專利名稱：一種pik3ca基因突變熒光定量pcr分型檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及ー種檢測基因突變的熒光定量PCR試劑盒及其檢測方法，尤其涉及ー種PIK3CA基因突變熒光定量PCR分型檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
PIK3CA(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic alpha)是由 Volinia 等1994年利用原位雜交技術(shù)檢測到的，是新近發(fā)現(xiàn)的一種體細(xì)胞突變的癌基因，其可能通過參與PIK3/AKT細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和凋亡。研究證明PIK3CA與多種惡性腫瘤有關(guān)，如結(jié)直腸癌、宮頸癌、乳腺癌、肺癌等。目前關(guān)于癌基因PIK3CA與腫瘤的關(guān)系及其致瘤機(jī)制都成為人們研究腫瘤的ー個(gè)熱點(diǎn)。人類腫瘤的發(fā)生是ー個(gè)多基因、多機(jī)制參與的過程，癌基因PIK3CA的發(fā)現(xiàn)為我們研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供了新的方向。研究腫瘤不同階段中PIK3CA突變的規(guī)律及其預(yù)后的關(guān)系，對(duì)于臨床早期檢測腫瘤及判斷預(yù)后有重要的意義。癌基因PIK3CA是在關(guān)于PI3Ks家族與腫瘤的發(fā)生關(guān)系及其機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)的。PIK3CA基因定位于3q26. 3，長34kb，包含20個(gè)外顯子，編碼1068種氨基酸，該組氨基酸產(chǎn)生ー組長124kD的蛋白。PIK3CA編碼I類磷脂酰肌醇_3_激酶(phosphatidylino-sitol3-kinases, PI3Ks)的 p 110 催化亞單位，即 PI3Kpll0a。Broderick 等研究發(fā)現(xiàn) PIK3CA 是ー種癌基因，生理情況下，基因PIK3CA在正常腦、肺、乳腺、胃腸、宮頸、卵巣等組織中均有表達(dá)，具有調(diào)控體細(xì)胞増殖、分化、存活等許多重要的生理功能，但多以非激活的形式存在，通常不易檢測到，而其突變后基因及其蛋白均可過度表達(dá)，可被檢測到。研究表明，PIK3CA基因的突變不僅可以引起PI3Ks的催化活性增強(qiáng)，并且可促進(jìn)細(xì)胞癌變。根據(jù)PIK3CA基因在結(jié)直腸癌中高頻突變，并激活PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路這ー研究成果，阻斷該信號(hào)通路對(duì)AKT的磷酸化有望成為治療結(jié)直腸癌的一條有效途徑。發(fā)現(xiàn)PIK3CA基因突變?cè)诮Y(jié)腸癌癌變過程中的作用，進(jìn)ー步認(rèn)識(shí)癌基因PIK3CA突變作用對(duì)于揭示大腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制具有重要意義，為結(jié)腸癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療及預(yù)后提供理論依據(jù)。癌基因PIK3CA編碼的蛋白PI3Kpll0a在大腸癌變不同階段的表達(dá)差異提示檢測PI3Kpll0a反應(yīng)癌基因PIK3CA的突變，可成為預(yù)測腫瘤分化，判斷大腸癌預(yù)后的ー個(gè)重要指標(biāo)，也為臨床早期警示大腸癌變提供了依據(jù)。另外，PIK3CA在宮頸癌組織中表達(dá)明顯高于正常組織，PIK3CA基因的表達(dá)產(chǎn)物PI3Kpll0a蛋白在正常宮頸和CIN I組、CIN II組和CINIII組與宮頸浸潤癌組織間均有顯著性差異。說明在宮頸癌形成過程中存在PIK3CA的表達(dá)異常，而PIK3CA與宮頸不典型增生演化到宮頸癌有關(guān)，有可能成為宮頸癌早期診斷的指標(biāo)。赫賽汀(Herceptin)是ー種抗HER2單克隆抗體，可選擇性作用于人類表皮生長因子受體2 (HER2)，從而干擾癌細(xì)胞的生物學(xué)進(jìn)程，抑制癌細(xì)胞的增生，赫賽汀用于治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌，以及手術(shù)后的HER2陽性乳腺癌患者。研究發(fā)現(xiàn)赫賽汀對(duì)PIK3CA基因突變?nèi)巳旱寞熜芳?。PIK3CA基因突變檢測可為乳腺癌患者的合理使用赫賽汀用藥提供參考依據(jù)。PIK3CA熱點(diǎn)區(qū)高突變率的發(fā)現(xiàn)對(duì)臨床上腫瘤的診斷，預(yù)測預(yù)后和治療有重要作用。為此，本領(lǐng)域技術(shù)人員也開發(fā)了一些檢測PIK3CA基因突變熱點(diǎn)區(qū)的方法和試劑，以增加腫瘤在組織學(xué)上的診斷敏感性。其中，檢測PIK3CA基因突變的方法有傳統(tǒng)的PCR-SSCP直接測序法。