專利名稱：一種樹突狀細(xì)胞疫苗制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種樹突狀細(xì)胞疫苗制備方法。
背景技術(shù)：
DC名為樹突狀細(xì)胞，它是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，在細(xì)胞免疫治療上有著廣泛的應(yīng)用前景，在特異的腫瘤抗原刺激下，成熟的樹突狀細(xì)胞能表達(dá)多種細(xì)胞因子和趨化因子，如，MHC II分子HLA-DR，共刺激分子⑶80，⑶86等多種細(xì)胞因子，有效誘導(dǎo)抗原特異性和非特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。但DC在人外周血中比例很低，因此提高擴(kuò)增倍數(shù)，增加成熟的樹突狀細(xì)胞數(shù)，對(duì)治療效果起著關(guān)鍵的作用。
現(xiàn)在樹突狀細(xì)胞做的很熱，常規(guī)技術(shù)是用GM-CSF+IL4，這種方法的擴(kuò)增倍數(shù)不高，成熟度不高，一般成熟的樹突狀細(xì)胞數(shù)只能達(dá)到2X 106，成熟的樹突狀細(xì)胞純度在60%，參見圖I。也有采用加入Flt3來進(jìn)行擴(kuò)增的，但其中還會(huì)加入化學(xué)藥物，而且擴(kuò)增倍數(shù)及成熟度也并不高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于腫瘤治療用的樹突狀細(xì)胞治療性疫苗的制備方法，有效提高樹突狀細(xì)胞擴(kuò)增，使人PBMC中未成熟的樹突狀細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下擴(kuò)增倍數(shù)提高，提高成熟度，且不添加化學(xué)藥物，純凈度高。為實(shí)現(xiàn)上述目的，設(shè)計(jì)一種樹突狀細(xì)胞疫苗制備方法，其特征在于采用如下制備步驟(1)取17ml病患自體血，采用人淋巴細(xì)胞分離液分離出紅細(xì)胞、單核淋巴細(xì)胞、血漿；
(2)用GT-T551無血清培養(yǎng)基調(diào)整單核淋巴細(xì)胞濃度為2X IO6個(gè)/ml ; (3)將調(diào)整好濃度的單核淋巴細(xì)胞以3ml/孔加入6孔板中，貼壁16小時(shí)；(4)吸棄6孔板的每個(gè)孔內(nèi)的上層未貼壁細(xì)胞，在每個(gè)孔的下層即留下未成熟DC細(xì)胞；(5)再在6孔板的每個(gè)孔內(nèi)分別加入DC培養(yǎng)基3ml，置于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，二氧化碳濃度為5 %，溫度為37°C，培養(yǎng)2 3天；(6 )吸棄6孔板的每個(gè)孔內(nèi)DC培養(yǎng)基一半I. 5ml，每個(gè)孔內(nèi)再補(bǔ)充DC培養(yǎng)基I. 5ml，進(jìn)行半量換液；(7)以第一次加入DC培養(yǎng)基開始計(jì)算的第6天，荷載自體腫瘤抗原，使6孔板的每個(gè)孔內(nèi)的自體腫瘤抗原的濃度為20 μ g/ml ； (8)24小時(shí)后檢測成熟DC細(xì)胞的數(shù)量和成熟度；所述的DC培養(yǎng)基由上述步驟(I)中分離出的自體血漿、GM-CSF、IL-4、Flt3、及GT-T551無血清培養(yǎng)基所組成，其中自體血漿占整個(gè)DC培養(yǎng)基體積的I %，GM-CSF占整個(gè)DC培養(yǎng)基的濃度為50ng/ml，IL-4占整個(gè)DC培養(yǎng)基的濃度為100ng/ml，F(xiàn)lt3占整個(gè)DC培養(yǎng)基的濃度為100ng/ml，GT-T551無血清培養(yǎng)基占整個(gè)DC培養(yǎng)基體積的96%。本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，分離出的自體血漿再利用，用人血漿替換為離體的人AB血清；在該DC培養(yǎng)基中加入Flt3，可以增強(qiáng)刺激樹突狀細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)，成熟的樹突狀細(xì)胞數(shù)至少達(dá)到IX 107，成熟樹突狀細(xì)胞的成熟度> 85% ;解決了樹突狀細(xì)胞制備過程中細(xì)胞數(shù)量少，增殖慢的問題；用自身特異的腫瘤干細(xì)胞裂解液，作為腫瘤抗原，細(xì)胞的特異性殺傷力更強(qiáng)；且原料不添加額外的化學(xué)藥物，純凈度高。


圖I為原有的方法制備出的成熟的樹突狀細(xì)胞的純度圖。圖2為采用本發(fā)明制備出的成熟的樹突狀細(xì)胞的純度圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地說明。(I)取18ml病患自體血，取其中Iml病患自體血做流式細(xì)胞檢測，用于治療前免疫指標(biāo)的評(píng)價(jià)，另外17ml病患自體血采用人淋巴細(xì)胞分離液分離出紅細(xì)胞、單核淋巴細(xì)胞、 血漿；
(2)用GT-T551無血清培養(yǎng)基調(diào)整單核淋巴細(xì)胞濃度為2XIO6個(gè)/ml ；
(3)將調(diào)整好濃度的單核淋巴細(xì)胞以3ml/孔加入6孔板中，貼壁16小時(shí)；
