一種miR-222的靶基因結(jié)合序列的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種miR-222的靶基因結(jié)合序列、重組載體、轉(zhuǎn)化體及其用途。本發(fā)明公開了一種含有如SEQ?ID?NO.1所述核酸序列的miR-222的靶基因結(jié)合序列，為今后開發(fā)其抑制劑藥物提供高效的、大通量的篩選和評價平臺和手段，將大大促進miRNA在腫瘤預(yù)防、診斷和治療中的應(yīng)用。
【專利說明】—種miR-222的靶基因結(jié)合序列
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種miR-222的靶基因結(jié)合序列、重組載體、轉(zhuǎn)化體及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]自從1993年Lee等在秀麗新小桿線蟲內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)miRNA編碼基因lin_4、2000年Reinhart等在對線蟲的發(fā)育調(diào)控中發(fā)現(xiàn)let_7以來，人們相繼在煙草、果蠅、線蟲、斑馬魚、哺乳動物與人體中發(fā)現(xiàn)并且鑒定幾百種miRNA編碼基因。
[0003]miRNAs是一種廣泛存在的對基因進行微調(diào)的分子，約占人類基因組的總基因數(shù)2-3%。從結(jié)構(gòu)上來說，miRNAs (microRNAs)是一類長度很短的非編碼調(diào)控單鏈小分子RNA，約18-24bp，通過與其靶mRNA分子的3端非編碼區(qū)域(3’ UTR)互補配對而在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因的表達進行負調(diào)控，導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯抑制，從而進一步調(diào)控多種生物學(xué)行為，如發(fā)育的進程、干細胞分化、細胞凋亡、疾病、以及腫瘤發(fā)生。
[0004]最初對miRNA表達變化的探討來自于對B細胞慢性淋巴性白血病(CLL)的研究，其后，眾多研究小組在多種人類腫瘤中檢測到miRNA的表達變化，因此被認為是發(fā)生癌變的共同特征，但是癌癥的腫瘤的形成和miRNA表達變化究竟是誰因誰是果尚還沒有明確的實驗證據(jù)。大約50%得到注解的miRNA在基因組上定位于與腫瘤相關(guān)的脆性位點(fragilesite)，這說明miRNA在腫瘤發(fā)生過程中起至關(guān)重要的作用。另外，在采用基因芯片技術(shù)對來自多種腫瘤組織樣本的miRNA表達進行檢測發(fā)現(xiàn)，一些miRNA表達下調(diào)，而另一些miRNA表達上調(diào)，這些miRNA所起的作用類似于抑癌基因和癌基因的功能，有研究人員將miRNA命名為 “oncomirs”。
[0005]研究表明 ，miR-222 (Homo sapiens miR-222)在肝癌、前列腺癌組織及胃癌、膠質(zhì)瘤細胞中表達上調(diào)[Wong Qff, Ching AK, Chan AW, et al.[J].ClinCancerRes, 2010，16 (3):867-875 ;Chun-Zhi Z,Lei H, An-Ling Z, et al.[J].BMCCancer,2010, 10:367 ；Galardi S,Mercatelli N, Farace MG, et al.[J].Nucleic AcidsRes, 2011，39(9):3892-3902]
[0006]因此，明確miR-222的靶基因結(jié)合序列，對今后開發(fā)其抑制劑具有重要意義，將大大促進miRNA在腫瘤預(yù)防、診斷和治療中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供miR-222的靶基因結(jié)合序列，為今后開發(fā)其抑制劑藥物提供高效的、大通量的篩選和評價平臺和手段。
[0008]為此，本發(fā)明公開了一種含有如SEQ ID N0.1所述核酸序列的miR-222的靶基因
結(jié)合序列。
[0009]在一些實施例中，所述靶基因結(jié)合序列為如SEQ ID N0.2所述核酸序列。