直接測序法的結(jié)果雖然具有客觀性和特異性，但是它卻存在以下缺點(diǎn)I、檢測周期長，從標(biāo)本送檢到得出結(jié)果最短要48 — 72個(gè)小時(shí)左右；2、操作過程復(fù)雜，且要涉及到PCR擴(kuò)增后的操作，因此易被污染，造成結(jié)果的不理想(詳見F項(xiàng))； 3、測序結(jié)果的判讀較復(fù)雜、費(fèi)時(shí)(當(dāng)樣本量大時(shí)，此點(diǎn)尤為突出，詳見F項(xiàng))；4、檢測的敏感性不夠高,Katsuhiko等人曾在2005年8月份出版的《LungCancer》上報(bào)道，如果突變基因的含量占基因組DNA總量的10%以下吋，則用直接測序法檢測不到突變樣本的存在；5、一次實(shí)驗(yàn)檢測的樣本量有限，最多只能8-24例；6、不安全，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程要用到多種有毒物質(zhì)，如EB、丙烯酰胺等，對(duì)操作者和環(huán)境都有危害；7、費(fèi)用較高(每個(gè)位點(diǎn)約需300元)。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，一方面，本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供ー種PIK3CA基因突變熒光定量PCR分型檢測試劑盒。本發(fā)明的PIK3CA基因突變熒光定量PCR分型檢測試劑盒，包括PCR混合反應(yīng)液、陽性對(duì)照品和用于檢測PIK3CA基因突變基因型的熒光探針，所述PCR混合反應(yīng)液中包含擴(kuò)增突變位點(diǎn)所處PIK3CA基因區(qū)段的PCR引物。優(yōu)選地，所述突變位點(diǎn)位于PIK3CA基因的第9外顯子和/或第20外顯子；位于PIK3CA基因第9外顯子的突變位點(diǎn)為PIK3CA基因第542和/或545核苷酸；位于PIK3CA基因第20外顯子的突變位點(diǎn)為PIK3CA基因第1047核苷酸。其中，所述PCR引物包括以下兩組引物對(duì)中的至少ー組針對(duì)PIK3CA基因第9外顯子中突變位點(diǎn)所處區(qū)域的引物對(duì)，其PCR正向引物的序列如SEQ ID NO: I所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID N0:2所示:Exon9F :5’-AGA ACA GCT CAA AGC AAT TTC TAC-3’ (SEQ ID NO:I)；Exon9R :5’-AAT CTC CAT TTT AGC ACT TAC CTG-3’ (SEQ ID NO:2)，針對(duì)PIK3CA基因第20外顯子中突變位點(diǎn)所處區(qū)域的引物對(duì)，其PCR正向引物的序列如SEQ ID N0:6所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID N0:7所示:Exon20F :5，-TAC ATT CGA AAG ACC CTA GCC T-3’ (SEQ ID N0:6)；Exon20R :5’-ATC CAT TTT TGT TGT CCA GCC-3’ (SEQ ID NO:7)。優(yōu)選地，所述熒光探針包括如SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5, SEQ IDN0:8和SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列中的至少ー種Exon9-542Probe :5，-FAM-TCA CTG AGC AGG AGA A-BHQ1-3，(SEQ ID NO :3);
Exon9-545Probe :5，-HEX-ATT TCA GAG AGA GGA T-BHQ1-3，(SEQ ID NO :4);Exon9-WTProbe :5，-TAMRA-TCA CTG AGC AGG AGA A-BHQ 1-3，(SEQ ID NO :5);Exon20-1047MT :5，-FAM-TGA TGC ACG TCA TGG T-BHQ1-3，(SEQ ID NO :8);Exon20-1047WT :5’-HEX-TGA TGC ACG TCA TGG T-BHQ1-3’ (SEQ ID NO:9)。其中，針對(duì)PIK3CA基因第9外顯子542位點(diǎn)突變型熒光探針序列SEQ ID NO: 3(Exon9-542Probe :5，-FAM-TCA CTG AGC AGG AGA A-BHQ1-3’ );針對(duì) PIK3CA 基因第 9 外顯子 545 位點(diǎn)突變型熒光探針序列 SEQ ID NO:4(Exon9_545Probe :5’-HEX-ATT TCA GAG AGAGGA T-BHQ1-3’)。而覆蓋第9外顯子542位點(diǎn)和545位點(diǎn)的野生型熒光探針序列SEQ ID N0:5(Exon9-WTProbe :5’-TAMRA-TCA CTG AGC AGG AGA A-BHQ1-3’)。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，當(dāng)所述熒光探針包括如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中的至少ー種時(shí)，所述陽性對(duì)照品是存在PIK3CA基因第9外顯子的第542核苷酸和第545核苷酸堿基置換突變的混合質(zhì)?；蚪MDNA，其中，第542核苷酸為G — A突變，第545核苷酸也是G —A突變。另タト，針對(duì)第20外顯子1047位點(diǎn)突變型熒光探針序列SEQ ID NO: 8(Exon20-1047MT :5’-FAM-TGA TGC ACG TCA TGG T-BHQ1-3’)；而針對(duì)第 20 外顯子 1047位點(diǎn)野生型熒光探針序列 SEQ ID NO:9 (Exon20-1047WT :5’-HEX-TGA TGC ACG TCA TGGT-BHQ1-3’)。