專利名稱：玉米浸泡水中提取、提純脂多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種脂多糖提取、提純的方法，特別是從玉米浸泡水中提取、提純脂多糖的方法背景技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中，采用乙醇分布沉淀法提取脂多糖，會(huì)使大量蛋白質(zhì)隨脂多糖一起沉淀，得到的產(chǎn)品中脂多糖的含量很低(＜3％)，在此基礎(chǔ)上，盡管采用了離子交換色譜法進(jìn)行純化，產(chǎn)品純度仍不理想(90％左右)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服以上不足，提供一種提取、提純脂多糖的方法，本方法可以大大減化脂多糖的提取、提純操作步驟，同時(shí)明顯提高最終產(chǎn)品的純度。
本發(fā)明的目的通過(guò)以下措施實(shí)現(xiàn)采用超濾法、等電點(diǎn)法、三氯乙酸法三種方法聯(lián)合分離玉米浸泡水中的蛋白質(zhì)，再用納濾膜將浸泡水濃縮，并通過(guò)乙醇沉淀法進(jìn)一步分離浸泡水中的蛋白質(zhì)，最后，用活性炭將脂多糖從浸泡水中提取出來(lái)1、等電點(diǎn)法分離蛋白及普通多糖用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)浸泡水中的PH值到7.3，將浸泡液通過(guò)分離機(jī)分離，在每分鐘3000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速下離心25分鐘，分離沉淀上清液。
2、超濾法分離蛋白及普通多糖選用截留分子量10萬(wàn)的超濾膜，對(duì)上述上清液進(jìn)行超濾，取過(guò)濾液。
3、三氯乙酸法分離蛋白及普通多糖
在上述濾液中加入占其體積0.5％的三氯乙酸，攪拌30分鐘，于每分鐘3000轉(zhuǎn)條件下離心25分鐘，分離出上清液。
4、濃縮采用納米過(guò)濾裝置，將分離蛋白及普通多糖后的浸泡水濃縮6-10倍，經(jīng)納濾膜過(guò)濾，取濃縮后的浸泡水。所述的納濾膜為聚酰胺管式膜，膜面積0,8-1.2平方米，純水通量為每小時(shí)每平方米180-220升。
5、再分離用乙醇沉淀法進(jìn)一步分離蛋白質(zhì)和一般多糖加入濃度為95％的乙醇，使浸泡水中乙醇濃度達(dá)到30％，攪拌5分鐘，于每分鐘2600轉(zhuǎn)下離心30分鐘，分離出上清液。
6、提取將上述上清液PH值調(diào)整為6.50，加入占其重量1.5-2.5％的經(jīng)處理的活性炭，攪拌15分鐘，靜置10分鐘，最后過(guò)濾，分離取出吸附了脂多糖活性炭。
活性炭使用前處理方法如下將蒸餾水和發(fā)煙硝酸按1∶1混合，將活性炭粉末倒入其中并浸泡5小時(shí)，浸泡溫度為70～80℃。浸泡后放走酸水，用蒸餾水反復(fù)沖洗至中性。
7、提純將吸附了脂多糖的活性炭裝填于1.6×90厘米的色譜柱中，用10毫摩爾每升三羥甲基氨基甲烷-鹽酸/10毫摩爾每升氯化鈉進(jìn)行洗脫，洗脫液流速為每小時(shí)8毫升，分步收集洗脫液，每管收集4毫升，共收集52管，將第27～36管洗脫液合并，冷凍干燥。
將DEAE-葡聚糖凝膠A-50裝填于1.6×40厘米的色譜柱中。取上述干燥產(chǎn)物0.25克，溶于6毫升的10毫摩爾每升三羥甲基氨基甲烷-鹽酸/10毫摩爾每升氯化鈉中，將其加入色譜柱。用濃度依次增加的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸/氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，同時(shí)進(jìn)行分步收集。每管收集6毫升，共收集60根管，洗脫劑流速為每小時(shí)8毫升。
