專利名稱：一株從玉米浸泡水中分離篩選出的l-乳酸產(chǎn)生菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株L-乳酸產(chǎn)生菌。
背景技術(shù)：
在玉米淀粉濕法生產(chǎn)中，玉米浸泡過程不僅是物理擴(kuò)散過程，同時也是生物化學(xué)變化過程。這得益于玉米粒本身所帶有的乳酸菌。所以玉米浸泡水中肯定有乳酸菌的存在。L-乳酸被廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域，尤其是近年來利用L-乳酸為原料生產(chǎn)生物可降解塑料，即聚乳酸的迅速發(fā)展，對于解決日益嚴(yán)重的白色污染問題具有重要意義。
因此篩選L-乳酸產(chǎn)生菌，將其單獨應(yīng)用于玉米浸泡過程中，大量積累L-乳酸，對玉米浸泡水加以利用、變廢為寶，將是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一株從玉米浸泡水中分離篩選出的L-乳酸產(chǎn)生菌，目的在于將其單獨應(yīng)用于玉米浸泡過程中，大量積累L-乳酸，對玉米浸泡水加以利用、變廢為寶。本發(fā)明米取的技術(shù)方案是一株從玉米浸泡水中分離篩選出的L-乳酸產(chǎn)生菌，BaciLLus coaguLans,該菌株的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID No. I所述,其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC No. 6382，保藏日期2012年7月19日，保藏單位地扯北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。本發(fā)明所述的L-乳酸產(chǎn)生菌能夠高效利用玉米浸泡水、并且大量積累L-乳酸。本發(fā)明利用工廠玉米浸泡水經(jīng)稀釋后涂布于分離培養(yǎng)基，待長出菌落后，挑選溶鈣圈大的菌株，進(jìn)行分純后發(fā)酵培養(yǎng)，50 1恒溫培養(yǎng)24 h。測定產(chǎn)酸情況，以L-乳酸產(chǎn)量和光學(xué)純度為指標(biāo)，篩選大量積累L-乳酸的優(yōu)質(zhì)菌株，獲得本專利所述菌株，進(jìn)行菌種鑒定實驗，4 °C保藏。本發(fā)明通過分離篩選出的能夠高效利用玉米浸泡水、并且大量積累L-乳酸的產(chǎn)生菌，提高了玉米浸泡水的利用價值，從而實現(xiàn)顯著的經(jīng)濟(jì)效益。
具體實施例方式—株從玉米浸泡水中分離篩選出的L-乳酸產(chǎn)生菌,該菌株的16SrDNA核苷酸序列如SEQ ID No. I所述，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC No. 6382，保藏日期2012年7月19日，保藏單位地扯北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。實驗例I本發(fā)明所述菌株的分離篩選及鑒別方法?！⒚子门囵B(yǎng)基I. MRS培養(yǎng)基牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 ImL, K2HPO4 2 g, NaAc · 3H20 5 g，檸檬酸二銨 2 g, MgSO4 · 7H20 O. 58 g, MnSO4 · H2O O. 25 g,補(bǔ)蒸餾水至1000 mL，調(diào)pH至6. 4±0. 2 ;若配制成固體培養(yǎng)基，則需添加I. 5%_2%的瓊脂；2. L-肉湯培養(yǎng)基胰酶解酪蛋白胨10 g，酵母提取物5 g, NaCl 5 g，葡萄糖100g，補(bǔ)蒸餾水至1000 mL ；3. YE培養(yǎng)基酵母粉15 g，葡萄糖100 g，補(bǔ)蒸餾水至1000 mL，酵母粉和葡萄糖分別滅菌冷卻后混合；若配制成固體培養(yǎng)基，則需添加I. 5%的瓊脂；注以上培養(yǎng)基均121 °C滅菌15 min。二、菌種的分離 I、玉米浸泡液中乳酸菌的分離篩選，初篩在無菌條件下，用5 mL—次性無菌針管吸取I mL玉米浸泡液，10倍梯度稀釋至10_9;取O. I mL涂布于MRS培養(yǎng)基，50 °C培養(yǎng)24 h后選擇有溶鈣圈明顯的典型菌落進(jìn)一步劃線分離，直到出現(xiàn)單菌落，挑取單菌落在L-肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h后儲存于15% 20%甘油中，于-60 V低溫冰箱中凍存。將劃線分離菌株于裝有I mL MRS液體培養(yǎng)基的EP管中活化，然后在10 mL YE液體培養(yǎng)基試管中靜置培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液的pH值。產(chǎn)酸菌會使培養(yǎng)基中的pH值下降并導(dǎo)致含顯色劑的培養(yǎng)液由紫變黃，這樣可以通過目測法直觀淘汰不產(chǎn)酸或產(chǎn)酸能力弱的菌株。取透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株劃線分離，共得到16株。將它們在EP管中活化培養(yǎng)后，接入裝有YE液體培養(yǎng)基的試管中，50 °C培養(yǎng)24 h，測定pH值見表I。表I初篩產(chǎn)酸菌的pH值
