專利名稱：玉米浸泡水用于發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以玉米浸泡水代替部分配料用水和酵母膏用于發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸產(chǎn)量的新方法。
背景技術(shù)：
ε -聚賴氨酸(ε _PL)是一種氨基酸同聚物，由25_35個賴氨酸殘基通過α -羧基和ε-氨基連接而成。它易溶于水，但不溶于乙醇、乙醚、乙酸乙酯等有機溶劑。ε-PL不僅對G+和G—有抑制作用，對絕大多數(shù)真菌也有較好的抑菌效果，并且對耐熱芽孢桿菌和部分病毒也有抑制作用；在一定條件下，也可使某些噬菌體明顯失活。它不受PH影響，對熱穩(wěn)定 性(120 °C, 20 min)。美國食品藥品管理局(FDA)于2004年I月批準ε-PL為一般認為安全的(GRAS)產(chǎn)品。它在人體內(nèi)可被分解人體八種必需氨基酸之一的L-賴氨酸，后者也是世界各國允許在食品中強化的氨基酸。因此，ε-PL是一種理想的生物防腐劑。玉米浸泡水(參照《玉米淀粉工業(yè)手冊》2009年9月第一版)是在生產(chǎn)玉米淀粉過程中產(chǎn)生的，其pH在4. O左右，干物質(zhì)含量為7%-9%。玉米浸泡水中含有生物可利用的葡萄糖、氨基酸和微量元素，此外還含有生物素、Vbi、核黃素等。目前，大多數(shù)企業(yè)都是將玉米浸泡水進行濃縮制成玉米漿或玉米粉。在此過程中會消耗大量的能源，也對環(huán)境造成了一定程度的污染。王勇等人用玉米浸泡水代替豆柏水解液制備發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸，明顯降低了原料成本，專利申請?zhí)?00510043807. 4 ;隨后，他們利用玉米浸泡水在非無菌條件下培養(yǎng)飼料用酵母，專利申請?zhí)?00610068445. 9。賈士儒等人以從土壤中篩選所獲得的白色鏈霉菌為生產(chǎn)菌種，在發(fā)酵過程中流加提取過程的后期穿透液，發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚-L-賴氨酸(專利申請?zhí)?00610013800. 2);此夕卜，他們還以淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌或白色鏈霉菌為生產(chǎn)菌種，在發(fā)酵過程中流加L-賴氨酸、葡萄糖和(NH4)2SO4的混合液發(fā)酵生產(chǎn)ε _聚-L-賴氨酸，產(chǎn)物量比不流加L-賴氨酸的過程提高25%-50%，專利申請?zhí)?00910069517. 5。吳光耀等人將白色鏈霉菌經(jīng)過2-4次擴大培養(yǎng)，接種于麥芽汁發(fā)酵培養(yǎng)液中，發(fā)酵生產(chǎn)ε -聚賴氨酸，專利申請?zhí)?00710067250. 7。上述文獻探討了玉米浸泡水的綜合利用以及ε -PL的生產(chǎn)工藝，但以玉米浸泡水代替酵母膏發(fā)酵生產(chǎn)ε -PL的方法還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種玉米浸泡水用于發(fā)酵生產(chǎn)ε -聚賴氨酸的方法，以解決玉米浸泡水利用率不高的問題。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是(I)沉淀將新鮮的玉米浸泡水靜置沉淀24 h或進行過濾，以去除固形物；(2)配料將培養(yǎng)基各組分加入經(jīng)過(I)處理的玉米浸泡水中，葡萄糖40-50 g/L、酵母膏 3-6 g/L,KH2PO4 I. 5 g/L,K2HPO4 I g/L, (NH4)2SO4 8-12 g/L,自來水和玉米浸泡水的體積比為1:1，作為流加液，調(diào)節(jié)pH至3. 9-4. I ;作為培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)pH至6. 8-7. 2 ；(3)滅菌將配制好的培養(yǎng)基于121 125°C維持15-20 min，然后降至26-32 V ；(4)接種按照10% (v/v)的接種量進行接種,所用弗吉尼亞鏈霉菌,Streptomycesvirginiae已由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏,保藏編號為CGMCCNo. 6420，保藏日期為2012年8月13日，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號;(5)發(fā)酵種子培養(yǎng)階段，初始pH為6. 8-7. O、溫度26-32 °C、攪拌培養(yǎng)或振蕩培養(yǎng) 20-30 h;發(fā)酵時間 40-144 h，pH3. 8 4. 2，流加葡萄糖 300-500 g/L 和(NH4) 2S0440_80g/L，使發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖含量在10-15 g/L，收集發(fā)酵液。
