專利名稱：梅久蘭鏈霉菌zw-1菌株及其發(fā)酵液的抑菌用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種來(lái)自海洋的鏈霉菌菌株的用途，特別是梅久蘭鏈霉菌ZW-I菌株及其發(fā)酵液的抑菌用途。
背景技術(shù)：
生物防治已經(jīng)成為植物病害防治的重要手段。但目前用于生物防治的微生物菌株多數(shù)來(lái)自于陸地，而多年來(lái)對(duì)陸地微生物的篩選，導(dǎo)致篩選到產(chǎn)生新型抗病機(jī)制的微生物的幾率越來(lái)越低，因而越來(lái)越多的人們把目光投向了海洋，希望從海洋環(huán)境中極具多祥性的微生物中開發(fā)出新型抗病原菌活性物質(zhì)，用于植物病害的生物防治。近幾年以來(lái)，從海洋中尋找微生物新種和具有特殊功能的生理活性物質(zhì)成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，海洋微生物已經(jīng)成為農(nóng)用抗生素的新資源。·海洋放線菌是海洋微生物中ー類特殊的、具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的微生物，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，近年來(lái)50%以上新發(fā)現(xiàn)的海洋微生物活性物質(zhì)是由海洋放線菌這個(gè)龐大的分類群產(chǎn)生的，許多放線菌的次生代謝產(chǎn)物具有醫(yī)藥和植物保護(hù)方面的用途，已廣泛用作抗細(xì)菌、抗真菌和抗腫瘤藥物。目前關(guān)于海洋放線菌活性物質(zhì)的研究已經(jīng)引起人們的重視，從海洋環(huán)境中分離得到了多種產(chǎn)生新活性物質(zhì)的海洋放線菌，并對(duì)得到菌株的發(fā)酵條件、生物活性以及活性物質(zhì)的分離鑒定進(jìn)行了研究，取得了一定的成果，海洋放線菌對(duì)植物病原真菌的抗菌作用研究已有報(bào)道，但有關(guān)梅久蘭鏈霉菌iStreptomyces對(duì)植物病原真菌抗菌活性的研究目前尚未見報(bào)道。目前隨著人們生活水平的提高和對(duì)食品安全的重視，一些高毒農(nóng)藥逐步限制使用，防治植物病害需要開發(fā)大量無(wú)毒的微生物農(nóng)藥，優(yōu)良微生物菌株的篩選是生物農(nóng)藥研發(fā)的基礎(chǔ)，而現(xiàn)有的微生物菌株遠(yuǎn)不能滿足微生物農(nóng)藥開發(fā)的需求，分離篩選新型抗菌微生物菌株對(duì)于微生物農(nóng)藥的開發(fā)具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供ー種梅久蘭鏈霉菌ZW-I菌株的新的抑菌用途。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明是一種梅久蘭鏈霉菌ZW-I (.Streptomyces medioIani strain zw_l)及其發(fā)酵液的抑菌用途,所抑的菌為小麥雪腐錸刀菌a / irah)、小麥赤霉病菌greunirwaruni)
落葉病菌油菜菌核病菌{Sclerotinia、菠菜早
疫病菌 iAltorimria solani )、玉米圓斑病菌{Helminthosporium ca/ふ9/ )、西瓜枯萎病M (Fusarium oxysporum f. sp./ i Fe應(yīng)ノ或者棉花枯_病菌、/7W1Sari應(yīng) oxysporum f. sp.vasmfectum)
本發(fā)明所涉及的生物材料“梅久蘭鏈霉菌ZW-1 CStreptomyces mediolani strainzw-1)”菌株已于2011年12月5日在Genebank公開(登錄號(hào)為JQ309924. 1，網(wǎng)址為http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/JQ309924. I。該菌株為公知公用材料，在該專利申請(qǐng)日期起二十年內(nèi)，公眾如果需要，淮海工學(xué)院海洋學(xué)院實(shí)驗(yàn)室可對(duì)外提供。本發(fā)明中所述的梅久蘭鏈霉菌ZW-I是通過(guò)以下方法分離得到
