐵效果好和生物吸收快的有益效果。研究表明，人體攝入的蛋白主要是以多肽形式從腸道直接吸收。與整蛋白和氨基酸相比，小分子短肽的吸收效率更高且不易飽和，例如二肽和三肽的吸收速度高于同一組成的氨基酸。小腸粘膜上短肽載體的發(fā)現(xiàn)以直接證據(jù)證實了二肽和三肽能被完整吸收的觀點。研究認為，動物體內對蛋白酶解產(chǎn)物的氨基酸吸收強度比相應游離氨基酸高70-80%。短肽載體的吸收能力可能高于各種氨基酸載體吸收能力的總和?，F(xiàn)有技術中的蛋白酶解物與鐵的螯合物，其中的蛋白酶解物分子量常高于5000Da，而烏雞肽中小分子蛋白質分子量大多IOOODa以下，因此，在人體吸收利用率和生理活性方面，現(xiàn)有技術的蛋白酶解物與鐵的螯合物，遠低于分子量小于IOOODa的烏雞肽與鐵的螯合。本發(fā)明的烏雞肽鐵螯合物可以按照常規(guī)技術制備成口服液、片劑、膠囊、口服顆粒劑等劑型。本發(fā)明的烏雞肽鐵螯合物中，烏雞活性肽能夠顯著提高小鼠紅細胞和血紅蛋白水平，并且提高速度明顯高于阿膠處理，具有明顯的補血作用。因此，本發(fā)明的烏雞肽鐵螯合物用于制備口服液、片劑、膠囊、顆粒劑，以小分子烏雞肽作為新型補鐵劑的原料，能夠利用烏雞的補血功效，并充分結合小分子活性肽的吸收利用率優(yōu)勢，以及烏雞肽本身的生物活性，是具有增強生物吸收和補鐵效果的新型補鐵劑。


圖I是本發(fā)明方法制備的烏雞肽鐵螯合物的烏雞肽螯合亞鐵離子前后的紅外光譜的譜圖對比，橫坐標是紅外波長，縱坐標是透光率。
具體實施例方式下面將通過具體的實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述，但不限制本發(fā)明的范圍。實施例I 烏雞肽溶液的配制稱取10. Og的烏雞肽置于反應容器中，加入250mL蒸餾水，攪拌溶解得到濃度為4%的烏雞肽溶液。螯合亞鐵離子稱取2. 5g的抗壞血酸，溶解于烏雞肽溶液中使其濃度達到1.0%，防止亞鐵離子氧化，加入IOg氯化亞鐵，使混合溶液中烏雞肽與氯化亞鐵的質量比為I : I。攪拌使其充分溶解反應，調節(jié)保持溶液PH值為5，將液體置于30°C反應罐中反應40min，反應保持密閉環(huán)境避免亞鐵離子被氧化。
濃縮反應液靜置冷卻，置于真空濃縮設備中，利用真空濃縮設備在45°C下將反應液體積縮小。沉淀及干燥在濃縮液中按照I : 4的體積比加入無水乙醇，單位為mL/mL，放置在室溫中沉淀2h，并用無水乙醇洗滌，真空干燥，得到烏雞肽鐵螯合物干粉。在上述條件下所得的補鐵劑原粉為青灰色粉末，鐵離子含量為124. 55mg/g，產(chǎn)品無異味，弱堿性條件下溶于水呈淡黃褐色透明溶液。實施例2烏雞肽溶液的配制稱取5kg烏雞肽置于反應罐中，加入100L蒸餾水，攪拌溶解制備成5%的烏雞肽溶液。螯合亞鐵離子稱取O. 8kg的抗壞血酸，溶解于烏雞肽溶液中使其濃度達到
O.8%，防止亞鐵離子氧化，稱取2. 5kg硫酸亞鐵加入混合溶液中，使混合溶液中烏雞肽與硫酸亞鐵的質量比為2 1，攪拌使其溶解。調節(jié)pH值使其保持在6左右，攪拌使其在40°C下充分反應30min。反應過程中保持密閉環(huán)境防止亞鐵離子接觸空氣氧化。濃縮反應液靜置冷卻，轉置于真空濃縮設備中，利用真空濃縮設備在50°C下將反應液體積縮小。沉淀及干燥在濃縮液中按照I : 2的比例加入無水乙醇，單位為L/L，放置在室溫中沉淀lh，并用無水乙醇洗滌，真空干燥，得到烏雞肽鐵螯合物原粉。在上述條件下所得的補鐵劑原粉為青灰色粉末，鐵離子含量為95. 90mg/g，產(chǎn)品無異味，弱堿性條件下溶于水呈淡黃褐色透明溶液?？梢詫⒃摓蹼u肽鐵螯合物原粉按照常規(guī)方法制成口服液補鐵劑。實施例3