(4)在6孔板的每個(gè)孔內(nèi)吸棄上層非貼壁細(xì)胞，在每個(gè)孔內(nèi)即留下下層貼壁的未成熟的DC細(xì)胞；
(5)再在6孔板的每個(gè)孔內(nèi)分別加入DC培養(yǎng)基3ml,置于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，其中CO2濃度為5%，溫度為37°C，培養(yǎng)2 3天；
(6)吸棄6孔板的每個(gè)孔內(nèi)的DC培養(yǎng)基I.5ml，再另取I. 5ml的DC培養(yǎng)基放在每個(gè)孔
內(nèi)；
(7)以第一次加入DC培養(yǎng)基開始計(jì)算的第6天，荷載病患自體腫瘤抗原，使DC細(xì)胞成熟并制備成自體腫瘤抗原特異性DC疫苗，其中6孔板的每個(gè)孔內(nèi)的自體腫瘤抗原的濃度為20 μ g/ml ；
(8)24小時(shí)后檢測成熟DC細(xì)胞的數(shù)量和成熟度。所述的DC培養(yǎng)基由上述步驟(I)中分離出的自體血漿、GM-CSF, IL_4、Flt3、GT-T551無血清培養(yǎng)基所組成，其中自體血漿占整個(gè)DC培養(yǎng)基的體積為1%，GM-CSF占整個(gè)DC培養(yǎng)基的濃度為50ng/ml，IL-4占整個(gè)DC培養(yǎng)基的濃度為100ng/ml，F(xiàn)lt3占整個(gè)DC培養(yǎng)基的濃度為100ng/ml，GT-T551無血清培養(yǎng)基占整個(gè)DC培養(yǎng)基的體積為96%。相對(duì)于原有技術(shù)取血量多，擴(kuò)增倍數(shù)少的情況，本發(fā)明提供的這種新的腫瘤樹突狀細(xì)胞治療性疫苗的制備方法，用于腫瘤的預(yù)防及治療，具有取血量少、制備簡便、細(xì)胞增殖數(shù)量多、療效好、特異性殺傷力強(qiáng)的特點(diǎn)，其中成熟的樹突狀細(xì)胞數(shù)至少達(dá)到1X107，成熟樹突狀細(xì)胞的成熟度> 85%，參見圖2。
權(quán)利要求
1.一種樹突狀細(xì)胞疫苗制備方法，其特征在于采用如下制備步驟(I)取17ml病患自體血，采用人淋巴細(xì)胞分離液分離出紅細(xì)胞、單核淋巴細(xì)胞、血漿；(2)用GT-T551無血清培養(yǎng)基調(diào)整單核淋巴細(xì)胞濃度為2X IO6個(gè)/ml ; (3)將調(diào)整好濃度的單核淋巴細(xì)胞以3ml/孔加入6孔板中，貼壁16小時(shí) ；(4)吸棄6孔板的每個(gè)孔內(nèi)的上層未貼壁細(xì)胞，在每個(gè)孔的下層即留下未成熟DC細(xì)胞；(5)再在6孔板的每個(gè)孔內(nèi)分別加入DC培養(yǎng)基3ml，置于ニ氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，ニ氧化碳濃度為5%，溫度為37 °C，培養(yǎng)2 3天；(6)吸棄6孔板的每個(gè)孔內(nèi)DC培養(yǎng)基一半I. 5ml，每個(gè)孔內(nèi)再補(bǔ)充DC培養(yǎng)基I. 5ml，進(jìn)行半量換液；(7)以第一次加入DC培養(yǎng)基開始計(jì)算的第6天，荷載自體腫瘤抗原，使6孔板的每個(gè)孔內(nèi)的自體腫瘤抗原的濃度為20 μ g/ml ; (8) 24小時(shí)后檢測成熟DC細(xì)胞的數(shù)量和成熟度；所述的DC培養(yǎng)基由上述步驟(I)中分離出的自體血漿、GM-CSF、IL-4、Flt3、及GT-T551無血清培養(yǎng)基所組成，其中自體血漿占整個(gè)DC培養(yǎng)基體積的I %，GM-CSF占整個(gè)DC培養(yǎng)基的濃度為50ng/ml，IL-4占整個(gè)DC培養(yǎng)基的濃度為100ng/ml，F(xiàn)lt3占整個(gè)DC培養(yǎng)基的濃度為100ng/ml，GT-T551無血清培養(yǎng)基占整個(gè)DC培養(yǎng)基體積的96%。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種樹突狀細(xì)胞疫苗制備方法，其特征在于采用如下制備步驟(1)取病患自體血，采用人淋巴細(xì)胞分離液分離出紅細(xì)胞、單核淋巴細(xì)胞、血漿；(2)調(diào)整單核淋巴細(xì)胞濃度；(3)加入6孔板中，貼壁16小時(shí)；(4)吸棄6孔板的每個(gè)孔內(nèi)的上層未貼壁細(xì)胞；(5)加入DC培養(yǎng)基3ml，置于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，二氧化碳濃度為5％，溫度為37℃，培養(yǎng)2～3天；(6)進(jìn)行半量換液；(7)第6天，荷載自體腫瘤抗原，使6孔板的每個(gè)孔內(nèi)的自體腫瘤抗原的濃度為20μg/ml；(8)24小時(shí)后檢測成熟DC細(xì)胞的數(shù)量和成熟度。本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，成熟的樹突狀細(xì)胞數(shù)至少達(dá)到1×107，成熟度＞85%。
文檔編號(hào)C12N5/0784GK102847145SQ20121037007
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月27日
發(fā)明者儲(chǔ)以微, 鄭秀娟, 張丹 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)