因此，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，當(dāng)所述熒光探針包括如SEQ ID N0:3和SEQ IDNO:4 —種或者兩種時(shí)，所述陽性對(duì)照品是存在PIK3CA基因第20外顯子的第1047核苷酸質(zhì)?；蚪MDNA，其中，第1047核苷酸為A —G突變。另外，需要說明的是，上述探針序列SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQID N0:8和SEQ ID NO:9是序列表中對(duì)應(yīng)核苷酸序列在標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)后的具體實(shí)現(xiàn)方式。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，熒光探針SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO:4,SEQID NO: 5的Y端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)依次為FAM，HEX和TAMRA ;3’端均標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)BHQl ;熒光探針SEQID N0:8和熒光探針SEQ ID N0:9的5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)依次為FAM和HEX ;3’端均標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)BHQl當(dāng)然在本發(fā)明的其他實(shí)施中，標(biāo)記不同的熒光報(bào)告基團(tuán)是為了熒光定量PCR能夠采集到不同波長的熒光已便區(qū)分，因此采用其他本領(lǐng)域技術(shù)已公開的熒光報(bào)告集団和熒光淬滅基團(tuán)，在不影響檢測效果的情況下，也應(yīng)當(dāng)理解為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。另ー方面，本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供ー種PIK3CA基因突變熒光定量PCR分型檢測方法，包括如下步驟(I)根據(jù)PIK3CA基因突變位點(diǎn)的多態(tài)性，設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)引物和針對(duì)PIK3CA基因突變位點(diǎn)的熒光探針，所述PCR反應(yīng)引物擴(kuò)增出的靶多核苷酸片段中包含突變位點(diǎn)所處PIK3CA基因區(qū)段；(2)在PCR反應(yīng)體系中加入包含PCR引物的PCR混合反應(yīng)液，以及所述步驟(I)中設(shè)計(jì)的熒光探針；(3)向所述的步驟(2)得到的反應(yīng)體系中加入樣本，進(jìn)行熒光定量PCR檢測。優(yōu)選地，所述突變位點(diǎn)位于PIK3CA基因的第9外顯子和/或第20外顯子；位于PIK3CA基因第9外顯子的突變位點(diǎn)為PIK3CA基因第542和/或545核苷酸；位于PIK3CA基因第20外顯子的突變位點(diǎn)為PIK3CA基因第1047核苷酸。
其中，所述PCR引物包括以下兩組引物對(duì)中的至少ー組針對(duì)PIK3CA基因第9外顯子中突變位點(diǎn)所處區(qū)域的引物對(duì)，其PCR正向引物的序列如SEQ ID NO: I所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID N0:2所示:Exon9F :5’-AGA ACA GCT CAA AGC AAT TTC TAC-3’ (SEQ ID NO:I)；Exon9R :5’-AAT CTC CAT TTT AGC ACT TAC CTG-3’ (SEQ ID NO:2)，針對(duì)PIK3CA基因第20外顯子中突變位點(diǎn)所處區(qū)域的引物對(duì)，其PCR正向引物的序列如SEQ ID N0:6所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID N0:7所示:Exon20F :5，-TAC ATT CGA AAG ACC CTA GCC T-3’ (SEQ ID N0:6)；
Exon20R :5’-ATC CAT TTT TGT TGT CCA GCC-3' (SEQ ID NO:7)。所述熒光探針包括如SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:8 和SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列中的至少ー種Exon9-542Probe :5，-FAM-TCA CTG AGC AGG AGA A-BHQ1-3，(SEQ ID NO :3);Exon9-545Probe :5，-HEX-ATT TCA GAG AGA GGA T-BHQ1-3，(SEQ ID NO :4);Exon9-WTProbe 5' -TAMRA-TCA CTG AGC AGG AGA A-BHQ 1-3，(SEQ ID NO :5);Exon20-1047MT :5，-FAM-TGA TGC ACG TCA TGG T-BHQ1-3，(SEQ ID NO :8);Exon20-1047WT :5’-HEX-TGA TGC ACG TCA TGG T-BHQ1-3’ (SEQ ID NO:9)。