多肽、包含該多肽的檢測器件和檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及多肽、包含該多肽的檢測器件和檢測試劑盒。本發(fā)明的多肽由SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列構(gòu)成。本發(fā)明的多肽、包含該多肽的檢測器件和檢測試劑盒在糖尿病和/或結(jié)核病的診斷中是有用的。
【專利說明】多肽、包含該多肽的檢測器件和檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明主要涉及多肽、包含該多肽的檢測器件及檢測試劑盒，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)是由遺傳和環(huán)境因素共同引起的一組以糖代謝紊亂為主要表現(xiàn)的臨床綜合征。胰島素缺乏和胰島素作用障礙單獨(dú)或同時(shí)引起糖類、脂肪、蛋白質(zhì)、水和電介質(zhì)等的代謝紊亂，臨床以慢性高血糖為主要特征。典型病例可出現(xiàn)多尿、多飲、多食、消瘦等表現(xiàn)，即“三多一少”癥狀。
[0003]在歐洲糖尿病學(xué)會(huì)(EuropeanAssociation forthe Study of Diabetes,EASD) 2011 年會(huì)上，國際糖尿病聯(lián)盟(International Diabetes Federation, IDF)發(fā)布最新數(shù)據(jù)顯示:2011年全世界糖尿病患病人數(shù)已達(dá)3.66億，較2010年的2.85億增加近30%。每年有460萬人死于糖尿病，用于糖尿病的醫(yī)療費(fèi)用高達(dá)4650億美元。IDF主席JeanClaudeManbaya教授說:“在2011年，每7秒鐘就有I人因糖尿病死亡，警鐘正在敲響”。據(jù)中國之聲2011年11月報(bào)道，我國已確診的糖尿病患者人數(shù)高達(dá)9240萬人，為世界第一。全國20歲以上的成人中，糖尿病發(fā)病率高達(dá)9.7%。
[0004]糖尿病按其病因?qū)W分類可分為I型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病及特殊類型糖尿病。
[0005]目前醫(yī)院主要依據(jù)臨床表現(xiàn)(如I型糖尿病多發(fā)于青少年時(shí)期，且有典型的“三多一少”癥狀，依賴于胰島素等)區(qū)分I型和2型糖尿病，對(duì)分型不明確的糖尿病患者如成人隱匿性自身免疫性糖尿病(latent autoimmune diabetes in adults, LADA)、及確診I型糖尿病則需要檢測I型糖尿病自身抗體來輔助診斷。`
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)糖尿病、特別是I型糖尿病的診斷有用的多肽、編碼該多肽的核酸、包含該核酸的表達(dá)載體、導(dǎo)入了該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞、抗該多肽的抗體、包含該多肽的檢測器件、包含該多肽或該檢測器件的檢測試劑盒、以及該多肽在檢測I型糖尿病中的用途、該多肽在制備用于檢測I型糖尿病的試劑盒或檢測器件中的用途。
[0007]此外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的多肽對(duì)于結(jié)核病的診斷也是有用的。因此，本發(fā)明還提供用于檢測結(jié)核病的多肽、編碼該多肽的核酸、包含該核酸的表達(dá)載體、導(dǎo)入了該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞、抗該多肽的抗體、包含該多肽的檢測器件、包含該多肽或該檢測器件的檢測試劑盒、以及該多肽在檢測結(jié)核病中的用途、該多肽在制備用于檢測結(jié)核病的試劑盒或檢測器件中的用途。
[0008]即，本發(fā)明包含下述技術(shù)方案:
[0009]1.由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
[0010]2.編碼權(quán)利要求1所述的多肽的核酸。