該方法能夠?qū)崿F(xiàn)節(jié)水與節(jié)能，并有利于保護環(huán)境。本發(fā)明所述工藝，是利用玉米浸泡水替代部分配料用水和酵母膏，調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基的原料配比。此外，由于ε-PL積累階段的最適PH為4. 0，這恰恰與玉米浸泡水的pH相一致，因此，采用本發(fā)明所述工藝，可以有效提高ε -PL的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率。
具體實施例方式本發(fā)明所用弗吉尼亞鏈霉菌(Streptomyces virginiae)已由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No. 6420，保藏日期為2012年8月13日。實施例I(I)沉淀將新鮮的玉米浸泡水靜置沉淀24 h或進行過濾，以去除固形物；(2)配料將培養(yǎng)基各組分加入經(jīng)過(I)處理的玉米浸泡水中，葡萄糖40 g/L、酵母膏 3 g/L、KH2PO4 I. 5 g/L、K2HPO4 I g/L, (NH4)2SO4 8 g/L,自來水和玉米浸泡水的體積比為1:1，作為流加液，調(diào)節(jié)pH至3. 9-4. I ;作為培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)pH至6. 8-7. 2 ；(3)滅菌將配制好的培養(yǎng)基于121°C維持15 min，然后降至26 °C ；(4)接種按照10% (v/v)的接種量進行接種,所用弗吉尼亞鏈霉菌,Streptomycesvirginiae已由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏,保藏編號為CGMCCNo. 6420，保藏日期為2012年8月13日，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號;(5)發(fā)酵種子培養(yǎng)階段，初始pH為6. 8、溫度26 °C、攪拌培養(yǎng)或振蕩培養(yǎng)20 h ；發(fā)酵時間40 h，pH3. 8，流加葡萄糖300 g/L和(NH 4)2S04 40 g/L，使發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖含量在10 g/L，收集發(fā)酵液。實施例2(I)沉淀將新鮮的玉米浸泡水靜置沉淀24 h或進行過濾，以去除固形物；(2)配料將培養(yǎng)基各組分加入經(jīng)過(I)處理的玉米浸泡水中，葡萄糖45 g/L、酵母膏 4.5 g/L,KH2PO4 I. 5 g/L,K2HPO4 I g/L, (NH4)2SO4 10 g/L,自來水和玉米浸泡水的體積比為1:1，作為流加液，調(diào)節(jié)PH至3. 9-4. I ;作為培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)pH至6. 8-7. 2 ；(3)滅菌將配制好的培養(yǎng)基于123°C維持18min，然后降至29 °C ；(4)接種按照10% (v/v)的接種量進行接種,所用弗吉尼亞鏈霉菌,Streptomycesvirginiae已由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏,保藏編號為CGMCCNo. 6420，保藏日期為2012年8月13日，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號;(5)發(fā)酵種子培養(yǎng)階段，初始pH為6. 9、溫度29 °C、攪拌培養(yǎng)或振蕩培養(yǎng)25 h ；發(fā)酵時間92 h，pH 4.0，流加葡萄糖450 g/L和(NH4)2SO4 60g/L，使發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖含量在12.5 g/L，收集發(fā)酵液。實施例3(I)沉淀將新鮮的玉米浸泡水靜置沉淀24 h或進行過濾，以去除固形物；(2)配料將培養(yǎng)基各組分加入經(jīng)過(I)處理的玉米浸泡水中，葡萄糖50 g/L、酵母膏6 g/L,KH2PO4 1.5 g/L,K2HPO4 I g/L，(NH4)2SO412 g/L，自來水和玉米浸泡水的體積比為1:1，作為流加液，調(diào)節(jié)PH至3. 9-4. I ;作為培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)pH至6. 8-7. 2 ；