[0010]在一些實施例中，所述靶基因結(jié)合序列為為如SEQ ID N0.3所述DKK2基因3’UTR核酸序列。
[0011]另一方面，本發(fā)明公開了一種包含本發(fā)明所述靶基因結(jié)合序列的重組載體。
[0012]在一些實施例中，所述重組載體含有螢火蟲熒光素酶或海洋腔腸熒光素酶報告基因。
[0013]在一些實施例中,所述重組載體為pGL3_promoter載體。
[0014]另一方面，本發(fā)明公開了一種包含本發(fā)明所述重組載體的轉(zhuǎn)化體。
[0015]在一實施方式中，所述轉(zhuǎn)化體為U87膠質(zhì)瘤細胞。
[0016]另一方面，本發(fā)明公開了本發(fā)明所述轉(zhuǎn)化體在篩選miR-222抑制劑中用途。
[0017]本發(fā)明公開了 miR-222的靶基因結(jié)合序列，為今后開發(fā)其抑制劑藥物提供高效的、大通量的篩選和評價平臺和手段，將大大促進miRNA在腫瘤預(yù)防、診斷和治療中的應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖lpGL3-promoter 質(zhì)粒酶切圖。
[0019]圖2PCR凝膠電泳圖。
[0020]圖3雙熒光酶活性檢測。
【具體實施方式】`
[0021]本發(fā)明還包括通過合成和重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明miR-222的靶基因結(jié)合序列(多核苷酸)的方法。通過本領(lǐng)域已知的方法可以分離和純化多核苷酸(DNA或RNA)、載體、轉(zhuǎn)化體和生物體。
[0022]用于本發(fā)明的載體可以是如噬菌體、質(zhì)粒、粘粒、微型染色體、病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。可用于克隆和/或表達本發(fā)明的多核苷酸的載體是能在需復(fù)制和/或表達多核苷酸的宿主細胞中復(fù)制和/或表達多核苷酸的載體。一般說來，多核苷酸和/或載體可用于任何真核或原核細胞，包括哺乳動物細胞(如人(如HeLa)、猴(如Cos)、兔(如兔網(wǎng)織紅細胞)、大鼠、倉鼠(如CH0、NS0和幼倉鼠腎細胞)或小鼠細胞(如L細胞))、植物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或細菌細胞(如大腸桿菌)。有關(guān)適用于多種類型宿主細胞的適當(dāng)載體的例子可參見例如 F.Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology.Greene PublishingAssociates and Wiley-1nterscience (1992)和 Sambrook et al.(1989)?？梢允褂煤羞@些多核苷酸的宿主細胞來大量表達可用于例如藥物、診斷試劑、疫苗和治療劑的蛋白質(zhì)。
[0023]已開發(fā)出多種方法用于經(jīng)由互補的粘性末端使多核苷酸與載體可操作相連。例如，可在欲插入載體DNA內(nèi)的DNA區(qū)段添加互補的同聚體序列片段。然后通過互補同聚體尾之間的氫鍵連接載體和DNA區(qū)段以形成重組DNA分子。
[0024]含有一或多種限制性位點的合成接頭提供了另一種連接DNA區(qū)段與載體的方法。用噬菌體T4DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶I處理通過內(nèi)切核酸酶限制性消化產(chǎn)生的DNA區(qū)段，所述的兩種聚合酶用其3’，5’ -核酸外切活性除去突出的Y-單鏈末端，并用其聚合活性補平3’-凹端。因此，這些活性的聯(lián)合產(chǎn)生了平端DNA區(qū)段。然后在能催化平端DNA分子連接的酶，如噬菌體T4DNA連接酶的存在下將平端區(qū)段與大摩爾過量的接頭分子一起保溫。因此，反應(yīng)產(chǎn)物是末端攜有聚合接頭序列的DNA區(qū)段。然后用適當(dāng)?shù)南拗菩悦噶呀膺@些DNA區(qū)段，并連接至已用酶裂解的表達載體中，所述酶能產(chǎn)生與所述DNA區(qū)段相容的末端。從多個商家可以買到含有多個限制性內(nèi)切核酸酶位點的合成接頭。