[0011]3.包含權(quán)利要求2所述的核酸的表達(dá)載體。[0012]4.導(dǎo)入了權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0013]5.一種檢測器件，其包括:
[0014]固體載體，以及
[0015]連接于該固體載體上的權(quán)利要求1所述的多肽。
[0016]6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測器件，其中，所述固體載體是SJ改性硅膠。
[0017]7.一種檢測試劑盒，其包括權(quán)利要求1所述的多肽、或者權(quán)利要求5或6所述的檢測器件。
[0018]8.抗權(quán)利要求1所述的多肽的抗體。
[0019]9.權(quán)利要求1所述的多肽在制備用于檢測I型糖尿病和/或結(jié)核病的試劑盒或檢測器件中的用途。
[0020]將本發(fā)明的多肽應(yīng)用于糖尿病(特別是I型糖尿病)和/或結(jié)核病的診斷，能夠取得令人滿意的效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1將多肽通過化 學(xué)共價(jià)固定于SJ改性硅膠表面的示意圖。
[0022]圖2對(duì)化學(xué)合成的本發(fā)明的多肽進(jìn)行確認(rèn)的表征圖譜。
[0023]圖3對(duì)SJ改性硅膠(iPDMS薄膜)的制作過程進(jìn)行說明的示意圖。
[0024]圖4對(duì)多肽微陣列化學(xué)固定過程進(jìn)行說明的圖。
[0025]圖5說明多肽微陣列點(diǎn)樣模式的示意圖。
[0026]圖6~8顯示對(duì)不同血清進(jìn)行檢測的結(jié)果的照片。
[0027]發(fā)明的【具體實(shí)施方式】
[0028]本發(fā)明的多肽
[0029]本發(fā)明的多肽是30肽。本發(fā)明的30肽由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列構(gòu)成，即:MNGEE QYYAA TQLYK DPCAF QRGPA PEFSA。如實(shí)施例所示，其對(duì)I型糖尿病病人的血清呈陽性反應(yīng)，而對(duì)健康正常人或非I型糖尿病且非結(jié)核病人血清呈陰性反應(yīng)。因此，該30肽作為I型糖尿病的診斷工具是有用的。此外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，如實(shí)施例所示，本發(fā)明的30肽對(duì)結(jié)核病人的血清呈陽性反應(yīng)。因此，該30肽作為結(jié)核病的診斷工具也是有用的。優(yōu)選地，本發(fā)明的30肽可用作結(jié)核病并發(fā)I型糖尿病的診斷工具。
[0030]本發(fā)明的多肽在有市售的情況下，可以使用市售品，此外，還可以適宜采用⑴化學(xué)合成方法、或(2)酶反應(yīng)合成方法等公知方法來獲得，其中化學(xué)合成更為簡便。在化學(xué)合成本發(fā)明的多肽情況下，通過使用肽合成儀合成或者半合成該多肽來進(jìn)行。作為化學(xué)合成方法，可以列舉出例如肽固相合成法等。這樣合成的肽可以采用常規(guī)手段例如離子交換色譜、反相高效液體色譜、親和色譜等進(jìn)行純化。這樣的肽固相合成方法以及其后的肽純化都是本【技術(shù)領(lǐng)域】公知的。
[0031]此外，在通過酶反應(yīng)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的情況下，可以采用例如國際公開小冊(cè)子W02004/011653號(hào)所述的方法。即,可以這樣來生產(chǎn):將一方的氨基酸或二肽的羧基末端被酯化或酰胺化而得到的氨基酸或二肽、與氨基酸處于游離狀態(tài)的氨基酸(例如羧基保護(hù)的氨基酸)在肽合成酶的存在下進(jìn)行反應(yīng)，生成的二肽或三肽。作為肽合成酶，可以列舉出:具有生成肽的能力的微生物的培養(yǎng)物、由該培養(yǎng)物分離的微生物菌體、或該微生物的菌體處理物、或該微生物來源的肽合成酶。
[0032]而且，除了上述的酶方法、化學(xué)合成方法以外，有些情況下，本發(fā)明的多肽還可能是天然存在(但未被分離出來)的。在天然存在的情況下，還可以將其分離出來。
[0033]本發(fā)明的核酸、表達(dá)載體宿主細(xì)胞，以及抗本發(fā)明的多肽的抗體