烏雞肽溶液的配制稱取3. Okg的烏雞肽置于反應容器中，加入100L蒸餾水，攪拌溶解得到濃度為3%的烏雞肽溶液。螯合亞鐵離子稱取I. 2kg的抗壞血酸，溶解于烏雞肽溶液中使其濃度達到
I.2%，防止亞鐵離子氧化，加入I. Okg氯化亞鐵，使混合溶液中烏雞肽與氯化亞鐵的質量比為3 I。攪拌使其充分溶解反應，調節(jié)保持溶液pH值為3，將液體置于60°C反應罐中反應20min，反應保持密閉環(huán)境避免亞鐵離子被氧化。沉淀及干燥在螯合液中按照I : 3的體積比加入無水乙醇，單位為L/L，放置在室溫中沉淀2h，并用無水乙醇洗滌，真空干燥，得到烏雞肽鐵螯合物干粉。在上述條件下所得的補鐵劑原粉為青灰色粉末，鐵離子含量為99. 40mg/g，產(chǎn)品無異味，弱堿性條件下溶于水呈淡黃褐色透明溶液。
可以將該烏雞肽鐵螯合物原粉按照常規(guī)方法制成膠囊補鐵劑。實施例4烏雞肽溶液的配制稱取2g烏雞肽置于反應罐中，加入IOOmL純凈水，攪拌溶解制備成2%的烏雞肽溶液。螯合亞鐵離子稱取O. 5g的抗壞血酸，溶解于烏雞肽溶液中使其濃度達到O. 5%，防止亞鐵離子氧化，稱取2g氯化亞鐵加入混合溶液中，使混合溶液中烏雞肽與硫酸亞鐵的質量比為I : 1，攪拌使其溶解。調節(jié)pH值使其保持在6左右，攪拌使其在35°C下充分反應30min。反應過程中保持密閉環(huán)境防止亞鐵離子接觸空氣氧化。濃縮反應液靜置冷卻，轉置于真空濃縮設備中，利用真空濃縮設備在55°C下將反應液體積縮小。沉淀及干燥在濃縮液中按照I : 3的比例加入無水乙醇，單位為mL/mL，放置在室溫中沉淀lh，并用無水乙醇洗滌，真空干燥，得到烏雞肽鐵螯合物原粉。在上述條件下所得的補鐵劑原粉為青灰色粉末，鐵離子含量為120. 50mg/g，產(chǎn)品無異味，弱堿性條件下溶于水呈淡黃褐色透明溶液?？梢詫⒃摓蹼u肽鐵螯合物原粉按照常規(guī)方法制成顆粒補鐵劑。實施例5烏雞肽溶液的配制稱取6kg烏雞肽置于反應罐中，加入100L純凈水，攪拌溶解制備成6%的烏雞肽溶液。螯合亞鐵離子稱取I. 5kg的抗壞血酸，溶解于烏雞肽溶液中使其濃度達到
I.5%，防止亞鐵離子氧化，稱取2kg硫酸亞鐵加入混合溶液中，使混合溶液中烏雞肽與硫酸亞鐵的質量比為3 1，攪拌使其溶解。調節(jié)pH值使其保持在6左右，攪拌使其在35°C下充分反應30min。反應過程中保持密閉環(huán)境防止亞鐵離子接觸空氣氧化。沉淀及干燥在螯合液中按照I : 4的比例加入無水乙醇，單位為L/L，放置在室溫中沉淀lh，并用無水乙醇洗滌，真空干燥，得到烏雞肽鐵螯合物原粉。試驗表明，在上述條件下所得的補鐵劑原粉為青灰色粉末，鐵離子含量為113. 65mg/g,產(chǎn)品無異味,弱堿性條件下溶于水呈淡黃褐色透明溶液?？梢詫⒃摓蹼u肽鐵螯合物原粉按照常規(guī)方法制成片劑補鐵劑。實施例6將實施例I制備所得的烏雞肽鐵螯合物原粉與烏雞肽原粉分別制備固體壓片，通過傅里葉紅外光譜儀，掃描得紅外光譜圖(圖I)。