其中，針對(duì)PIK3CA基因第9外顯子542位點(diǎn)突變型熒光探針序列SEQ IDNO:3(Exon9-542Probe :5’ -FAM-TCA CTG AGC AGG AGA A-BHQ1-3’ );針對(duì) PIK3CA 基因第 9 外顯子 545 位點(diǎn)突變型熒光探針序列 SEQ ID NO:4(Exon9_545Probe :5’-HEX-ATT TCA GAG AGAGGA T-BHQ1-3’)。而覆蓋第9外顯子542位點(diǎn)和545位點(diǎn)的野生型熒光探針序列SEQ IDN0:5(Exon9-WTProbe 5' -TAMRA-TCA CTG AGC AGG AGA A-BHQ1-3’)。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，當(dāng)所述熒光探針包括如SEQ ID NO:3, SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5中的至少ー種時(shí)，所述陽性對(duì)照品是存在PIK3CA基因第9外顯子的第542核苷酸和第545核苷酸堿基置換突變的混合質(zhì)粒基因組DNA，其中，第542核苷酸為G — A突變，第545核苷酸也是G —A突變。另タト，針對(duì)第20外顯子1047位點(diǎn)突變型熒光探針序列SEQ ID NO: 8(Exon20-1047MT :5’ -FAM-TGA TGC ACG TCA TGG T-BHQ1-3，);而針對(duì)第 20 外顯子 1047 位點(diǎn)野生型熒光探針序列 SEQ ID NO:9 (Exon20-1047WT 5/ -HEX-TGA TGC ACG TCA TGGT-BHQ1-3’)。因此，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，當(dāng)所述熒光探針包括如SEQ ID N0:3和SEQ IDNO: 4 一種或者兩種時(shí)，所述陽性對(duì)照品是存在PIK3CA基因第20外顯子的第1047核苷酸質(zhì)?；蚪MDNA，其中，第1047核苷酸為A —G突變。另外，需要說明的是，上述探針序列SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ IDNO:5, SEQID N0:8和SEQ ID NO:9是序列表中對(duì)應(yīng)核苷酸序列在標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)后的具體實(shí)現(xiàn)方式。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，熒光探針SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO:4,SEQID NO: 5的Y端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)依次為FAM，HEX和TAMRA ;3’端均標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)BHQl ;熒光探針SEQID N0:8和熒光探針SEQ ID N0:9的5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)依次為FAM和HEX ;3’端均標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)BHQl當(dāng)然在本發(fā)明的其他實(shí)施中，標(biāo)記不同的熒光報(bào)告基團(tuán)是為了熒光定量PCR能夠采集到不同波長的熒光已便區(qū)分，因此采用其他本領(lǐng)域技術(shù)已公開的熒光報(bào)告集団和熒光淬滅基團(tuán)，在不影響檢測效果的情況下，也應(yīng)當(dāng)理解為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。從原理上講，PIK3CA基因突變熒光定量PCR分型檢測試劑盒是采用熒光定量PCR方法對(duì)PIK3CA基因突變進(jìn)行檢測。針對(duì)PIK3CA基因突變位點(diǎn)分別特異設(shè)計(jì)野生型TaqMan探針和突變型TaqMan探針，當(dāng)遇到野生型核苷酸序列時(shí)，野生型TaqMan探針能與之結(jié)合，在PCR擴(kuò)增過程中發(fā)出相應(yīng)熒光信號(hào)而被檢測到；而當(dāng)遇到突變型核苷酸序列時(shí)，突變型TaqMan探針可與之結(jié)合，熒光報(bào)告基團(tuán)因酶解分離而發(fā)出熒光，能夠?qū)崟r(shí)檢測相應(yīng)熒光信號(hào)的積累，從而實(shí)現(xiàn)檢測PIK3CA基因特定位點(diǎn)突變狀態(tài)的目的。在本發(fā)明中提供的5’端標(biāo)有熒光發(fā)光基團(tuán)，3’端有熒光淬滅基團(tuán)BHQl的特異性熒光探針，在探針完整時(shí)，兩基團(tuán)在空間結(jié)構(gòu)上距離相互靠近，5'端報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光因?yàn)闊晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移(FRET)而被3'端淬滅基團(tuán)淬滅，所以體系中沒有熒光信號(hào)的變化。