[0034]本發(fā)明還涉及編碼該多肽的核酸(本發(fā)明的核酸)、包含該核酸的表達(dá)載體(本發(fā)明的表達(dá)載體)、導(dǎo)入了該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞(本發(fā)明的宿主細(xì)胞)，它們優(yōu)選可用于生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。本發(fā)明的核酸、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來制備。本發(fā)明還涉及抗本發(fā)明的多肽的抗體，其可用于檢測本發(fā)明的抗體。本發(fā)明的抗體可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來制備。
[0035]本發(fā)明的檢測器件
[0036]本發(fā)明還涉及一種檢測器件(本發(fā)明的檢測器件)，其包括固體載體、以及連接于該固體載體上的本發(fā)明的多肽。
[0037]在本發(fā)明中，對(duì)固體載體沒有特殊限制，只要是作為固體或不溶性材料(例如是可以通過過濾、沉淀、磁性分離等從反應(yīng)混合物中分離的材料)的載體即可。
[0038]構(gòu)成固體載體的材料包括但不限于:硅膠(聚二甲基硅氧烷，PDMS)、纖維素、特氟隆?、硝基纖維素、瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、 聚丙烯、尼龍、聚偏二氟乙烯、膠乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纖維、金、鉬、銀、銅、鐵、不銹鋼、鐵氧體、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亞胺、聚乳酸、樹脂、多糖類、蛋白(白蛋白等)、碳或它們的組
人坐I=I 寸 O
[0039]固體載體的形狀包括但不要限于:珠子、磁珠、薄膜、微細(xì)管、濾膜、板、微量板、碳納米管、傳感器芯片等。正如本【技術(shù)領(lǐng)域】公知的那樣，薄膜或板等平坦的固體載體上可以設(shè)置凹坑、溝槽、濾膜底部等。
[0040]在本發(fā)明中，磁珠可以具有約25ηm約Imm范圍的球體直徑。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，磁珠具有約50um約IOym范圍的直徑。磁珠的尺寸可以根據(jù)特定的用途來進(jìn)行選擇。
[0041]在本發(fā)明中，由Sepharose等高交聯(lián)球形瓊脂糖制成的珠子具有約24 μ m約165 μ m范圍的直徑。優(yōu)選地，高交聯(lián)球形瓊脂糖珠具有約24 μ m約44 μ m范圍的直徑。高交聯(lián)球形瓊脂糖珠的尺寸可以根據(jù)特定的用途來進(jìn)行選擇。
[0042]具有疏水性表面的固體載體的例子包括可從Polysciences, Warrington, PA或Spherotech, Liberville, IL購買的制品等聚苯乙烯膠乳珠。
[0043]二氧化硅(SiO2)-處理或二氧化硅(SiO2)基的固體載體的例子包括可從Polysciences, Warrington, PA購買的超常磁性二氧化娃珠等,其可以用于捕捉核酸(例如DNA) ο或者，還可以使用可從Dynal Biotech購買的M-280等。
[0044]具有親水性表面的磁珠可用于捕捉增殖期的細(xì)菌細(xì)胞、核酸以及其它成分。作為該磁珠的例子，可以列舉出Polysciences, Warrington, PA銷售的珠子(名稱:Biomag(注冊(cè)商標(biāo))羧基)、或者 Bangs Laboratory, Inc.,Fishers, IN 的名稱為 MC02N/2928 的珠子?；蛘?，可以使用Dynal Biotech銷售的M-270等。