8、脫鹽將第34～52根管的洗脫液合并，用葡聚糖凝膠G-15層析柱進(jìn)行脫鹽，以超純水洗脫，最后凍干得到脂多糖成品。
本發(fā)明的效果在于在簡(jiǎn)化了操作步驟的同時(shí)，明顯的提高了脂多糖產(chǎn)品的純度。所得產(chǎn)品中脂多糖含量達(dá)97.4％以上。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1制藥過(guò)程中玉米浸泡水提取、提純脂多糖的方法如下1、等電點(diǎn)法分離蛋白及普通多糖用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)浸泡水中的PH值到7.3，將浸泡液通過(guò)分離機(jī)分離，在每分鐘3000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速下離心25分鐘，分離沉淀上清液。
2、超濾法分離蛋白及普通多糖選用截留分子量10萬(wàn)的超濾膜，對(duì)上述上清液進(jìn)行超濾，取過(guò)濾液。
3、三氯乙酸法分離蛋白及普通多糖在上述濾液中加入占其體積0.5％的三氯乙酸，攪拌30分鐘，于每分鐘3000轉(zhuǎn)條件下離心25分鐘，分離出上清液。
4、濃縮采用納米過(guò)濾裝置，將分離蛋白及普通多糖后的浸泡水濃縮8倍，經(jīng)納濾膜過(guò)濾，取濃縮后的浸泡水。所述的納濾膜為聚酰胺管式膜，膜面積1平方米，純水通量為每小時(shí)每平方米200升。
5、再分離用乙醇沉淀法進(jìn)一步分離蛋白質(zhì)和一般多糖加入濃度為95％的乙醇，使浸泡水中乙醇濃度達(dá)到30％，攪拌5分鐘，于每分鐘2600轉(zhuǎn)下離心30分鐘，分離出上清液。
6、提取將上述上清液PH值調(diào)整為6.50，加入占其重量2％的經(jīng)處理的活性炭，攪拌15分鐘，靜置10分鐘，最后過(guò)濾，分離取出吸附了脂多糖活性炭。
活性炭使用前處理方法如下將蒸餾水和發(fā)煙硝酸按1∶1混合，將活性炭粉末倒入其中并浸泡5小時(shí)，浸泡溫度保持在70～80℃。浸泡后放走酸水，用蒸餾水反復(fù)沖洗至中性。
7、提純將吸附了脂多糖的活性炭裝填于1.6×90厘米的色譜柱中，用10毫摩爾每升三羥甲基氨基甲烷-鹽酸/10毫摩爾每升氯化鈉進(jìn)行洗脫，洗脫液流速為每小時(shí)8毫升，分步收集洗脫液，每管收集4毫升，共收集52管，將第27～36管洗脫液合并，冷凍干燥。
將DEAE-葡聚糖凝膠A-50裝填于1.6×40厘米的色譜柱中。取上述干燥產(chǎn)物0.25克，溶于6毫升的10毫摩爾每升三羥甲基氨基甲烷-鹽酸/10毫摩爾每升氯化鈉中，將其加入色譜柱。用濃度依次增加的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸/氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，同時(shí)進(jìn)行分步收集。每管收集6毫升，共收集60根管，洗脫劑流速為每小時(shí)8毫升。
8、脫鹽將第34～52根管的洗脫液合并，用葡聚糖凝膠G-15層析柱進(jìn)行脫鹽，以超純水洗脫，最后凍干得到脂多糖成品。
權(quán)利要求
1.一種玉米浸泡水中提取、提純脂多糖的方法，其特征是本方法通過(guò)分別采用超濾法、等電點(diǎn)法、三氯乙酸法三種方法分離玉米浸泡水中的蛋白質(zhì)，再用納濾膜將浸泡水濃縮，并通過(guò)乙醇沉淀法進(jìn)一步分離浸泡水中的蛋白質(zhì)，最后，用活性炭將脂多糖從浸泡水中提取出來(lái)(1)等電點(diǎn)法分離蛋白及普通多糖用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)浸泡水中的PH值到7.3，將浸泡液通過(guò)分離機(jī