而一旦它與突變后的模板特異性的結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間，隨著引物的延伸，Taq DNA聚合酶在鏈延伸過程中遇到與模板相結(jié)合的探針，其5' -3'外切酶活性就會(huì) 將探針切斷，熒光報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離熒光淬滅基團(tuán)，這樣就破壞了兩熒光基團(tuán)之間的FRET，報(bào)告基團(tuán)所釋放出來的熒光就可以被內(nèi)置在定量檢測儀內(nèi)的熒光計(jì)檢測到。PCR每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，熒光信號(hào)也和目的片段一樣，有一個(gè)同步指數(shù)增長的過程，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱就代表了模板DNA的拷貝數(shù)的多少。因此本發(fā)明不僅可用于簡單的定性檢測，亦可用做突變樣本具體含量的定量檢測。相比于現(xiàn)有檢測方法，本發(fā)明采用熒光定量PCR技術(shù)檢測PIK3CA基因的突變具有以下優(yōu)勢I、檢測靈敏度高，最低檢測限為5個(gè)基因拷貝或更低，可在混有野生型基因組DNA情況下，檢測出1%的突變基因，特異性好，本發(fā)明針對(duì)野生型和突變型位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)了兩條特異性熒光探針，提高檢測敏感性和特異性，假陽性低。2、線性關(guān)系好，可定量檢測，由于熒光信號(hào)的強(qiáng)弱與模板擴(kuò)增產(chǎn)物的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，通過熒光信號(hào)的檢測對(duì)樣品初始模板濃度進(jìn)行定量，誤差小，目前的其他檢測方法只能進(jìn)行定性檢測，而FQ-PCR可以實(shí)現(xiàn)真正的定量檢測，在本發(fā)明的實(shí)施例中給出了定性檢測的實(shí)施例，而通過引入對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的準(zhǔn)確定量。3、采用本發(fā)明的方法和試劑盒，對(duì)標(biāo)本DNA獲取的質(zhì)量要求較低，無論是石蠟組織還是新鮮組織，都能取得理想的檢測結(jié)果。而現(xiàn)有技術(shù)中的直接測序法一般需要新鮮冰凍組織，檢測步驟包括送檢標(biāo)本一提取DNA —定性PCR擴(kuò)增一驗(yàn)證PCR產(chǎn)物一純化PCR產(chǎn)物一直接測序，相當(dāng)繁瑣，因此本發(fā)明的方法和試劑盒大大縮短了檢測的時(shí)間，并降低了對(duì)標(biāo)本DNA質(zhì)量的要求，簡化操作。4、檢測時(shí)間短，從標(biāo)本送檢到得出結(jié)果可在60-90分鐘內(nèi)完成，大大優(yōu)于測序方法所需要24-48小時(shí)。5、操作過程簡單，并且從PCR反應(yīng)開始，就是在封閉的體系中完成擴(kuò)增和實(shí)時(shí)測定，大大降低了污染的可能性，因此也就降低了結(jié)果偏差的幾率。6、結(jié)果判讀明確、直觀；若需要亦可對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析。直接測序法結(jié)果的判讀需將測序峰形圖人工讀出序列，再將所讀出的序列結(jié)合基因庫中的原始序列一起分析，從而得到結(jié)果，熒光定量PCR法結(jié)果的判讀在域值線以上有擴(kuò)增曲線的標(biāo)本均為陽性標(biāo)本，結(jié)果判讀非常簡單，直觀。7、檢測的樣本量大，通過高通量PCR儀，一次最多可檢測384例，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于直接測序法一次試驗(yàn)最多可檢測8-12例。8、安全整個(gè)體系中不包含有毒有害物質(zhì)，對(duì)操作員和環(huán)境都無危害。


圖I是熒光定量PCR檢測PIK3CA基因第542位點(diǎn)(G — A突變)堿基置換突變的擴(kuò)增曲線圖；圖2是熒光定量PCR檢測PIK3CA基因第545位點(diǎn)(G — A突變)堿基置換突變的 擴(kuò)增曲線圖；圖3是熒光定量PCR檢測PIK3CA基因第1047位點(diǎn)(A — G突變)堿基置換突變的擴(kuò)增曲線圖。
圖4是熒光定量PCR檢測PIK3CA基因無1047位點(diǎn)的堿基突變野生型樣本的擴(kuò)增曲線圖。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I :PIK3CA基因第9外顯子第542 (G — A突變)和545位點(diǎn)(G — A突變)堿基置換突變的檢測樣本說明收集臨床病理診斷為腸癌(腺癌)50例患者的腫瘤組織，所有患者術(shù)前均未接受過放化療治療，從病例標(biāo)本的腫瘤組織提取基因組DNA供以下的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。在此之前須首先進(jìn)行測試標(biāo)本的腫瘤組織含量評(píng)估，選取腫瘤細(xì)胞成分大于30%的病例用于本發(fā)明試劑盒的實(shí)施測試。