[0045]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述固體載體是SJ改性硅膠。蘇州傯聚生物材料有限公司開發(fā)的一種硅橡膠材質(zhì)的微陣列固體支撐材料(iPDMS薄膜，參見中國專利CN101265329A)。這種材料是以生物學(xué)研究常用的PDMS為基礎(chǔ)，在其中加入特定的引發(fā)劑成份(使該材料可通過表面引發(fā)聚合反應(yīng)(SIP)實(shí)現(xiàn)表面功能化修飾)，再經(jīng)過聚乙二醇甲基丙烯酸酯(poly (oligo (ethylene glycol)methacrylate), pOEGMA)表面修飾獲得的。SJ改性硅膠具有優(yōu)秀的抗蛋白質(zhì)非特異性吸附(Nonspecific protein adsorption, NPA)能力，可以將復(fù)雜蛋白免疫檢測中的非特異性蛋白質(zhì)吸附控制到接近“絕對(duì)O”水平(接近或低于儀器的檢測極限)，不僅可以免除封閉和多次清洗的麻煩，還可以通過使用更強(qiáng)的信號(hào)擴(kuò)增手段來提高蛋白質(zhì)微陣列的靈敏性。而且其硅橡膠的本質(zhì)賦予了該材料較強(qiáng)的機(jī)械性能和良好的可操作性。蘇州傯聚已經(jīng)成功地將SJ改性硅膠應(yīng)用于11個(gè)腫瘤標(biāo)志物組成的多指標(biāo)聯(lián)檢微陣列ELISA試劑盒，實(shí)現(xiàn)了高通量和高靈敏的檢測，證明了這種材料是一種優(yōu)秀的蛋白質(zhì)微陣列固體支撐材料。同時(shí)，這種材料還具有表面性質(zhì)可調(diào)的特性，可以通過控制修飾反應(yīng)時(shí)間在一定范圍內(nèi)調(diào)整其表面形貌。
[0046]本發(fā)明的多肽與固體載體的連接可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多肽與固體載體的連接方法來進(jìn)行。例如，對(duì)于蛋白質(zhì)/多肽與改性硅膠表面的連接而言，可以通過1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺[l-ethyl-3- (3-dimethyl am1-nopropyl)carbodiimide, EDC]和N-羥基玻拍酸亞胺(N-hydroxysuccinimide, NHS)的反應(yīng)將改性娃膠表面高分子鏈上的羧基(-C00H)基團(tuán)改為活化基團(tuán)，該活化基團(tuán)可與蛋白/多肽上所帶的氨基(-NH2)反應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)將蛋白/多肽固定于固體載體表面(參見圖1)。
[0047]對(duì)于點(diǎn)樣時(shí)使用的點(diǎn)樣液中本發(fā)明的多肽的濃度沒有特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以依常規(guī)選擇，優(yōu)選為I μ g^lOOO μ g/mL,更優(yōu)選10 μ g^500 μ g/mL。此外，對(duì)于本發(fā)明的多肽在固體載體上分布的密度沒有特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以依常規(guī)選擇，優(yōu)選為1~100 點(diǎn) /10mm2，更優(yōu)選 5~50 點(diǎn) /IOmm20
[0048]本發(fā)明的檢測器件可以用于檢測糖尿病(特別是I型糖尿病)和/或結(jié)核病、或者制備用于檢測糖尿病(特別是I型糖尿病)和/或結(jié)核病 的試劑盒。
[0049]本發(fā)明的檢測試劑盒
[0050]本發(fā)明還涉及一種檢測試劑盒(本發(fā)明的檢測試劑盒)，其包括本發(fā)明的多肽或檢測器件。該檢測試劑盒優(yōu)選用于檢測糖尿病(特別是I型糖尿病)和/或結(jié)核病，更優(yōu)選用于檢測結(jié)核病并發(fā)I型糖尿病。
[0051]本發(fā)明的檢測器件或本發(fā)明的多肽是本發(fā)明的檢測試劑盒的要件。本發(fā)明的檢測試劑盒還可以包括:
[0052]1.配好的血清稀釋液或血清稀釋液組分溶液:血清稀釋液，例如有北京賽馳生物科技有限公司的樣本稀釋液(產(chǎn)品編號(hào)070021-S2)、鄭州博威嘉生物科技有限公司的加樣變色樣本稀釋液(產(chǎn)品編號(hào)bwj010103)等。該血清稀釋液用來稀釋血清，試劑盒檢測的血清要稀釋適當(dāng)倍數(shù)，例如2~200倍，優(yōu)選10-100倍。
[0053]本發(fā)明的檢測試劑盒還可以包括:
[0054]2.濃縮洗液:固體載體表面孵育血清及酶標(biāo)二抗后，需用洗液清洗掉固體載體表面未結(jié)合的抗體和酶標(biāo)二抗。濃縮洗液例如是I %的吐溫20水溶液，使用時(shí)需稀釋2~40倍、優(yōu)選5~20倍。
[0055]本發(fā)明的檢測試劑盒還可以包括:
[0056]3.酶標(biāo)二抗溶液:1型糖尿病病人或結(jié)核病病人血清中的I型糖尿病自身抗體或結(jié)核病抗體(IgG)可與固體載體(例如SJ改性硅膠)上的本發(fā)明的多肽結(jié)合，二抗可與抗體結(jié)合，而二抗上的標(biāo)記物可與發(fā)光底物反應(yīng)，從而發(fā)出可檢測的光。酶標(biāo)二抗可以是例如辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG。作為酶標(biāo)二抗溶液，可以列舉出北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG(H+L)，產(chǎn)品編號(hào)ZB-2304。對(duì)酶標(biāo)二抗在酶標(biāo)二抗溶液中的濃度沒有特殊限制，可以是例如Ing~1000ng/mL。
[0057]本發(fā)明的檢測試劑盒還可以包括:
[0058]4.發(fā)光液組分溶液:發(fā)光液可與二抗上標(biāo)記的辣根過氧化物酶反應(yīng)，使得反應(yīng)發(fā)出儀器可檢測到的化學(xué)光。發(fā)光液由兩種溶液混合而成，分別是A液一過氧化氫溶液，及B液一發(fā)光氨溶液。發(fā)光氨(魯米諾)只有用氧化劑處理過才會(huì)發(fā)光。通常使用雙氧水和一種氫氧化物堿的混合水溶液作為激發(fā)劑。在辣根過氧化物酶催化下，雙氧水分解為氧氣和水:
[0059]2 H2 O2 — 02+2H20
[0060]魯米諾與氫氧化物反應(yīng)時(shí)生成了一個(gè)雙負(fù)離子，它可被過氧化氫分解出的氧氣氧化，產(chǎn)物為一個(gè)有機(jī)過氧化物。該過氧化物很不穩(wěn)定，立即分解出氮?dú)?，生成激發(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸。激發(fā)態(tài)至基態(tài)轉(zhuǎn)化中，釋放的能量以光子的形式存在，波長位于可見光的藍(lán)光部分。發(fā)光液組分溶液的例子例如Thermo Seientific公司的SuperSignal.? ELISAFemto Maximum Sensitivity Substrate,貨號(hào) 37074。
[0061]本發(fā)明的檢測試劑盒還可以包括:
[0062]5.一個(gè)或兩個(gè)以上的反應(yīng)腔體(例如中國專利授權(quán)公告CN202054829U)。
[0063]本發(fā)明的檢測試劑盒還可以包括:
[0064]6.其他用于檢測糖尿病(特別是I型糖尿病)和/或結(jié)核病的檢測分子(例如多肽、蛋白質(zhì)、核酸等)。
`[0065]本發(fā)明的檢測試劑盒還可以包括:
[0066]7.使用說明書。
實(shí)施例
[0067]以下，通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明，但并不是對(duì)本發(fā)明技術(shù)范圍的限定。通過本說明書的記載，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易的對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修飾/改變，這些包含在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。
[0068]L 30狀的制各與確認(rèn)
[0069]實(shí)施例中使用的30肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，由吉爾生化(上海)有限公司合成，該多肽的表征圖譜見圖2，可以確認(rèn)合成了所述多肽。
[0070]2.檢測器件的制備
[0071]檢測芯片是以SJ改性硅膠(iPDMS薄膜)為固體支撐材料，在其上通過點(diǎn)樣固定多肽溶液制備而成。改性硅膠是在傳統(tǒng)的聚二甲基硅氧烷材料中加入帶烯烴末端的、表面引發(fā)聚合反應(yīng)的引發(fā)劑，并通過熱交聯(lián)(硅氫鍵鍵合)固定到聚二甲基硅氧烷的三維結(jié)構(gòu)中，得到一種新的材料即SJ改性硅膠。其制作過程如圖3所示。