[0025]多核苷酸插入物應(yīng)該可操作地連接于同表達多核苷酸的宿主細胞相容的適當(dāng)啟動子上。啟動子可以是強啟動子和/或誘導(dǎo)型啟動子。列舉的一些啟動子的例子包括噬菌體久PL啟動子、大腸桿菌lac、trP、phoA、tac啟動子、SV40早期和晚期啟動子以及逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟動子。其它適當(dāng)啟動子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。表達重組載體進一步含有轉(zhuǎn)錄起始、終止位點，并在轉(zhuǎn)錄區(qū)含有用于翻譯的核糖體結(jié)合位點。重組載體表達的轉(zhuǎn)錄物的編碼部分可包括位于起點處的翻譯起始密碼子和適當(dāng)?shù)匚挥诒环g多肽的末端的終止密碼子(UAA, UGA 或 UAG)。
[0026]如上所述，表達載體可包括至少一個選擇標(biāo)記。所述標(biāo)記包括對真核細胞培養(yǎng)物而言的二氫葉酸還原酶、G418、谷氨酰胺合酶、新霉素抗性、螢火蟲熒光素酶、海洋腔腸熒光素酶；以及用于大腸桿菌和其它細菌培養(yǎng)的四環(huán)素、卡那霉素或氨卞青霉素抗性基因。適當(dāng)宿主的代表性例子包括但不限于:細菌細胞，如大腸桿菌、鏈霉菌和鼠傷寒沙門氏菌細胞；真菌細胞，如酵母細胞(如釀酒酵母或巴斯德畢赤酵母);昆蟲細胞，如果蠅S2和夜蛾SF9細胞；動物細胞，如CHO，COS, NS0, 293和Bowes黑素瘤細胞；和植物細胞。上述宿主細胞的適當(dāng)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域已知的。
[0027]本發(fā)明還包括含有本發(fā)明的核苷酸序列的宿主細胞,所述核苷酸序列經(jīng)本領(lǐng)域已知的技術(shù)與一或多種異源控制區(qū)(如啟動子和/或增強子)可操作相連?？梢赃x擇能調(diào)節(jié)插入的基因序列的表達，或能按照所需的特殊方式修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主菌株。在某些誘導(dǎo)物的存在下，某些啟動子啟動的表達會升高；因此，可以控制經(jīng)基因改造的多肽的表達。另外，不同宿主細胞具有特征性的和特殊的翻譯、翻譯后加工和修飾(如磷酸化、裂解)蛋白質(zhì)的機制?？梢赃x擇適當(dāng)?shù)募毎狄源_保對表達的外源蛋白質(zhì)進行合乎需要的修飾和加工。
[0028]通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、 DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染或其它方法，即可將本發(fā)明的核酸和核酸重組載體導(dǎo)入宿主細胞。所述方法描述于多個標(biāo)準(zhǔn)的實驗室手冊中，如Davis et al., Basic Methods In MolecularBiology(1986)。
[0029]編碼本發(fā)明所述miR-222的靶基因結(jié)合序列(多核苷酸)可以與含有選擇標(biāo)記的載體連接以在宿主中增殖。一般說來，可在沉淀物，如磷酸鈣沉淀物或其與帶電脂質(zhì)的復(fù)合物中導(dǎo)入質(zhì)粒載體。如果載體是病毒，可使用適當(dāng)?shù)陌b細胞系在體外對其進行包裝，再轉(zhuǎn)導(dǎo)至宿主細胞。
[0030]通過眾所周知的技術(shù)可以鑒定出被成功轉(zhuǎn)化的細胞，即含有本發(fā)明的DNA重組載體的細胞。例如，可培養(yǎng)導(dǎo)入表達重組載體所得的細胞以產(chǎn)生所需多肽。收集并裂解細胞，使用如 Southern(1975) J.Mol.Biol.95，503 或 Berent et al (1985) Biotech.3，208 所述的方法，檢測其DNA內(nèi)容物中DNA的存在?；蛘?，使用抗體檢測上清液中蛋白質(zhì)的存在。