(1)分離純化從連云港海域的連島、高公島采集海水、海泥、近海土樣、海洋動(dòng)、植物樣品，25°C，180r/min富集振蕩培養(yǎng)5d ;采用稀釋平板分離法分離放線菌，三區(qū)劃線純化后轉(zhuǎn)接到高氏一號(hào)斜面培養(yǎng)基上；
(2)菌株的篩選采用平板對(duì)峙法，取直徑5_植物病原真菌菌苔置于PDA平板中央，在真菌菌胎四周對(duì)稱位置，距離平皿邊緣15_處劃線接種分離到的海洋放線菌不同菌株，25°C倒置恒溫培養(yǎng)，觀察真菌菌絲生長(zhǎng)情況，5d后測(cè)量抑菌帶寬度，每個(gè)菌株為一處理，以不接放線菌對(duì)照，重復(fù)3次；選取一株對(duì)所述的8種植物病原真菌的抑菌帶寬度平均值大于8_、發(fā)酵液的抑菌帶寬度高于5mm的菌株，記為ZW-I菌株；
(3)菌株的鑒定采用插片法，將ZW-I菌株劃線接種到高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板上，將滅 菌的蓋玻片以45°角插入劃線接種部位的培養(yǎng)基內(nèi)，28°C條件下分別于培養(yǎng)4、6、8d取出蓋玻片，觀察菌絲及孢子絲形態(tài)特征；同時(shí)進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，并進(jìn)行16S rDNA測(cè)序分析；根據(jù)形態(tài)學(xué)和生理生化試驗(yàn)結(jié)果初步認(rèn)為菌株ZW-I屬于鏈霉菌屬；16SrDNA的同源性分析表明，ZW-I菌株最接近于mediolani，二考飽16SrDNA序列相似性為99 %, Zff-I菌株為梅久蘭鏈霉菌mediolani')。本發(fā)明中所述的梅久蘭鏈霉菌ZW-I是發(fā)明人從連云港海域采集海水海泥、海洋動(dòng)植物樣品，分離純化具有抗真菌作用的海洋放線菌，并對(duì)優(yōu)良菌株的抗菌作用和種類鑒定進(jìn)行系統(tǒng)研究，旨在為海洋放線菌用于植物病害的生物防治提供優(yōu)良菌株和理論依據(jù)。下面對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更為詳細(xì)的說(shuō)明。I材料和方法
I.I供試植物病原真菌
小麥雪腐鐮刀菌 iFusarium小麥赤霉病菌{Fusarium gramirwarum)、Μ^Μ·
葉病菌(Wternaria. alternaia)、油菜菌核病菌{Sclerotinia sclerotiorum)、菠菜早疫病菌 iAltorimria solani )、玉米圓斑病菌{Helminthosporium carAo/w )、西瓜枯萎病菌{Fusarium oxysporum f. sp. niveum)或者棉花枯萎病菌應(yīng) oxysporum f. sp.vasinfectum)由中國(guó)農(nóng)科院植物保護(hù)研究所土傳病害實(shí)驗(yàn)室提供，由淮海工學(xué)院海洋學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。I. 2 培養(yǎng)基
植物病原真菌活化及抑菌試驗(yàn)培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基。樣品的富集和放線菌分離培養(yǎng)基海水高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基。淀粉培養(yǎng)基可溶性淀粉2g、酵母粉O. 5g、蛋白胨O. 5g、瓊脂2g，海水100ml。I. 3海洋放線菌的分離與純化
從連云港海域的連島、高公島等地采集海水、海泥、近海土樣、海洋動(dòng)、植物樣品，25°C,180r/min富集振蕩培養(yǎng)5d。采用稀釋平板分離法分離放線菌，三區(qū)劃線純化后轉(zhuǎn)接到高氏一號(hào)斜面培養(yǎng)基上。1.4海洋放線菌對(duì)植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用
采用平板對(duì)峙法。取直徑5mm植物病原真菌菌苔置于PDA平板中央，在真菌菌胎四周對(duì)稱位置，距離平皿邊緣15_處劃線接種分離到的海洋放線菌不同菌株，25°C倒置恒溫培養(yǎng)，觀察真菌菌絲生長(zhǎng)情況，5d后測(cè)量抑菌帶寬度。以不接放線菌對(duì)照，3次重復(fù)。1.5放線菌無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)真菌的抑制作用
