專利名稱：基于石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)的dna測(cè)序裝置及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于DNA分子測(cè)序技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)的DNA測(cè)序裝置及方法。
背景技術(shù)：
脫氧核糖核酸(DNA)測(cè)序技術(shù)是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的核心技術(shù)之一。為實(shí)現(xiàn)千美元人類基因組(TDG)、百美元人類基因組(HDG)目標(biāo)，推進(jìn)個(gè)體化疾病診斷與治療，迫切需要一種低成本、高通量的直接測(cè)序方法?；诩{米孔的單分子測(cè)序被認(rèn)為是最有希望實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)的關(guān)鍵技術(shù)。
截止目前，已經(jīng)報(bào)道的各種基于納米孔的DNA單分子測(cè)序方法中，離子電流阻塞法提出的最早，研究也最為廣泛。這種方法的基本原理如下，測(cè)序反應(yīng)腔被帶有納米孔的膜一分為二，單鏈DNA分子被加入到膜的一邊，在膜另一邊正電位電極的吸引下，帶有負(fù)電荷的聚合鏈進(jìn)入納米孔，并從膜的一邊滑動(dòng)到膜的另一邊，在聚合鏈穿越納米孔時(shí)對(duì)會(huì)對(duì)原有的納米孔中離子電流造成堵塞，電流會(huì)急劇下降到原電流的10%左右，研究人員通過(guò)對(duì)多聚核苷酸鏈穿越過(guò)程的穿越時(shí)間(t)、阻塞發(fā)生的間隙(At)以及阻塞電流(IB)的定量檢測(cè)來(lái)實(shí)現(xiàn)DNA分子測(cè)序。然而，這種納米孔離子電流阻塞法在實(shí)際應(yīng)用中面臨一些根本性的問(wèn)題。早期所采用的生物分子納米孔(其典型代表是α -溶血素蛋白分子(protein a -hemolysin)構(gòu)成的納米孔)穩(wěn)定性差、壽命短，對(duì)環(huán)境因素極其敏感，且生物分子納米孔的孔徑難以人工控制，內(nèi)部孔徑僅約為I. 5nm，不適于不同核酸分子的檢測(cè)。目前普遍采用的固態(tài)納米孔(Solid-state nanopore)雖然克服了上述生物分子納米孔的缺點(diǎn),但是也存在如下問(wèn)題首先，固態(tài)納米孔通道長(zhǎng)度通常為5nm以上，可以容納十多個(gè)堿基，這一尺寸對(duì)于測(cè)序所需要的分辨單個(gè)堿基引起的電流變化過(guò)長(zhǎng)；其次，當(dāng)單個(gè)核苷酸占據(jù)納米孔時(shí)只有大約100個(gè)離子穿過(guò)納米孔，而4個(gè)堿基在結(jié)構(gòu)上只有數(shù)個(gè)原子的差異，這種細(xì)微的結(jié)構(gòu)化差異導(dǎo)致的離子電流變化很微弱，以至于研究人員很難區(qū)分出每個(gè)堿基；第三，基于固態(tài)納米孔的測(cè)序方法目前尚不能有效地控制DNA通過(guò)納米孔的速度，由于速度太快，造成了堿基檢測(cè)識(shí)別率不高。這些問(wèn)題嚴(yán)重制約了這種測(cè)序方法的實(shí)際應(yīng)用。借助于其他輔助手段的各種納米孔測(cè)序方法，如熒光標(biāo)記輔助納米孔測(cè)序法、雜交輔助納米孔測(cè)序法、隧道電流輔助納米孔測(cè)序法、以及探針修飾納米孔測(cè)序法等，在本質(zhì)上仍屬于間接測(cè)序方法，存在設(shè)備復(fù)雜、低速、高成本等問(wèn)題。所以，實(shí)現(xiàn)千美元人類基因組(TDG)目標(biāo)、甚至百美元人類基因組(HDG)目標(biāo)，推進(jìn)個(gè)體化疾病診斷與治療的發(fā)展，需要新型的直接、高效、低成本測(cè)序方法。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出了一種基于石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)的DNA測(cè)序裝置及方法，能夠?qū)崿F(xiàn)DNA分子的準(zhǔn)確、高效、低成本測(cè)序。