[0031]為進一步詳細描述在本發(fā)明的實踐中所使用的常規(guī)技術(shù)，實踐者可參看有關(guān)細胞生物學(xué)、組織結(jié)構(gòu)學(xué)以及胚胎學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)的教科書及評論。包括Teratocarcinomasand embryonic stem cell: A practical approach[E.J.Robertson 編，IRL 出版有限公司，1987] ；Guide to techniques in Mouse Development[P.M.Wasserman 等編，學(xué)術(shù)出版社，1993] ；Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro[M.V.Wiles, Meth.Enzymo1.225:900，1993] ；Properties and uses of Embryonic Stem Cells:Prospectsfor Application to Human Biology and Gene Therapy[P.D.Rathjen等，ReprocL Fertil.Dev.10:31，1998]。
[0032]細胞生物學(xué)技術(shù)可以在“細胞生物學(xué)中的當(dāng)前方案” [J.S.Bonifacino等，Wiley& Sons ]中找到。與本發(fā)明相關(guān)的試劑、克隆載體、和基因操作試劑盒可從商業(yè)供應(yīng)商那得至丨J，例如 BioRacU Stratagene、InvitrogeruClonTech 以及 sigma-AIdrich 公司。
[0033]細胞培養(yǎng)方法通常在“動物細胞培養(yǎng):基本技術(shù)手冊”最新版本(R.1.Freshney編輯，Wiley & Sons)細胞培養(yǎng)一般技術(shù)”(M.A.Harrison和1.F.Rae,劍橋大學(xué)出版);和“胚胎干細胞:方法和操作規(guī)定” (K.Turksen編輯，Humana出版)中有描述。組織培養(yǎng)基和試劑可從商業(yè)供應(yīng)商那得到，例如 Gibco/BRL、Nalgene-Nunc International、Sigma ChemicalC0.、以及 ICN Biomedicals。
[0034]對本發(fā)明使用的培養(yǎng)基的類型沒有限制，只要可用于干細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基即可。在這類培養(yǎng)基中CO2的濃度優(yōu)選是5%，但本發(fā)明不限于此。
[0035]以下結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0036] 儀器與試劑
[0037]臺式高速冷凍離心機(Eppendorf公司)
[0038]多功能熒光酶標(biāo)儀
[0039]凝膠成像系統(tǒng)
[0040]臺式離心機
[0041]電子天平
[0042]生物電泳圖像分析系統(tǒng)
[0043]50 X TAE 溶液
[0044]Agrose
[0045]實施例1.構(gòu)建 pGL3-DKK2-promoters-basic 質(zhì)粒
[0046](I)用pGL3-promoter質(zhì)粒轉(zhuǎn)化常規(guī)制備的DH5 a感受態(tài)細胞，進行擴增，堿裂解法制備pGL3-promoter質(zhì)粒，電泳檢測質(zhì)粒的純度和含量，用XbaI對質(zhì)粒進行酶切,試劑盒凝膠回收大片段的酶切產(chǎn)物；
[0047](2)DKK2基因的3' UTR序列的克隆、酶切及純化
[0048]采用數(shù)據(jù)庫TargetScan5.2，預(yù)測DKK2基因的3’UTR序列中的miR-222結(jié)合序列如SEQ ID N0.1所述核酸序列，然后設(shè)計其引物為
[0049]引物1:5' -GATCGCCGTGTAATTCTAGAGTTTCATTGCCCTCT~3/ ；
[0050]引物2:5' -CGTCGATAACTCTAGACAAAGTCAATAGCTGC-3'；
[0051]以基因組DNA為模板，利用常規(guī)PCR反應(yīng)進行擴增，用試劑盒凝膠回收PCR產(chǎn)物，將回收的PCR產(chǎn)物用XbaI酶切；[0052](3)將上述獲得的pGL3-promoter載體和DKK2基因3’ UTR片段進行連接反應(yīng)；