設(shè)計(jì)能特異性檢測PIK3CA基因第9號(hào)外顯子第542 (G-A突變)和545位點(diǎn)(G-A突變)堿基置換突變的熒光探針各一條及公用引物一對(duì)，外加一條同時(shí)覆蓋第9外顯子542位點(diǎn)和545位點(diǎn)的野生型熒光探針序列。其中，PCR引物為Exon9F :5’-AGA ACA GCT CAA AGC AAT TTC TAC-3’ (SEQ ID NO:I)；Exon9R :5’-AAT CTC CAT TTT AGC ACT TAC CTG-3’ (SEQ ID NO:2)，突光探針為Exon9-542Probe :5，-FAM-TCA CTG AGC AGG AGA A-BHQ1-3，(SEQ ID NO :3);Exon9-545Probe :5，-HEX-ATT TCA GAG AGA GGA T-BHQ1-3，(SEQ ID NO :4);Exon9-WTProbe :5，-TAMRA-TCA CTG AGC AGG AGA A-BHQ 1-3，(SEQ ID NO :5);其中，SEQ ID NO: 3為檢測突變型PIK3CA基因第9外顯子542位點(diǎn)對(duì)應(yīng)堿基的探針，SEQ ID NO:4為檢測突變型PIK3CA基因第9外顯子545位點(diǎn)對(duì)應(yīng)堿基的探針，SEQID NO:5為覆蓋第9外顯子542位點(diǎn)和545位點(diǎn)的野生型熒光探針序列，熒光探針SEQ IDNO: 3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5的5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)依次為FAM, HEX和TAMRA ；3’端均標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)BHQ1。當(dāng)然在本發(fā)明的其他實(shí)施中，標(biāo)記不同的熒光報(bào)告基團(tuán)是為了熒光定量PCR能夠采集到不同波長的熒光已便區(qū)分，因此采用其他本領(lǐng)域技術(shù)已公開的熒光報(bào)告集團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)，在不影響檢測效果的情況下，也應(yīng)當(dāng)理解為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。另外，在后續(xù)述及的其他實(shí)施例中，對(duì)于熒光探針的詳細(xì)描述亦參照本實(shí)施例中方案。然后優(yōu)化反應(yīng)體系進(jìn)行FQ-PCR的檢測反應(yīng)體系為15 μ I,正、反引物各O. 15 μ I(20 μ M )，探針各 O. 2 μ I (20 μ M )，樣品模板 DNA 2. 5 μ I (100_300ng/ μ I)，2*Taqmanuniversal PCR Master Mix (購自美國應(yīng)用生物公司)7. 5 μ 1，ddH20 4. 3 μ L·熒光定量反應(yīng)在ΑΒΙ7900檢測儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件95°C變性30sec ;并按95V 5秒，62°C 33秒，擴(kuò)增反應(yīng)45次循環(huán)。同時(shí)在熒光定量試驗(yàn)中，需要檢測樣品的同時(shí)，還需要設(shè)置樣品參考品，以確定試驗(yàn)的有效性，當(dāng)所述熒光探針包括如SEQ ID NO:3, SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5中的至少一種時(shí)，所述陽性對(duì)照品是存在PIK3CA基因第9外顯子的第542核苷酸和第545核苷酸堿基置換突變的混合質(zhì)粒基因組DNA，其中，第542核苷酸為G — A突變，第545核苷酸也是 G —A突變。如圖I和2所示，在50例樣本中共檢測出20例樣本有542位點(diǎn)上突變(陽性樣本號(hào)為9、12、13、33、38、55)，部分陽性樣本見圖I ;13例樣本有545位點(diǎn)上突變(陽性樣本號(hào)為2、36、40)，部分陽性樣本見圖2。另外，將上述實(shí)施例I中的樣品進(jìn)行測序驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在本實(shí)施例中由上述熒光定量檢測試驗(yàn)檢測出PIK3CA基因相應(yīng)位點(diǎn)基因突變型的樣本，確實(shí)在該位點(diǎn)發(fā)生相應(yīng)的基因突變，其與熒光定量檢測試驗(yàn)的結(jié)果完全一致。以此發(fā)現(xiàn)采用本發(fā)明的PIK3CA基因突變分型熒光定量PCR檢測試劑盒及其檢測方法對(duì)PIK3CA基因突變分型進(jìn)行檢測，能夠完全正確地確定PIK3CA基因第542位點(diǎn)和545位點(diǎn)的基因突變情況。實(shí)施例2 PIK3CA基因20號(hào)外顯子1047位點(diǎn)(A — G)堿基置換突變的檢測設(shè)計(jì)能特異性檢測PIK3CA基因第20號(hào)外顯子第1047 CA — G)位點(diǎn)堿基置換突變的熒光探針一條及公用引物一對(duì)，外加檢測該位點(diǎn)的野生型熒光探針序列。