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案基于石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)的DNA測(cè)序裝置，該DNA測(cè)序裝置是以石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)為核心組裝的測(cè)序裝置，具體包括置于電解液11中的硅基襯底1，在硅基襯底I上半部刻蝕有倒金字塔形微腔2，下半部刻蝕有直徑大于倒金字塔形微腔2塔底直徑的柱狀孔，倒金字塔形微腔2的塔頂為固態(tài)納米孔3，絕緣層6包覆在硅基襯底I外部，在硅基襯底I上部有通過(guò)內(nèi)置電極8固定于絕緣層6上的石墨烯微帶4，石墨烯微帶4上刻蝕有石墨烯納米孔5，石墨烯納米孔5和固態(tài)納米孔3同軸，所述石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)將測(cè)序反應(yīng)腔分為上下兩部分，置于反應(yīng)腔上部的外接電極7接負(fù)電位，置于反應(yīng)腔下部的外接電極7接正電位，外接電極7和縱向微弱電流測(cè)量設(shè)備9以及電源12構(gòu)成縱向微弱電流測(cè)量回路，內(nèi)置電極8和橫向微弱電流測(cè)量設(shè)備10以及電源14構(gòu)成橫向微弱電流測(cè)量回路。所述固態(tài)納米孔3的直徑為I. 5-10nm。 所述石墨烯納米孔5的直徑為I. 5_7nm。所述石墨烯微帶4為單層或多層石墨烯。所述縱向微弱電流測(cè)量設(shè)備9為皮安級(jí)電流測(cè)量?jī)x。所述橫向微弱電流測(cè)量設(shè)備10為亞微安級(jí)電流測(cè)量?jī)x。用于產(chǎn)生驅(qū)動(dòng)單鏈DNA分子13穿越石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)的靜電場(chǎng)由電源12提供，所述電源12的偏置電壓應(yīng)為O. 05-0. 2V，靠近石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)中石墨烯納米孔5 —側(cè)的電極接負(fù)電位，靠近固態(tài)納米孔3 —側(cè)的電極接正電位。所述電解液11為KCl、NaCl或LiCl溶液，其濃度為O. 8 I. 5mol/L, pH值為8. O。上述所述的DNA測(cè)序裝置的測(cè)序方法，首先將單鏈DNA分子13加入到盛有電解液11的測(cè)序反應(yīng)腔上部，在靜電場(chǎng)的驅(qū)動(dòng)作用下，單鏈DNA分子13成線狀通過(guò)石墨烯納米孔5，進(jìn)入倒金字塔形微腔2，并最終通過(guò)固態(tài)納米孔3到達(dá)測(cè)序反應(yīng)腔的下部；在單鏈DNA分子13穿越石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)時(shí)，一方面對(duì)通過(guò)石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)的電解液離子電流造成堵塞，導(dǎo)致縱向離子電流急劇變化，另一方面，對(duì)石墨烯納米孔5周邊電導(dǎo)產(chǎn)生影響，導(dǎo)致石墨烯微帶4中橫向電流密度發(fā)生改變，由于單鏈DNA分子13中不同堿基結(jié)構(gòu)不同，在穿越石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)時(shí)在上述縱向和橫向兩個(gè)方向造成的電流和電導(dǎo)改變也不同，采用縱向微弱電流測(cè)量設(shè)備9對(duì)單鏈DNA分子13穿越石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)過(guò)程中的穿越時(shí)間t，縱向離子電流發(fā)生阻塞的時(shí)間間隔At1、阻塞離子電流的大小IB1進(jìn)行定量檢測(cè)；采用橫向微弱電流測(cè)量設(shè)備10對(duì)橫向石墨烯微帶4中電流密度發(fā)生改變的時(shí)間間隔At2、電流的大小IB2進(jìn)行定量檢測(cè)；再通過(guò)對(duì)所測(cè)得的雙向數(shù)據(jù)進(jìn)行解析計(jì)算DNA分子序列Sequence=f (t, Δ t” IB1, Δ t2, IB2)，即可得到所測(cè)DNA分子的序列。本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)第一，本發(fā)明所采用的石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)中，固態(tài)納米孔克服了生物分子納米孔的不穩(wěn)定性和孔徑不易控制性；石墨烯納米孔的采用解決了常規(guī)固態(tài)納米孔通道太長(zhǎng)導(dǎo)致測(cè)序分辨率難以達(dá)到單個(gè)堿基的問(wèn)題。