[0072]其中的A和B為聚二甲基硅氧烷的兩個(gè)組分，聚二甲基硅氧烷(Poly (dimethylsiloxane), Sylgard 184)購買自美國道康寧(DowCorning)公司，包含液態(tài)組分A(成分為金屬鉬催化劑與帶乙烯基的二甲硅氧烷高分子前體混合物)和交聯(lián)劑B(成分為帶有乙烯基和S1-H基團(tuán)的二甲基硅氧烷前體)兩種成分。C為末端帶乙烯基的引發(fā)劑，購于杭州東偉公司。最后修飾上的高分子是寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯單體(Olig0(ethyleneglycol)methacrylate,以下簡稱0EGMA,分子量Mw=526)購買于Aldrich。將聚二甲基娃氧烷前體A和交聯(lián)劑B與帶乙烯基末端的引發(fā)劑C以A:B:C=10:1:0.5比例充分混合。通過固化反應(yīng)制成透明的彈性硅橡膠，然后通過SIP技術(shù)進(jìn)行表面修飾即可得到SJ改性硅膠。實(shí)驗(yàn)表明，SJ改性硅膠的表面有足夠高密度的、通過共價(jià)鍵固定的引發(fā)劑，其可以通過表面引發(fā)聚合反應(yīng)(SIP)實(shí)現(xiàn)表面高分子修飾。使用poly(OEGMA)(聚乙二醇甲基丙烯酸酯)進(jìn)行反應(yīng)獲得聚乙二醇(Polyethylene Glycol, PEG)修飾的表面,實(shí)現(xiàn)較強(qiáng)的抗蛋白非特異性吸附的能力。
[0073]制好的SJ改性硅膠薄膜需保存在4°C冰箱中。
[0074]采用晶芯? PersonalArrayerTM 16個(gè)人點(diǎn)樣儀在改性硅膠上制備多肽微陣列，過程為:
[0075]I)預(yù)處理
[0076]將SJ改性硅膠薄片(15 X 15mm2)浸泡在活化液中，30min后取出用去離子水淋洗3次，用氮?dú)獯蹈桑R上用于點(diǎn)樣。
[0077]2)點(diǎn)樣
[0078]將點(diǎn)樣液稀釋好并轉(zhuǎn)移到384孔板相應(yīng)的微孔中，將帶樣本的384孔板置于點(diǎn)樣儀基臺(tái)上，同時(shí)將預(yù)處理的改性硅膠薄片置于點(diǎn)樣儀的基臺(tái)上，馬上進(jìn)行點(diǎn)樣。點(diǎn)樣環(huán)境條件為室溫(25°C)，濕度設(shè)定為50%。制成的多肽微陣列上每個(gè)點(diǎn)的點(diǎn)樣量約為0.6nL，樣點(diǎn)半徑為200 μ m。
[0079]3)化學(xué)固定
[0080]剛制好的多肽微陣列要放在恒溫恒濕箱(26°C，60%濕度)中固定至少6h?；瘜W(xué)固定過程如圖4所示。
[0081]首先通過點(diǎn)樣儀將包含有捕獲多肽分子的緩沖液點(diǎn)在改性硅膠薄膜上，接著緩沖液開始蒸發(fā)，捕獲多肽分子與SJ改性硅膠表面親密接觸并相互作用，通過化學(xué)結(jié)合，改性硅膠表面的Ploy(OEGMA)高分子的末端-COOH與多肽分子的-NH2形成穩(wěn)定共價(jià)鍵，進(jìn)而將有化學(xué)活性的多肽分子固定在SJ改性硅膠表面。
[0082]5)裝配
[0083]固定6h的多肽微陣列必須在兩天內(nèi)裝配好。首先通過背膠將SJ改性硅膠薄片貼在專門的反應(yīng)柱上，蓋上反應(yīng)腔體。一個(gè)反應(yīng)器由兩個(gè)反應(yīng)柱和一個(gè)反應(yīng)腔體組成。
[0084]6)保存
[0085]裝配好的多肽微陣列，需要抽真空密封，保存在4°C的冰箱中，備用。
[0086]3.用檢測器件進(jìn)行檢測
[0087]檢驗(yàn)步驟
[0088]1、開始檢測前，將濃縮清洗液按1:10的比例加入純化水或蒸餾水進(jìn)行稀釋，稀釋完成后直接使用。使用移液槍將2mL清洗液加到芯片表面，浸泡芯片3分鐘，保證芯片表面被完全浸潤。
[0089]2、將待測血清樣本用樣本稀釋液按照1:40稀釋混勻。
[0090]3、棄去浸泡芯片的清洗液，在芯片表面完全濕潤的狀態(tài)下，每個(gè)血清樣本吸取200 μ L稀釋后的血清加入到芯片反應(yīng)器內(nèi)。
[0091]4、將芯片反應(yīng)器放入芯片固定座，放到搖床上，開啟搖床，頻率150轉(zhuǎn)/分鐘，室溫孵育30分鐘。
