專利名稱：一株解淀粉芽孢桿菌菌株的胞外多糖代謝產(chǎn)物提取及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens C-I菌株的胞外多糖代謝產(chǎn)物提取及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來，采用微生物及其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)來防治農(nóng)作物真菌病害已成為重要研究方向之一，Caldelra等分離到一株解淀粉芽孢桿菌CCMI 1051 (Bacillusamyloliquefaciens)對(duì)根霉 L-122 (Rhizopussp)和哈茨木霉 CCMI 783 (Trichodermaharzianum)等具有強(qiáng)烈的抑制作用[Annals of mic rbilology,2007, 57:29-33] oArrebola等報(bào)道解淀粉芽孢桿菌PPCB004可抑制Penicillium crustosum Thom等青霉屬真菌的菌絲延伸，Lee等發(fā)現(xiàn)緩病類芽孢桿菌WJ5 (Paenibacillus Ientimorbus)菌株抑制灰霉(Botrytis cinerea)等多種植物致病菌,其抗真菌活性物質(zhì)分泌于細(xì)胞外，并可被正丁醇提取。研究表明芽孢桿菌及其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)在植物病害生物防治中具有巨大的應(yīng)用潛力。解淀粉芽孢桿菌是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細(xì)菌，在其自身的生長(zhǎng)過程中可以產(chǎn)生一系列的代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物使得解淀粉芽孢桿菌能夠具有廣泛地抑制真菌和細(xì)菌的活性。王英國等人從堆肥中分離到一株解淀粉芽孢桿菌，其對(duì)于尖孢鐮刀菌、草莓蛇病菌等植物病原真菌均有很強(qiáng)的抑制作用。李潞濱等人從各地大花惠蘭種植地采集的土樣中篩選出對(duì)大花惠蘭根腐病病原菌尖孢鐮刀菌具有拮抗活性的解淀粉芽孢桿菌ZL725。王奕文等人首次從不同甜瓜果實(shí)表面分離到一株解淀粉芽孢桿菌，對(duì)灰葡萄孢、鏈格孢、尖孢鐮刀菌、黑曲霉和粉紅單端孢等8種果蔬采后病原真菌顯著且廣譜的拮抗作用。姜軍坡等人從健康牛的糞便中篩選出對(duì)大腸桿菌有抑制作用的解淀粉芽孢桿菌BN-9。Sutyak等人從酸奶廠的益生菌乳制品中分離出I株解淀粉芽孢桿菌。其細(xì)胞的無菌上清液進(jìn)行過夜培養(yǎng)后，可以對(duì)李斯特菌(Listeria monocytogenes)產(chǎn)生抑菌作用。同時(shí),在臨床試驗(yàn)中對(duì)陰道加德納菌和無乳鏈球菌也有抑制效果，其有效抑菌物質(zhì)為細(xì)菌素。W. S.ffu等人研究了解淀粉芽孢桿菌對(duì)秋英科作物細(xì)菌病害的潛在防治效果，通過從2處寄主(試驗(yàn)田)(C、T)中分離解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行的拮抗劑治療活性菌株源性病原體的實(shí)驗(yàn)以及溫室和田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)6株來自于寄主C與I株來自于寄主T的解淀粉芽孢桿菌能夠有效地降低種子和葉片病害的嚴(yán)重性。對(duì)解淀粉芽孢桿菌代謝產(chǎn)物，尤其是其胞外多糖的抗人腫瘤方面的研究屬于首次，抗氧化作用的研究屬于首次。多糖抗氧化作用已經(jīng)成為最為活躍的研究課題之一，通常植物和藻類來源的多糖較為普遍，但近些年來，微生物來源的多糖(胞外多糖)引起廣泛關(guān)注，尤其是細(xì)菌和真菌來源的胞外多糖，因其易于分離純化而且產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)在工業(yè)生產(chǎn)中頗受青睞。胞外多糖(Exopolysaccharide, EPS)是細(xì)菌細(xì)胞外含糖結(jié)構(gòu)的總稱,包括革蘭氏陰性細(xì)菌胞膜外的多糖成分和革蘭氏陽性菌得肽聚糖，是細(xì)菌在特定環(huán)境調(diào)節(jié)下產(chǎn)生的高分子物質(zhì)。作為細(xì)菌的次生代謝產(chǎn)物，胞外多糖對(duì)細(xì)菌的作用主要有使細(xì)菌群集抵抗吞噬；保護(hù)細(xì)菌不和抗體結(jié)合；形成群集內(nèi)細(xì)菌交替性生長(zhǎng)；幫助細(xì)菌群體向周圍獲得足夠營養(yǎng)。作為與人類生活緊密相關(guān)的一類生物高分子，近年的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌胞外多糖還具有抗氧化、抗輻射、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂，以及抗腫瘤、抗肝炎病毒等特殊的生物學(xué)活性。近年來，微生物多糖抗氧化活性的研究報(bào)道很多，其在體外可以清除自由基，還具有抗脂質(zhì)過氧化的能力；在體內(nèi)則可以提高抗氧化酶的活性，也表現(xiàn)出抗脂質(zhì)過氧化的能力，還可能與通過調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)內(nèi)源性抗氧化劑的活性相關(guān)。另外多糖可以作為一種天然的生物抗氧化劑進(jìn)行復(fù)配，增強(qiáng)對(duì)人體健康的保護(hù)作用。微生物多糖在治療和/或抑制腫瘤或在腫瘤輔助診斷、預(yù)后中應(yīng)用，包含解淀粉芽孢桿菌的基因重組或組合物及其抑制真菌、細(xì)菌、抗氧化作用等生物活性及其應(yīng)用上，鮮有報(bào)道，該研究為探尋抗腫瘤藥物提供新思路及新研究領(lǐng) 域。有報(bào)道稱部分解淀粉芽孢桿菌具有抑菌性質(zhì)(包括真菌和細(xì)菌)，在植物病害生物防治中具有巨大的應(yīng)用潛力，目前關(guān)于解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens C-I的胞外多糖抗人腫瘤相關(guān)方面的研究未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一株解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens C_1菌株的胞外多糖代謝產(chǎn)物提取及應(yīng)用，為探尋抗腫瘤藥物開拓了新思路及新研究領(lǐng)域。