其中，PCR引物為Exon20F :5’-TAC ATT CGA AAG ACC CTA GCC T-3’ (SEQ ID N0:6)；Exon20R :5’-ATC CAT TTT TGT TGT CCA GCC-3’ (SEQ ID NO:7)突光探針為Exon20-1047MT :5，-FAM-TGA TGC ACG TCA TGG T-BHQ 1-3，(SEQ ID NO :8);Exon20-1047WT :5’-HEX-TGA TGC ACG TCA TGG T-BHQ1-3’ (SEQ ID NO:9) 其中，SEQ ID N0:B3為檢測突變型PIK3CA基因第20外顯子1047位點(diǎn)對(duì)應(yīng)堿基的探針，SEQ ID N0:B4為覆蓋PIK3CA基因第20外顯子1047位點(diǎn)的野生型熒光探針序列，熒光探針SEQ ID NO:8和SEQ ID N0:9的5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)依次為FAM和HEX ;3’端均標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)BHQ1。當(dāng)然在本發(fā)明的其他實(shí)施中，標(biāo)記不同的熒光報(bào)告基團(tuán)是為了熒光定量PCR能夠采集到不同波長的熒光已便區(qū)分，因此采用其他本領(lǐng)域技術(shù)已公開的熒光報(bào)告集團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)，在不影響檢測效果的情況下，也應(yīng)當(dāng)理解為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。另外，在后續(xù)述及的其他實(shí)施例中，對(duì)于熒光探針的詳細(xì)描述亦參照本實(shí)施例中方案。
然后優(yōu)化反應(yīng)體系進(jìn)行FQ-PCR的檢測反應(yīng)體系為15μ1，PCR正、反引物各O. 15 μ I (20 μ M )，探針各 O. 2 μ I (20 μ M )，模板 DNA O. 5 μ I (100_300ng/μ l)，2*Taqmanuniversal PCR Master Mix (購自美國應(yīng)用生物公司)7. 5 μ 1，ddH20 6. 3 μ L·熒光定量反應(yīng)在ΑΒΙ7900檢測儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件95°C變性30sec ;并按95V 5秒，62°C 33秒，擴(kuò)增反應(yīng)45次循環(huán)。同時(shí)在熒光定量試驗(yàn)中，需要檢測樣品的同時(shí)，還需要設(shè)置樣品參考品，以確定試驗(yàn)的有效性，當(dāng)所述熒光探針包括如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4—種或者兩種時(shí)，所述陽性對(duì)照品是存在PIK3CA基因第20外顯子的第1047核苷酸質(zhì)?；蚪MDNA，其中，第1047核苷酸為A —G突變。如圖3所示，在50例樣本中共檢測出10例樣本有1047位點(diǎn)的基因突變， 圖3為部分的陽性樣本；圖4為部分無1047位點(diǎn)的堿基突變野生型樣本FQ-PCR擴(kuò)增曲線圖，圖4中底部灰色曲線為野生型樣本擴(kuò)增曲線，S形黑色曲線為內(nèi)參照物擴(kuò)增曲線。另外，將上述實(shí)施例2中的樣品進(jìn)行測序驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在本實(shí)施例中由上述熒光定量檢測試驗(yàn)檢測出PIK3CA基因1047位點(diǎn)基因突變型的陽性樣本，確實(shí)在該位點(diǎn)發(fā)生相應(yīng)的基因突變，其與熒光定量檢測試驗(yàn)的結(jié)果完全一致。以此發(fā)現(xiàn)采用本發(fā)明的PIK3CA基因突變分型熒光定量PCR檢測試劑盒及其檢測方法對(duì)PIK3CA基因突變分型進(jìn)行檢測，能夠完全正確地確定PIK3CA基因第1047位點(diǎn)的基因突變情況。最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
權(quán)利要求
1.一種PIK3CA基因突變熒光定量PCR分型檢測試劑盒，其特征在于，包括PCR混合反應(yīng)液、陽性對(duì)照品和用于檢測PIK3CA基因突變基因型的熒光探針，所述PCR混合反應(yīng)液中包含擴(kuò)增突變位點(diǎn)所處PIK3CA基因區(qū)段的PCR引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的PIK3CA基因突變熒光定量PCR分型檢測試劑盒，其特征在于，所述突變位點(diǎn)位于PIK3CA基因的第9外顯子和/或第20外顯子；位于PIK3CA基因第9外顯子的突變位點(diǎn)為PIK3CA基因第542和/或545核苷酸；位于PIK3CA基因第20外顯子的突變位點(diǎn)為PIK3CA基因第1047核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的PIK3CA基因突變熒光定量PCR分型檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR引物包括以下兩組引物對(duì)中的至少一組 針對(duì)PIK3CA基因第9外顯子中突變位點(diǎn)所處區(qū)域的引物對(duì)，其PCR正向引物的序列如SEQ ID NO: I所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID NO: 2所示； 針對(duì)PIK3CA基因第20外顯子中突變位點(diǎn)所處區(qū)域的引物對(duì)，其PCR正向引物的序列如SEQ ID