(3)滅菌將配制好的培養(yǎng)基于125°C維持20 min，然后降至32 °C ；(4)接種按照10% (v/v)的接種量進行接種,所用弗吉尼亞鏈霉菌,Streptomycesvirginiae已由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏,保藏編號為CGMCCNo. 6420，保藏日期為2012年8月13日，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號;(5)發(fā)酵種子培養(yǎng)階段，初始pH為7. O、溫度32 °C、攪拌培養(yǎng)或振蕩培養(yǎng)30 h ；發(fā)酵時間144 h，pH 4. 2，流加葡萄糖500 g/L和(NH4)2SO4 80 g/L，使發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖含量在15 g/L，收集發(fā)酵液。試驗例本發(fā)明所述菌株篩選方法土樣采回后，每克土樣中添加O. I g CaCO3,在室溫下自然風干3-10 d,碾碎過篩，于50 1烘1-2 h。稱取I g 土樣加入到10 mL無菌的pH 7. O磷酸緩沖液中，50 °C振蕩10min。取O. 2 mL樣液涂布于SGB培養(yǎng)基，28 °C培養(yǎng)3_7 d。挑取在SGB培養(yǎng)基中形成透明圈的單菌落接于SG培養(yǎng)基中，28 °C培養(yǎng)7 d，然后挖取菌落周圍瓊脂塊，用Dragendorff 試劑檢測，挑取Dragendorff陽性反應(yīng)的菌株進行復篩。將菌株接于復篩培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，對發(fā)酵產(chǎn)物進行分析鑒定，并選取一株ε -PL產(chǎn)量最高的菌株。SG 培養(yǎng)基(g/L):甘油 10，瓊脂 15，酵母膏 O. 1，NaH2PO4 O. 68，MgSO4 · 7H20 O. 25，(NH4)2SO4 O. 66，pH 7. 0,121 °C滅菌 20 min。SGB培養(yǎng)基SG培養(yǎng)基中加入美藍O. 002%, 121 °C滅菌20 min。復篩培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖50、酵母膏 5、KH2PO4 I. 36、K2HPO4 0.8, (NH4)2SO4 10，pH 6. 8，121。。滅菌 20 min。上述弗吉尼亞鏈霉菌(Streptomyces virginiae)已由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No. 6420，保藏日期為2012年8月13日，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。 下邊通過具體對比試驗例來進一步說明采用本發(fā)明菌株的有益效果。實施例I :選用菌種小白鏈霉菌，弗吉尼亞鏈霉菌CGMCC No. 6420。在500 mL三角瓶中裝入100 mL培養(yǎng)基(pH 7. 0)，挑取一環(huán)孢子，180-200 rpm，培養(yǎng)28 h。吸取10 mL種子培養(yǎng)液于裝有90 mL培養(yǎng)基(pH 7. O)的500 mL三角瓶中，180-200rpm,培養(yǎng)72 h。米用不同的培養(yǎng)基用水和生產(chǎn)菌種,結(jié)果見表I。表I 500 mL三角瓶中的發(fā)酵結(jié)果
培養(yǎng)基用水生產(chǎn)菌種培養(yǎng)溫度(°c) ε-PL產(chǎn)量(g/L)
方法
自來水小白鏈霉菌300 55
方法自來水和玉米浸泡
小白鏈霉菌300.64
二水(1:1)
方/去自來水和玉米浸泡弗吉尼亞鏈霉菌
260.75
三水(1:1)CGMCC No.6420結(jié)論從表I中的數(shù)據(jù)可以看出，培養(yǎng)基用水中以玉米浸泡水代替50%的自來水，其ε -PL產(chǎn)量要比單獨使用自來水配制培養(yǎng)基時提高16. 4% ;而篩選出的弗吉尼亞鏈霉菌CGMCC No. 6420，其發(fā)酵能力要比小白鏈霉菌高17. 2%。實施例2 選用菌種小白鏈霉菌，弗吉尼亞鏈霉菌CGMCC No. 6420。在5 L發(fā)酵罐中裝入2. 7 L培養(yǎng)基(pH 7.0)，接種300 mL種子培養(yǎng)液，待DO降至