無(wú)菌發(fā)酵液的制備有抑菌活性的放線菌不同菌株培養(yǎng)5d，用5ml無(wú)菌水洗下菌苔，搖勻制成菌懸液，取3ml菌懸液接種到裝有60ml高氏一號(hào)培養(yǎng)液的250ml三角瓶中，25°C, 180r/min振蕩培養(yǎng)5d,培養(yǎng)液于4°C, 5000r/min條件下離心IOmin,上清液用孔徑為
0.22um的細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾，即得到不同海洋放線菌菌株的無(wú)菌發(fā)酵液。無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)真菌的抑制作用用打孔器打取直徑為5mm真菌菌苔并倒扣接在PDA平板中央，距皿邊緣15mm處，四周對(duì)稱放置直徑為5mm的牛津杯，每個(gè)牛津杯內(nèi)加入250 u I放線菌不同菌株的無(wú)菌發(fā)酵液，以等量的高氏I號(hào)液體培養(yǎng)基為對(duì)照，25°C恒溫培養(yǎng)4d，測(cè)定抑菌帶寬度，每處理重復(fù)3次。1.6無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)菠菜早疫病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用
用5mL無(wú)菌水洗下培養(yǎng)5 d的菠菜早疫病菌的菌落，用4層無(wú)菌紗布過(guò)濾除去菌絲，濾液在室溫，4000 r/min下離心IOmin，沉淀即為分生孢子，用制備好的放線菌無(wú)菌發(fā)酵液配制孢子懸浮液，濃度為IO6個(gè)孢子/mL，取20 y L孢子懸浮液滴加在無(wú)菌載玻片上，置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，28 °C下恒溫保濕培養(yǎng)，分別于2，4，6，8，IOh觀察菠菜早疫病菌的孢子萌發(fā)和芽管伸長(zhǎng)情況。I. 6抗菌海洋放線菌的種類鑒定
1.6. I形態(tài)學(xué)觀察
采用插片法。具有較強(qiáng)抑菌作用的海洋放線菌劃線接種到高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板上，將滅菌的蓋玻片以45°角插入劃線接種部位的培養(yǎng)基內(nèi)，28°C條件下分別于培養(yǎng)4、6、8d取出蓋玻片，觀察放線菌菌絲及孢子絲形態(tài)特征。1.6. 2生理生化試驗(yàn)
使用生化鑒定管，對(duì)分離得到的抑菌活性強(qiáng)的放線菌菌株，按照文獻(xiàn)的方法測(cè)定生理生化特性。I. 6. 3放線菌16SrDNA序列分析
放線菌基因組DNA的提取采用CTAB裂解法[17]。 擴(kuò)增引物為細(xì)菌通用引物，正向引物為 27f :5 ' -AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3 '，反向引物為 1492R 5' -ACGGTTACCTTACCTTGTTACGACTT -3'，由上海生エ生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性4min，94°C變性50s，52°C退火50s，72°C延伸lmin30s，循環(huán)數(shù)35，72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)I. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收純化，送上海生エ生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序，得到的16SrDNA序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用BLAST與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的放線菌16S rDNA序列進(jìn)行相似性比較分析，采用DNAStar與Mega軟件進(jìn)行序列的比較及系統(tǒng)發(fā)育樹分析。2結(jié)果與分析