[0053](4)篩選重組子，將上述連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)過含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)，從轉(zhuǎn)化子的平板上隨即挑取菌落，擴增培養(yǎng)后用堿裂解法少量提取質(zhì)粒備用，經(jīng)過酶切，PCR擴增結(jié)果:目的條帶出現(xiàn)在774bp左右，證實已經(jīng)成功擴增DKK2靶基因(見附圖2)、同時經(jīng)測序鑒定如SEQ ID N0.2所述核酸序列。序列正確的質(zhì)粒命名為PGL3-DKK2-3’ UTR-promoter 質(zhì)粒(以下簡稱 “DKK2-WT”)。
[0054]實施例2.構(gòu)建含DKK2基因3’ UTR片段突變序列的pGL3-promoter載體
[0055]將DKK23’ UTR中的TGTAGCA中的TAG堿基換成CGA堿基，根據(jù)pGL3_DKK2_3’ UTR-promoter質(zhì)粒序列設(shè)計其引物為
[0056]引物3:5，-ACAGAAAGCTTTGCGACAGAATATATTT-3，；
[0057]引物4:5，-CAAATATATTCTGTCGCAAAGCTTTCTGT-3 ’ ;
[0058]以實施例1所制備的pGL3-DKK2-3，UTR-promoter質(zhì)粒為模板，采用TaKaRaMutanBEST KU，按照試劑盒說明書步驟操作，參照實施例1 (4)的步驟篩選出含DKK2基因3’ UTR片段突變序列的pGL3-promoter載體(以下簡稱“DKK2_Mut”)
[0059]實施例3.熒光酶活性檢測
[0060]用U87膠質(zhì)瘤細胞:用含10%胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔1000-10000個細胞接種到96孔板，每孔體積200ul，12-24小時貼壁后細胞達到50%左右融合率時進行轉(zhuǎn)染；按照常規(guī)技術(shù)方法，將DKK2-WT質(zhì)粒、DKK2-Mut質(zhì)粒、空pGL3-promoter載體分別聯(lián)合海腎熒光素酶PRL-SV40質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染U87膠質(zhì)瘤細胞，形成了 DKK2-WT組、DKK2-Mut 組和 DKK2-Ctrl 組，同時分別加入 miR-222 mimics、miR-222 inhibitor 或等體積培養(yǎng)液(作為空白對照)；轉(zhuǎn)染24小時后進行雙熒光素酶檢測
[0061]雙熒光素酶檢測實驗步驟:
[0062]1.裂解細胞:將報告基因細胞裂解液充分混勻，按如下方式加入報告基因細胞裂解液，充分裂解細胞。
[0063]a.對于貼壁細胞:吸盡細胞培養(yǎng)液后可以直接加入報告基因細胞裂解液；對于懸浮細胞:離心去上清后加入報告基因細
[0064]胞裂解液。
[0065]b.充分裂解后，10，000-15, OOOg離心3_5分鐘，取上清用于測定。
[0066]注:細胞裂解后可以立即測定熒光素酶，也可以先凍存，待以后再測定。凍存樣品需融解，并達到室溫后再進行測定。
[0067]器皿類型96孔板 48孔板 24孔板 12孔板 6孔板
[0068]報告基因細胞裂解液(微升/孔)100 150 200 300 500
[0069]2.融解螢火蟲熒光素酶檢測試劑和Renilla熒光素酶檢測緩沖液，并達到室溫。Renilla熒光素酶檢測底物(100X)置于冰浴
[0070]或冰盒上備用。
[0071]3. 按照每個樣品需100微升的量，取適量Renilla熒光素酶檢測緩沖液，按照1:100加入Renilla熒光素酶檢測底物(100X)配
[0072]制成Renilla熒光素酶檢測工作液。例如，I毫升Renilla熒光素酶檢測緩沖液中加入10微升Renilla熒光素酶檢測底物[0073](100X)充分混勻后即可配制成約I毫升Renilla熒光素酶檢測工作液。
[0074]4.按儀器操作說明書開啟熒光測定儀，將測定間隔設(shè)為2秒，測定時間設(shè)為10秒。
[0075]5.每個樣品測定時，取樣品20-100微升(如果樣品量足夠，請加入100微升，但每次樣品的使用量要保持一致)，加入100微升
[0076]螢火蟲熒光素酶檢測試劑，用槍打勻或用其它適當(dāng)方式混勻后測定RLU(relativelight unit)。以報告基因細胞裂解液為空白
[0077]對照。
[0078]6.在完成上述測定螢火蟲突光素酶步驟后,加入100微升Renilla突光素酶檢測工作液，用槍打勻或用其它適當(dāng)方式混勻后測