菌株 |L1 |L2 |L3 |L4 |L5 |L6 |L7 |L8 pH 3. 89 4. 12 708 3. 91 T~22 4. 17 4. 20 菌株 L9 LlQ LIT" L12 L13~ L14 L15~ L16 pH 丨4. 13 丨4. 34 丨4. 17 丨5. Ql 丨4. 33 丨4. 35 丨4. 29 丨4. 31
2、玉米浸泡液中乳酸菌的分離篩選，復(fù)篩選取發(fā)酵液pH值較低的菌株即L1、L2、L3、L4、L9，按接種量為2% 5%接入裝有YE液體培養(yǎng)基的三角瓶中，200 rpm, 50 °C培養(yǎng)24h。發(fā)酵液5000 rpm離心10 min，取上清液用于紙層析定性。將2%檸檬酸、2%乳酸和發(fā)酵培養(yǎng)液點樣進(jìn)行紙層析，計算Rf值，如表2所示以確定菌種培養(yǎng)液中是否產(chǎn)生有乳酸。表2有機(jī)酸及發(fā)酵液的Rf值
為析樣品I梓檬酸I乳酸 |L1 |L2 |L3 |L4 |L9 Rf 值 |θ· 452 |θ. 702 |θ. 699 |θ. 703 |θ. 698 |θ. 701 |θ. 7023次平行試驗表明，從Rf值結(jié)果可以判斷該5株菌所產(chǎn)酸均為乳酸，也就是說這5株菌為乳酸產(chǎn)生菌。三、高效液相色譜儀測定、分離發(fā)酵液中L-乳酸和D-乳酸采用高效液相法和手性分離柱對這5株菌發(fā)酵上清液中的L-乳酸和D-乳酸進(jìn)行分離和測定。發(fā)酵上清液用8000 rpm離心20 min,再用0.45 Mm濾膜過濾。濾液用配備二極管陣列檢測器的高效液相系統(tǒng)檢測，檢測波長為254 nm。檢測色譜柱為手性柱Chirex3126 (D)-peniciLLami (4. 6 mmX250 mm, 5 Mm)，流動相為 2 mmoL/L CuSO4 溶液(溶劑 5 %的異丙醇溶液)。該方法操作簡便，精密度和準(zhǔn)確度高。其中一菌株L9，L-乳酸產(chǎn)量最高，達(dá)到67. 7 g/L，且光學(xué)純度達(dá)到99. 3%，選擇該菌株做進(jìn)一步研究。四、菌種鑒定菌株在平板上的單菌落呈圓形，稍透明，邊緣整齊，菌落呈乳白色，菌落直徑約為
2.O 2. 5 _。在光學(xué)顯微鏡下觀察可知，菌體為桿狀，少數(shù)稍彎曲，單個排列，長約3. O 5.0 μπι。細(xì)菌革蘭氏染色呈陽性。在一定條件下可產(chǎn)生芽孢，為端生。無鞭毛，能運(yùn)動，為兼性厭氧菌。將試管中斜面培養(yǎng)保藏的菌株活化3代后接種到生化試驗培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后測定其生化特性。結(jié)果見表3。菌株對不同碳水化合物的利用情況見表4。由表3可知，該菌株過氧化氫酶為陽性，VP陽性，明膠液化陰性，可分解利用淀粉。由表4可知，該菌株能利用大多數(shù)寡糖，包括纖維二糖和菊粉，但不能分解利用木糖和鼠李糖。同時做了產(chǎn)氣實驗，結(jié)果均不產(chǎn)氣。此外，糖類發(fā)酵實驗中添加了指示劑溴甲酚紫，若菌株能利用某種糖，培養(yǎng)基顏色可由紫變黃，根據(jù)變色時間的長短可判斷分解某種糖的快慢程度。實驗發(fā)現(xiàn)，該菌能迅速利用葡萄糖、麥芽糖、果糖、半乳糖和糊精；而需要較長時間才能分解乳糖、蔗糖、纖維二糖、菊粉和淀粉。表3菌株的生理生化實驗結(jié)果
權(quán)利要求
1 一株從玉米浸泡水中分離篩選出的L-乳酸產(chǎn)生菌,BaciLLus coaguLans,該菌株的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID No. I所述，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC No. 6382，保藏日期2012年7月19日。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株從玉米浸泡水中分離篩選出的L-乳酸產(chǎn)生菌，屬于玉米加工領(lǐng)域。該菌株的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC No.6382，保藏日期2012年7月19日。本發(fā)明通過分離篩選出的能夠高效利用玉米浸泡水、并且大量積累L-乳酸的產(chǎn)生菌，提高了玉米浸泡水的利用價值，從而實現(xiàn)顯著的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號C12N1/20GK102839140SQ201210327559
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月7日
發(fā)明者佟毅, 王宏齡, 吳延?xùn)|, 關(guān)陽, 王國良, 韓文靜, 張秀榮 申請人:吉林中糧生化科技有限公司