)分離，在每分鐘3000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速下離心25分鐘，分離沉淀上清液；(2)超濾法分離蛋白及普通多糖選用截留分子量10萬(wàn)的超濾膜，對(duì)上述上清液進(jìn)行超濾，取過(guò)濾液；(3)三氯乙酸法分離蛋白及普通多糖在上述濾液中加入占其體積0.5％的三氯乙酸，攪拌30分鐘，于每分鐘3000轉(zhuǎn)條件下離心25分鐘，分離出含蛋白及普通多糖的上清液；(4)濃縮采用納米過(guò)濾裝置，將分離蛋白及普通多糖后的浸泡水濃縮6-10倍，經(jīng)納濾膜過(guò)濾，取濃縮后的浸泡水；(5)再分離在上述濃縮浸泡水中加入濃度為95％的乙醇，使浸泡水中乙醇濃度達(dá)到30％，攪拌5分鐘，于每分鐘2600轉(zhuǎn)下離心30分鐘，分離后取上清液；(6)提取將上述上清液PH值調(diào)整為6.50，加入占其重量1.5-2.5％的經(jīng)處理的活性炭，攪拌15分鐘，靜置10分鐘，最后過(guò)濾，分離取出吸附了脂多糖活性炭；(7)提純將吸附了脂多糖的活性炭裝填于1.6×90厘米的色譜柱中，用10毫摩爾每升三羥甲基氨基甲烷-鹽酸/10毫摩爾每升氯化鈉進(jìn)行洗脫，洗脫液流速為每小時(shí)8毫升，分步收集洗脫液，每管收集4毫升，共收集52管，將第27～36管洗脫液合并，冷凍干燥；將DEAE-葡聚糖凝膠A-50裝填于1.6×40厘米的色譜柱中。取上述干燥產(chǎn)物0.25克，溶于6毫升的10毫摩爾每升三羥甲基氨基甲烷-鹽酸/10毫摩爾每升氯化鈉中，將其加入色譜柱。用濃度依次增加的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸/氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，同時(shí)進(jìn)行分步收集。每管收集6毫升，共收集60根管，洗脫劑流速為每小時(shí)8毫升；(8)脫鹽將第34～52根管的洗脫液合并，用葡聚糖凝膠G-15層析柱進(jìn)行脫鹽，以超純水洗脫，最后凍干得到脂多糖成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米浸泡水中提取、提純脂多糖的方法，其特征是所述的活性炭使用前處理方法是將蒸餾水和發(fā)煙硝酸按1∶1混合，將活性炭粉末倒入其中并浸泡5小時(shí)，浸泡溫度為70～80℃。浸泡后放走酸水，用蒸餾水反復(fù)沖洗至中性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的玉米浸泡水中提取、提純脂多糖的方法，其特征是所述的納濾膜為聚酰胺管式膜，膜面積0，8-1.2平方米，純水通量為每小時(shí)每平方米180-220升。
全文摘要
本發(fā)明提供一種在玉米浸泡水中提取、提純脂多糖的方法。先通過(guò)等電點(diǎn)法、超濾法、三氯乙酸法聯(lián)合使用分離浸泡水中的蛋白質(zhì)，經(jīng)進(jìn)行納濾膜濃縮，再用乙醇沉淀法進(jìn)一步分離蛋白質(zhì)，然后用活性炭提取浸泡水中的脂多糖，通過(guò)活性炭色譜法和離子交換色譜法提純脂多糖，最終得到的脂多糖產(chǎn)品純度高達(dá)97.4％以上。
文檔編號(hào)C08B37/00GK1546532SQ200310109680
公開(kāi)日2004年11月17日 申請(qǐng)日期2003年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月28日
發(fā)明者錢東平, 曲保雪, 楊世鳳, 霍曉靜, 牛曉穎, 孟祥書(shū), 李瑞奇, 楊曉娟, 齊曉娜 申請(qǐng)人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)