此外，通過(guò)在石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)周圍增加環(huán)形電場(chǎng)、改變電解質(zhì)溶液組分、控制溫度、改變石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)容積等方法，可以調(diào)節(jié)、甚至定量控制單鏈DNA分子通過(guò)納米孔的速度，為檢測(cè)贏得了時(shí)間。這些優(yōu)點(diǎn)為實(shí)現(xiàn)單堿基分辨率、直接納米孔測(cè)序奠定了基礎(chǔ)。第二，本發(fā)明采用了 DNA分子穿越石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔孔結(jié)構(gòu)時(shí)，縱向離子電流阻塞和橫向石墨烯微帶中納米孔周圍電導(dǎo)變化的雙數(shù)據(jù)解析測(cè)序新思想。采用這種雙向數(shù)據(jù)解析測(cè)序可以提供單鏈DNA分子穿越石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)時(shí)更多的信息，改善了傳統(tǒng)納米孔離子電流阻塞法信噪比低、易受外界環(huán)境干擾等問(wèn)題，從而提高測(cè)序精度，有望從根本上解決目前新一代DNA測(cè)序所面臨的問(wèn)題。



附圖為本發(fā)明基于石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)的DNA測(cè)序裝置及測(cè)序方法原理示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。如附圖所示，基于石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)的DNA測(cè)序裝置，該DNA測(cè)序裝置是以石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)為核心組裝的測(cè)序裝置，具體包括置于電解液11中的硅基襯底1，在硅基襯底I上半部刻蝕有倒金字塔形微腔2，下半部刻蝕有直徑大于倒金字塔形微腔2塔底直徑的柱狀孔，倒金字塔形微腔2的塔頂為固態(tài)納米孔3，倒金字塔形微腔2用于控制DNA分子鏈穿越固態(tài)納米孔3的速度，絕緣層6包覆在硅基襯底I外部，用來(lái)保證硅基襯底I與石墨烯微帶4間的絕緣，在硅基襯底I上部有通過(guò)內(nèi)置電極8固定于絕緣層6上的石墨烯微帶4，石墨烯微帶4中央刻蝕有石墨烯納米孔5，石墨烯納米孔5和固態(tài)納米孔3同軸，所述石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)將測(cè)序反應(yīng)腔分為上下兩部分，置于反應(yīng)腔上部的外接電極7接負(fù)電位，置于反應(yīng)腔下部的外接電極7接正電位，外接電極7和縱向微弱電流測(cè)量設(shè)備9以及電源12構(gòu)成縱向微弱電流測(cè)量回路，縱向微弱電流測(cè)量設(shè)備9用于測(cè)量縱向離子電流阻塞，內(nèi)置電極8和橫向微弱電流測(cè)量設(shè)備10以及電源14構(gòu)成橫向微弱電流測(cè)量回路，橫向微弱電流測(cè)量設(shè)備10用于測(cè)量橫向石墨烯微帶4中石墨烯納米孔5周圍電導(dǎo)的變化。優(yōu)選固態(tài)納米孔3的直徑為I. 5-10nm。優(yōu)選石墨烯納米孔5的直徑為I. 5_7nm。優(yōu)選石墨烯微帶4為單層或多層石墨烯。優(yōu)選縱向微弱電流測(cè)量設(shè)備9為皮安級(jí)電流測(cè)量?jī)x。優(yōu)選橫向微弱電流測(cè)量設(shè)備10為亞微安級(jí)電流測(cè)量?jī)x。用于產(chǎn)生驅(qū)動(dòng)單鏈DNA分子13穿越石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)的靜電場(chǎng)由電源12提供，優(yōu)選電源12的偏置電壓為O. 05-0. 2V，靠近石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)中石墨烯納米孔5 —側(cè)的電極接負(fù)電位，靠近固態(tài)納米孔3 —側(cè)的電極接正電位。優(yōu)選電解液11為KCl、NaCl或LiCl溶液，其濃度為O. 8 I. 5mol/L, pH值為8. O。