[0092]5、棄去芯片反應(yīng)器內(nèi)的血清樣本，用15mL洗液清洗反應(yīng)腔體和芯片表面3次。
[0093]6、清洗完成后，每個(gè)芯片反應(yīng)器分別加入200 μ L酶標(biāo)抗體溶液，將芯片反應(yīng)器放入芯片固定座，放到搖床上，開啟搖床，頻率150轉(zhuǎn)/分鐘，室溫孵育30分鐘。
[0094]7、棄去芯片反應(yīng)器內(nèi)的酶標(biāo)抗體溶液，用15mL洗液清洗反應(yīng)腔體和芯片表面3次。
[0095]8、清洗完成后，取下反應(yīng)腔體，每個(gè)芯片表面分別加入15 μ L發(fā)光底物液，使發(fā)光液能均勻的鋪于芯片表面。
[0096]9、將加入了發(fā)光液的芯片置于凝膠成像儀中化學(xué)發(fā)光成像，并判讀結(jié)果。
[0097]結(jié)核病病人血清由江蘇省疾控中心提供，均為痰培養(yǎng)確診了的結(jié)核病病人血清，I型糖尿病病人血清及其他疾病病人血清樣本由合作醫(yī)院提供。血清由相關(guān)人員用冰塊/干冰等包裹運(yùn)送或快遞至實(shí)驗(yàn)室。
[0098]陰性對(duì)照有PBS緩沖液(即在第3步中不用待測血清孵育,而用PBS溶液孵育,其余步驟相同)的對(duì)照，血清稀釋液的對(duì)照，及陰性病人(指健康人血清及非I型糖尿病且非結(jié)核病病人)血清的對(duì)照。
[0099]多肽微陣列的點(diǎn)樣模式如圖5所示。其中，三角形的20個(gè)點(diǎn)的樣本為人IgG，作為實(shí)驗(yàn)的定位點(diǎn)；正方形的4`個(gè)點(diǎn)的樣本為PB點(diǎn)樣液，作為實(shí)驗(yàn)的空白對(duì)照；圓形點(diǎn)的的樣本是其他的I型糖尿病自身抗原蛋白多肽，作為實(shí)驗(yàn)的檢測指標(biāo)(這些多肽有響應(yīng)說明檢測血清中有I型糖尿病自身抗體)；星形點(diǎn)的樣本多肽即為本發(fā)明的多肽SEQ ID N0:1，它是I型糖尿病自身抗原蛋白多肽，會(huì)對(duì)I型糖尿病患者血清產(chǎn)生響應(yīng)，也會(huì)對(duì)結(jié)核病人血清產(chǎn)生響應(yīng)。
[0100]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖61所示。其中，圖6顯示了陰性對(duì)照的檢測結(jié)果，只有三角形所示的點(diǎn)的樣本有響應(yīng)。圖7顯示了 I型糖尿病病人血清的檢測結(jié)果，三角形、圓形和星形點(diǎn)的樣本有響應(yīng)。圖8顯示了結(jié)核病病人血清的檢測結(jié)果，三角形和星形點(diǎn)的樣本有響應(yīng)。需要說明的是，儀器測得信號(hào)值由低到高，相應(yīng)的信號(hào)點(diǎn)顏色由黑一紅一白漸變。
【權(quán)利要求】
1.由SEQID NO:1所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
2.編碼權(quán)利要求1所述的多肽的核酸。
3.包含權(quán)利要求2所述的核酸的表達(dá)載體。
4.導(dǎo)入了權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
5.一種檢測器件，其包括: 固體載體，以及 連接于該固體載體上的權(quán)利要求1所述的多肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測器件，其中，所述固體載體是SJ改性硅膠。
7.—種檢測試劑盒，其包括權(quán)利要求1所述的多肽、或者權(quán)利要求5或6所述的檢測器件。
8.抗權(quán)利要求1所述的多肽的抗體。
9.權(quán)利要求1所 述的多肽在制備用于檢測I型糖尿病和/或結(jié)核病的試劑盒或檢測器件中的用途。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK103665138SQ201210355395
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月21日
【發(fā)明者】劉星, 李鐘 , 馬雄明, 章為江 申請(qǐng)人:蘇州偲聚生物材料有限公司