2.I抗菌海洋放線菌的分離篩選結(jié)果
從采集的17個(gè)樣品中分離得到22株海洋放線菌，有9個(gè)菌株對(duì)供試的植物病原真菌具有較強(qiáng)的抑菌活性。其中Zw-I菌株的抑制活性最強(qiáng)，該菌株對(duì)供試的8種植物病原真菌均具有較強(qiáng)的抑制作用，菌株的抑菌帶寬度均在8mm以上，結(jié)果見表I。表I Zw-I菌株及其發(fā)酵液對(duì)8種植物病原真菌的抗菌作用
權(quán)利要求
1.一種梅久蘭鏈霉菌 ZW-1 (Streptomyces mediolani strain zw_l)及其發(fā)酵液的抑菌用途，所抑的菌為小麥雪腐鐮刀菌(Fusarium nivale)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、斑點(diǎn)落葉病菌(Alternaria. alternata)、油菜菌核病菌(SclerotiniascIerotiorum)、菠菜早疫病菌(Alternaria soIani)、玉米圓斑病菌(Helminthosporiumcarbonum)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. niveum)或者棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述的梅久蘭鏈霉菌ZW-I是通過(guò)以下方法分離得到 (1)分離純化從連云港海域的連島、高公島采集海水、海泥、近海土樣、海洋動(dòng)、植物樣品，25°C，180r/min富集振蕩培養(yǎng)5d ;采用稀釋平板分離法分離放線菌，三區(qū)劃線純化后轉(zhuǎn)接到高氏一號(hào)斜面培養(yǎng)基上； (2)菌株的篩選采用平板對(duì)峙法，取直徑5_植物病原真菌菌苔置于PDA平板中央，在真菌菌胎四周對(duì)稱位置，距離平皿邊緣15_處劃線接種分離到的海洋放線菌不同菌株，25°C倒置恒溫培養(yǎng)，觀察真菌菌絲生長(zhǎng)情況，5d后測(cè)量抑菌帶寬度，每個(gè)菌株為一處理，以不接放線菌對(duì)照，重復(fù)3次；選取一株對(duì)所述的8種植物病原真菌的抑菌帶寬度平均值大于8_、發(fā)酵液的抑菌帶寬度高于5mm的菌株，記為ZW-I菌株； (3)菌株的鑒定采用插片法，將ZW-I菌株劃線接種到高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板上，將滅菌的蓋玻片以45°角插入劃線接種部位的培養(yǎng)基內(nèi)，28°C條件下分別于培養(yǎng)4、6、8d取出蓋玻片，觀察菌絲及孢子絲形態(tài)特征；同時(shí)進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，并進(jìn)行16S rDNA測(cè)序分析；根據(jù)形態(tài)學(xué)和生理生化試驗(yàn)結(jié)果初步認(rèn)為菌株ZW-I屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)；16SrDNA的同源性分析表明，ZW-1菌株最接近于Streptomyces mediolani, 二者的16SrDNA序列相似性為99 %, ZW-1菌株鑒定為梅久蘭鏈霉菌(Streptomyces mediolani)。
全文摘要
本發(fā)明是一種梅久蘭鏈霉菌ZW-1菌株及其發(fā)酵液的抑菌用途，所抑的菌為小麥雪腐鐮刀菌、小麥赤霉病菌、斑點(diǎn)落葉病菌、油菜菌核病菌、菠菜早疫病菌、玉米圓斑病菌、西瓜枯萎病菌或者棉花枯萎病菌。本發(fā)明梅久蘭鏈霉菌ZW-1及其發(fā)酵液可抑制植物病原真菌菌絲的生長(zhǎng)，導(dǎo)致病原真菌菌絲細(xì)胞壁膨大，原生質(zhì)體濃縮，并可抑制菠菜早疫病菌分生孢子的萌發(fā)和芽管的伸長(zhǎng)，抑菌效果好，具有良好植物病害生物防治的開發(fā)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/02GK102835423SQ20121026899
公開日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月1日
發(fā)明者馬桂珍, 暴增海, 王淑芳, 吳少杰, 付泓潤(rùn), 葛平華 申請(qǐng)人:淮海工學(xué)院