本發(fā)明一種基于石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)的DNA測(cè)序方法，首先將單鏈DNA分子13加入到盛有電解液11的測(cè)序反應(yīng)腔上部，在靜電場(chǎng)的驅(qū)動(dòng)作用下，單鏈DNA分子13成線狀通過(guò)石墨烯納米孔5，進(jìn)入倒金字塔形微腔2，并最終通過(guò)固態(tài)納米孔3到達(dá)測(cè)序反應(yīng)腔的下部；在單鏈DNA分子13穿越石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)時(shí)，一方面對(duì)通過(guò)石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)的電解液離子電流造成堵塞，導(dǎo)致縱向離子電流急劇變化，另一方面，對(duì)石墨烯納米孔5周邊電導(dǎo)產(chǎn)生影響，導(dǎo)致石墨烯微帶4中橫向電流密度發(fā)生改變，由于單鏈DNA分子13中不同堿基結(jié)構(gòu)不同，在穿越石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)時(shí)在上述縱向和橫向兩個(gè)方向造成的電流和電導(dǎo)改變也不同，采用縱向微弱電流測(cè)量設(shè)備9對(duì)單鏈DNA分子13穿越石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)過(guò)程中的穿越時(shí)間t，縱向離子電流發(fā)生阻塞的時(shí)間間隔At1、阻塞離子電流的大小IB1進(jìn)行定量檢測(cè)。采用橫向微弱電流測(cè)量設(shè)備10對(duì)橫向石墨烯微帶4中電流密度發(fā)生改變的時(shí)間間隔At2、電流的大小IB2進(jìn)行定量檢測(cè)；再通過(guò)對(duì)所測(cè)得的雙向數(shù)據(jù)進(jìn)行解析計(jì)算DNA分子序列Sequence=f (t, Δ t1； IB1, Δ t2, IB2)，即可得到所測(cè)DNA分子的序列?！?br> 權(quán)利要求
1.基于石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)的DNA測(cè)序裝置，其特征在于該DNA測(cè)序裝置是以石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)為核心組裝的測(cè)序裝置，具體包括置于電解液(11)中的硅基襯底(1)，在硅基襯底(I)上半部刻蝕有倒金字塔形微腔(2)，下半部刻蝕有直徑大于倒金字塔形微腔(2)塔底直徑的柱狀孔，倒金字塔形微腔(2)的塔頂為固態(tài)納米孔(3)，絕緣層(6)包覆在硅基襯底(I)外部，在硅基襯底(I)上部有通過(guò)內(nèi)置電極(8)固定于絕緣層(6)上的石墨烯微帶(4)，石墨烯微帶(4)中央刻蝕有石墨烯納米孔(5)，石墨烯納米孔(5)和固態(tài)納米孔(3)同軸，所述石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)將測(cè)序反應(yīng)腔分為上下兩部分，置于反應(yīng)腔上部的外接電極(7)接負(fù)電位，置于反應(yīng)腔下部的外接電極(7)接正電位，外接電極(7)和縱向微弱電流測(cè)量設(shè)備(9)以及電源(12)構(gòu)成縱向微弱電流測(cè)量回路，內(nèi)置電極(8)和橫向微弱電流測(cè)量設(shè)備(10)以及電源(14)構(gòu)成橫向微弱電流測(cè)量回路。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的DNA測(cè)序裝置，其特征在于所述固態(tài)納米孔(3)的直徑為I. 5_10nmo
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的DNA測(cè)序裝置，其特征在于所述石墨烯納米孔(5)的直徑為I.5_7nm0
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的DNA測(cè)序裝置，其特征在于所述石墨烯微帶(4)為單層或多層石墨稀。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的DNA測(cè)序裝置，其特征在于所述縱向微弱電流測(cè)量設(shè)備(9)為皮安級(jí)電流測(cè)量?jī)x。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的DNA測(cè)序裝置，其特征在于所述橫向微弱電流測(cè)量設(shè)備(10)為亞微安級(jí)電流測(cè)量?jī)x。