[0079]定RLU (relative light unit)。
[0080]7.在以Renilla熒光素酶為內(nèi)參的情況下，用螢火蟲熒光素酶測定得到的RLU值除以Renilla熒光素酶測定得到的RLU值。根據(jù)
[0081 ] 得到的比值來比較不同樣品間目的報告基因的激活程度。
[0082]實驗結(jié)果(圖3)，過表達miR-222可下調(diào)DKK2的3’ UTR熒光活性，而將miR-222抑制后DKK2的3’UTR熒光活性上調(diào)，同時miR-222的改變不會引起空白組和種子序列突變組的熒光活性。，這表明DKK23’ UTR中的TGTAGCA為miR-222結(jié)合序列。
[0083]本發(fā)明的范圍不受所述具體實施方案的限制，所述實施方案只作為闡明本發(fā)明各個方面的單個例子，本發(fā)明范圍內(nèi)還包括功能等同的方法和組分。實際上，除了本文所述的內(nèi)容外，本領(lǐng)域技術(shù)人員參照上文的`描述和附圖可以容易地掌握對本發(fā)明的多種改進。所述改進也落入所附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。上文提及的每篇參考文獻皆全文列入本文作為參考。
[0084]序列表
[0085]<110>上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院
[0086]<120> 一種miR-222的靶基因結(jié)合序列
[0087]〈130〉說明書序列表
[0088]<160>3
[0089]<170>PatentIn version 3.3
[0090]〈210〉I
[0091]<211>7
[0092]<212>DNA
[0093]<213>Homo sapiens
[0094]〈400〉I
[0095]tgtagca7
[0096]<210>2
[0097]<211>756
[0098]<212>DNA
[0099]<213>Homo sapiens
[0100]<400>2
[0101]gtttcattgc cctctataag cttctgacta gccaatggca tcatccaatt ttcttcccaa 60
【權(quán)利要求】
1.一種含有如SEQ ID N0.1所述核酸序列的miR-222的靶基因結(jié)合序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述miR-222的靶基因結(jié)合序列，其特征在于所述靶基因結(jié)合序列為如SEQ ID N0.2所述核酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述miR-222的靶基因結(jié)合序列，其特征在于所述靶基因結(jié)合序列為如SEQ ID N0.3所述DKK 2基因3’ UTR核酸序列。
4.一種包含權(quán)利要求1所述miR-222的靶基因結(jié)合序列的重組載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述重組載體，其特征在于所述靶基因結(jié)合序列為如SEQID N0.2所述核酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述重組載體，其特征在于所述靶基因結(jié)合序列為如SEQID N0.3所述DKK2基因3’ UTR核酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述重組載體，其特征在于所述重組載體含有螢火蟲熒光素酶或海洋腔腸熒光素酶報告基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述重組載體，其特征在于所述重組載體為pGL3-pix)m0ter載體。
9.一種包含權(quán)利要求4-8中任一項所述重組載體的轉(zhuǎn)化體。
10.權(quán)利要求9所述轉(zhuǎn)化體在篩選miR-222抑制劑中的用途。
【文檔編號】C12N5/10GK103484453SQ201210378376
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月13日
【發(fā)明者】馬杰, 李奇峰, 沈克, 許佳明 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院