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為一株解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens C-1菌株的胞外多糖代謝產(chǎn)物，對(duì)其16srRNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增片段，測(cè)序后進(jìn)行NCBI數(shù)據(jù)庫的細(xì)菌16s rRNA序列比對(duì)，證實(shí)該分離株屬于解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens,命名為解淀粉芽孢桿菌C-I，其16s rRNA序列NCBI登錄號(hào)為JN974457，該菌現(xiàn)保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號(hào)為 CCTCC Ν0:Μ 2012177。—株解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens C_1產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵、多糖的提取C_1菌株在LB+1%葡萄糖的固體培養(yǎng)基上的菌苔呈白色、、濕潤(rùn)、飽滿；經(jīng)過濃縮、沉淀、除蛋白、透析后得到B. amyloliquefaciens C-I胞外多糖提純產(chǎn)物,產(chǎn)量為380mg/L,其中的糖蛋白濃度為0. 7%?！杲獾矸垩挎邨U菌B. amyloliquefaciens C_1胞外多糖的體外抗氧化活性B. amyloliquefaciens C-I胞外多糖還原能力見表I表I
權(quán)利要求
1.一株解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens C-1,其特征在于對(duì)其16srRNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增片段，測(cè)序后進(jìn)行NCBI數(shù)據(jù)庫的細(xì)菌16s rRNA序列比對(duì)，證實(shí)該分離株屬于解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens,命名為解淀粉芽孢桿菌C-1,其16s rRNA序列NCBI登錄號(hào)為JN974457，該菌現(xiàn)保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號(hào)為 CCTCC NO:M 2012177。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一株解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens C_l,其特征在于產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵、多糖的提取，G-14菌株在LB+1%葡萄糖的固體培養(yǎng)基上的菌苔呈白色、濕潤(rùn)、飽滿；經(jīng)過濃縮、沉淀、除蛋白、透析后得到B. amyloliquefaciens C-I胞外多糖提純產(chǎn)物，產(chǎn)量為380mg/L，其中的糖蛋白濃度為0. 7%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述一株解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens C_l,其特征在于B. amyloliquefaciens C-I胞外多糖還原能力見表I 表I
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述一株解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens C_l,其特征在于B. amyloliquefaciens C-I胞外多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用見表2 表2
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述一株解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens C_l,其特征在于B. amyloliquefaciens C-I胞外多糖對(duì)輕自由基 OH的清除作用見表3 表3
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述一株解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens C_l，其特征在于胞外多糖對(duì)超氧陰離子02—的清除作用見表4 表4
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述一株解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens C_l，其特征在于脂質(zhì)過氧化抑制作用見表5 表5
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述一株解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens C_l，其特征在于解淀粉芽孢桿菌對(duì)人腫瘤細(xì)胞增殖的抑制結(jié)果見表6和表7 表6解淀粉芽孢桿菌提純的胞外多糖2. 5mg/ml對(duì)不同人腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率％
全文摘要
一株解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens C-1菌株的胞外多糖代謝產(chǎn)物提取及應(yīng)用，其16s rRNA擴(kuò)增片段經(jīng)測(cè)序后進(jìn)行NCBI數(shù)據(jù)庫的細(xì)菌16s rRNA序列比對(duì)，證實(shí)該分離株屬于解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens，其16s rRNA序列NCBI登錄號(hào)為JN974457，該菌現(xiàn)保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中(CCTCC)，具有胞外多糖還原能力、對(duì)DPPH自由基的清除、對(duì)羥自由基·OH的清除作用、對(duì)超氧陰離子O2-的清除作用、脂質(zhì)過氧化抑制作用、對(duì)人腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，為探尋抗腫瘤藥物開拓了新思路及新研究領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12P19/04GK102816716SQ20121026866
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月31日
發(fā)明者羅文娟, 韓蓓, 李旭, 劉翠翠, 韓蓁, 羅國剛, 張彥民 申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)