25%時自動控制為25 %, 300-700 rpm，培養(yǎng)144 h，空氣流速為4. 5-6. O L/min。當pH降至6. O時，流加氨水(30%)維持pH為6. O,當發(fā)酵液中的殘?zhí)菨舛冉抵? g/L時，通過流加葡萄糖(350 g/L)和(NH4)2SO4 (60 g/L)使殘?zhí)菨舛冗_到12 g/L。同時，pH自然降至4. O并維持在4. O左右。采用不同的培養(yǎng)基用水和生產(chǎn)菌種，結(jié)果見表2。表2 5 L發(fā)酵罐中的發(fā)酵結(jié)果
培養(yǎng)基用水生產(chǎn)菌種培養(yǎng)溫度rc) ε-PL產(chǎn)量(g/L)
方法
自來水小白鏈霉菌3011.89
自來水和玉米浸泡
方/去
一水小白鏈霉菌3013.64 (1:1)
自來水和玉米浸泡 方法弗吉尼亞鏈霉菌
水2615.37
二CGMCC No.6420 (1:1)結(jié)論從表2中的數(shù)據(jù)可以看出，培養(yǎng)基用水中以玉米浸泡水代替50%的自來水，其ε -PL產(chǎn)量要比單獨使用自來水配制培養(yǎng)基時提高14. 7% ;而篩選出的弗吉尼亞鏈霉菌CGMCC No. 6420，其發(fā)酵能力要比小白 鏈霉菌高12. 7%。
權(quán)利要求
1.一種玉米浸泡水用于發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的方法，其特征在于包括下列步驟 (1)沉淀將新鮮的玉米浸泡水靜置沉淀24h或進行過濾，以去除固形物； (2)配料將培養(yǎng)基各組分加入經(jīng)過(I)處理的玉米浸泡水中，葡萄糖40-50g/L、酵母膏 3-6 g/L,KH2PO4 I. 5 g/L,K2HPO4 I g/L, (NH4)2SO4 8-12 g/L,自來水和玉米浸泡水的體積比為1:1，作為流加液，調(diào)節(jié)PH至3. 9-4. I ;作為培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)pH至6. 8-7. 2 ； (3)滅菌將配制好的培養(yǎng)基于121 125°C維持15-20min，然后降至26-32 °C， (4)接種按照10%(v/v)的接種量進行接種，所用弗吉尼亞鏈霉菌，Streptomycesvirginiae已由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏,保藏編號為CGMCCNo. 6420，保藏日期為2012年8月13日； (5)發(fā)酵種子培養(yǎng)階段，初始pH為6.8-7. O、溫度26-32 °C、攪拌培養(yǎng)或振蕩培養(yǎng)20-30 h;發(fā)酵時間 40-144 h，ρΗ3· 8 4. 2，流加葡萄糖 300-500 g/L 和(NH4) 2S0440_80 g/L，使發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖含量在10-15 g/L，收集發(fā)酵液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種玉米浸泡水用于發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的方法，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。用玉米浸泡水代替部分配料用水和酵母膏，采用從土壤中篩選所獲得的弗吉尼亞鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸。該工藝操作方便，不但可以節(jié)約配料用水，還能夠節(jié)省玉米浸泡水濃縮時的能耗，同時也解決了原來處理玉米浸泡水時的環(huán)境污染問題。此外，其產(chǎn)酸率和糖酸轉(zhuǎn)化率也有所提高，可用于工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵。
文檔編號C12P13/02GK102827889SQ20121032749
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月7日
發(fā)明者王國良, 金貞花, 陶進, 趙雪松, 曹雪, 范春艷, 劉躍芹 申請人:吉林中糧生化科技有限公司