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的DNA測(cè)序裝置，其特征在于用于產(chǎn)生驅(qū)動(dòng)單鏈DNA分子(13)穿越石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)的靜電場(chǎng)由電源(12)提供，所述電源(12)的偏置電壓應(yīng)為O. 05-0. 2V，靠近石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)中石墨烯納米孔(5)一側(cè)的電極接負(fù)電位，靠近固態(tài)納米孔(3) 一側(cè)的電極接正電位。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的DNA測(cè)序裝置，其特征在于所述電解液(11)為KCl、NaCl或LiCl溶液，其濃度為O. 8 I. 5mol/L, pH值為8. O。
9.權(quán)利要求I至8任一項(xiàng)所述的DNA測(cè)序裝置的測(cè)序方法，其特征在于首先將單鏈DNA分子(13)加入到盛有電解液(11)的測(cè)序反應(yīng)腔上部，在靜電場(chǎng)的驅(qū)動(dòng)作用下，單鏈DNA分子(13)成線狀通過(guò)石墨烯納米孔(5)，進(jìn)入倒金字塔形微腔(2)，并最終通過(guò)固態(tài)納米孔(3)到達(dá)測(cè)序反應(yīng)腔的下部；在單鏈DNA分子(13)穿越石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)時(shí)，一方面對(duì)通過(guò)石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)的電解液離子電流造成堵塞，導(dǎo)致縱向離子電流急劇變化，另一方面，對(duì)石墨烯納米孔(5)周邊電導(dǎo)產(chǎn)生影響，導(dǎo)致石墨烯微帶(4)中橫向電流密度發(fā)生改變，由于單鏈DNA分子(13)中不同堿基結(jié)構(gòu)不同，在穿越石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)時(shí)在上述縱向和橫向兩個(gè)方向造成的電流和電導(dǎo)改變也不同，采用縱向微弱電流測(cè)量設(shè)備(9)對(duì)單鏈DNA分子(13)穿越石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)過(guò)程中的穿越時(shí)間t，縱向離子電流發(fā)生阻塞的時(shí)間間隔At1、阻塞離子電流的大小IB1進(jìn)行定量檢測(cè)，采用橫向微弱電流測(cè)量設(shè)備(10)對(duì)橫向石墨烯微帶(4)中電流密度發(fā)生改變的時(shí)間間隔At2、電流的大小IB2進(jìn)行定量檢測(cè)，再通過(guò)對(duì)所測(cè)得的雙向數(shù)據(jù) 進(jìn)行解析計(jì)算DNA分子序列Sequence=f (t，Δ t1 IB1, Δ t2，IB2)，即可得到所測(cè)DNA分子的序列。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種基于石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)的DNA測(cè)序裝置及方法，該測(cè)序裝置主要由帶有石墨烯納米孔的石墨烯微帶、硅基襯底中倒金字塔形微腔、微腔頂部的固態(tài)納米孔構(gòu)成。測(cè)序時(shí)，測(cè)序反應(yīng)腔被石墨烯納米孔-微腔-固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)一分為二，單鏈DNA分子在靜電場(chǎng)的作用下成線狀穿過(guò)石墨烯納米孔，進(jìn)入倒金字塔形微腔，最后經(jīng)固態(tài)納米孔穿出。利用微弱電流測(cè)量設(shè)備同時(shí)測(cè)量DNA分子穿越活動(dòng)引起的納米孔中縱向離子電流阻塞和石墨烯微帶中納米孔周圍橫向電導(dǎo)變化，進(jìn)而利用同步數(shù)據(jù)記錄和處理系統(tǒng)對(duì)雙向數(shù)據(jù)進(jìn)行解析計(jì)算，實(shí)現(xiàn)單鏈DNA分子的序列分析。
文檔編號(hào)C12M1/34GK102899243SQ20121035570
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月21日
發(fā)明者劉澤文, 鄧濤, 陳劍 申請(qǐng)人:清華大學(xué)