NO:6所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID NO:7所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的PIK3CA基因突變熒光定量PCR分型檢測試劑盒，其特征在于，所述熒光探針包括如 SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:8 和 SEQ IDNO:9所示的核苷酸序列中的至少一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的PIK3CA基因突變熒光定量PCR分型檢測試劑盒，其特征在 于，所述熒光探針包括如SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5中的至少一種時(shí)，所述陽性對(duì)照品是存在PIK3CA基因第9外顯子的第542核苷酸和第545核苷酸堿基置換突變的混合質(zhì)?；蚪MDNA，其中，第542核苷酸為G — A突變，第545核苷酸也是G — A突變。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的PIK3CA基因突變熒光定量PCR分型檢測試劑盒，其特征在于，所述熒光探針包括如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4 —種或者兩種時(shí)，所述陽性對(duì)照品是存在PIK3CA基因第20外顯子的第1047核苷酸質(zhì)?；蚪MDNA，其中，第1047核苷酸為A —G突變。
7.一種PIK3CA基因突變熒光定量PCR分型檢測方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)根據(jù)PIK3CA基因突變位點(diǎn)的多態(tài)性，設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)引物和針對(duì)PIK3CA基因突變位點(diǎn)的熒光探針，所述PCR反應(yīng)引物擴(kuò)增出的靶多核苷酸片段中包含突變位點(diǎn)所處PIK3CA基因區(qū)段； (2)在PCR反應(yīng)體系中加入包含PCR引物的PCR混合反應(yīng)液，以及所述步驟(I)中設(shè)計(jì)的熒光探針； (3)向所述的步驟(2)得到的反應(yīng)體系中加入樣本，進(jìn)行熒光定量PCR檢測。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的PIK3CA基因突變熒光定量PCR分型檢測方法，其特征在于，所述突變位點(diǎn)位于PIK3CA基因的第9外顯子和/或第20外顯子；位于PIK3CA基因第9外顯子的突變位點(diǎn)為PIK3CA基因第542和/或545核苷酸；位于PIK3CA基因第20外顯子的突變位點(diǎn)為PIK3CA基因第1047核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的PIK3CA基因突變熒光定量PCR分型檢測方法，其特征在于，所述PCR引物包括以下兩組引物對(duì)中的至少一組 針對(duì)PIK3CA基因第9外顯子中突變位點(diǎn)所處區(qū)域的引物對(duì)，其PCR正向引物的序列如SEQ ID NO: I所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID NO: 2所示；針對(duì)PIK3CA基因第20外顯子中突變位點(diǎn)所處區(qū)域的引物對(duì)，其PCR正向引物的序列如SEQ ID NO:6所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID NO:7所示。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述PIK3CA基因突變熒光定量PCR分型檢測方法，其特征在于，所述熒光探針包括如 SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 8 和 SEQ ID NO: 9所示的核苷酸序列中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了PIK3CA基因突變熒光定量PCR分型檢測試劑盒，包括PCR混合反應(yīng)液、陽性對(duì)照品和用于檢測PIK3CA基因突變基因型的熒光探針，所述PCR混合反應(yīng)液中包含擴(kuò)增突變位點(diǎn)所處PIK3CA基因區(qū)段的PCR引物。另外，本發(fā)明還公開了一種PIK3CA基因突變熒光定量PCR分型檢測方法，利用本發(fā)明的試劑盒對(duì)PIK3CA基因突變分型進(jìn)行熒光定量PCR檢測。采用本發(fā)明的技術(shù)手段，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)組織中PIK3CA基因突變情況的檢測，尤其能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)PIK3CA基因第542、545和1047核苷酸突變的快速、準(zhǔn)確、高靈敏度檢測。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102851368SQ201210330990
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月18日
發(fā)明者邵琦 申請(qǐng)人:廣州達(dá)健生物科技有限公司