圖I的紅外光譜分析表明烏雞肽鐵螯合物是一種新型肽鐵螯合物。烏雞肽與其亞鐵螯合物吸收峰相比，在強弱和位置上有明顯的變化。烏雞肽鐵螯合物在3030cm—1的銨峰消失，而在1046cm—1處出現(xiàn)了吸收峰，說明Fe2+與氨基有較強結合。在烏雞肽IR圖譜中3385CHT1處有寬吸收峰(0H與NH伸縮振動頻率重疊)，同時處在924CHT1處有吸收峰，說明含有-C00H。烏雞肽螯合鐵 IR圖譜中3385CHT1處的寬吸收峰變窄，且955-915CHT1沒有吸收峰，說明烏雞肽螯合鐵圖譜中沒有-COOH結構，推測羧基也以共價鍵的方式與鐵離子結合。綜上所述，烏雞肽鐵螯合物中亞鐵離子與烏雞肽中NH2+以及-C00_形成配位鍵，是一種新型的肽鐵螯合物。
權利要求
1.一種烏雞肽鐵螯合物的制備方法，其特征在于該方法包括在烏雞肽溶液中加入抗壞血酸，并且在PH3-6的條件下，將烏雞肽溶液與亞鐵鹽恒溫下螯合。
2.根據(jù)權利要求I的制備方法，包括如下步驟 1)配制制得烏雞肽溶液； 2)螯合加入抗壞血酸，加入亞鐵鹽，調節(jié)pH值至3-6，恒溫下螯合； 3)沉淀將螯合液用無水乙醇進行沉淀，得到烏雞肽鐵螯合物。
3.根據(jù)權利要求I或2的制備方法，其中配制步驟中，烏雞肽溶液濃度為2%-6% (g/mL)，優(yōu)選烏雞肽的濃度為3 % -5 %。
4.根據(jù)權利要求I或2的制備方法，其中螯合步驟包括加入抗壞血酸使其濃度達到O. 5%-1.5%，優(yōu)選O. 8%-1.2% ;烏雞肽與亞鐵鹽質量比為3 1-1 1，螯合反應在30-60°C下恒溫反應 20-40min。
5.根據(jù)權利要求I或2的制備方法，其中沉淀步驟包括用濃縮液2-4倍體積的無水乙醇進行沉淀。
6.根據(jù)前述任一項權利要求的制備方法，其中在步驟2)之后包括濃縮步驟，將螯合液濃縮后再進行沉淀處理。
7.根據(jù)前述任一項權利要求的制備方法，其中將得到烏雞肽鐵螯合物沉淀物干燥成烏雞肽鐵螯合物干粉。
8.一種烏雞肽鐵螯合物，其特征在于是按照權利要求1-7中任一項所述的烏雞肽鐵螯合物的制備方法制備。
9.權利要求8的烏雞肽鐵螯合物在制備口服液、片劑、膠囊、顆粒劑補鐵劑型中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種烏雞肽鐵螯合物，包括在烏雞肽溶液中加入抗壞血酸，并且在pH3-6的條件下，將烏雞肽溶液與亞鐵鹽恒溫下螯合。通過傅里葉紅外光譜對螯合物進行結構鑒定，烏雞肽鐵螯合物中亞鐵離子與多肽中NH2+以及-COO-形成配位鍵，說明烏雞肽鐵螯合物是一種新型肽鐵螯合物。本發(fā)明制備原料安全無毒，制備過程無有害物質產(chǎn)生，并且工藝簡便、成本低廉，可應用于補鐵劑等功能性食品和保健品的制備。
文檔編號A23L1/29GK102860512SQ20121038079
公開日2013年1月9日 申請日期2012年10月10日 優(yōu)先權日2012年10月10日
發(fā)明者蔡木易, 魯軍, 宋莎莎, 谷瑞增, 易維學, 董哲, 馬勇, 陳亮, 潘興昌, 徐亞光, 馬永慶, 林峰, 金振濤, 劉文穎, 陸路, 劉艷, 魏穎, 張海欣 申請人:中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院