專利名稱：一種藤黃微球菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種藤黃微球菌及其應用。
背景技術：
石油污染土壤的微生物修復技術，近十幾年來在國外得到了較大發(fā)展，但是石油烴類污染物降解速度緩慢，致使治理過程延續(xù)時間較長，一直是這項技術的一個突出難點，因此尋找高效石油降解菌是當前石油污染土壤微生物修復技術的研究熱點。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于針對上述現(xiàn)有技術的不足，提供一種可用于降解 石油污染物的藤黃微球菌。該菌株是以原油為唯一碳源篩選出來的優(yōu)勢菌株，菌株在生長繁殖過程中可改變原油的性質，使原油的組分發(fā)生變化，起到乳化、潤濕和分散原油的作用。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案是一種藤黃微球菌，其特征在于，所述藤黃微球菌為Micrococcus luteus4006，保藏編號CGMCC No. 6072，保藏日為2012年5月3日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。I、該菌株具有如下的性質形態(tài)特征球狀，菌落呈亮黃色，濕潤，直徑Imm 2mm，細胞直徑彡2 u m。生理生化特征革蘭氏陽性細菌。2、該菌株的篩選方法為步驟一、富集將從西安市未央?yún)^(qū)長安大學渭水校區(qū)陜西省地下水與生態(tài)環(huán)境工程研究中心試驗場土壤石油污染10000mg/kg修復區(qū)IOcm左右紅三葉草根際修復區(qū)采集的土樣以無菌方式稱取10. Og,接入100. OmL石油/無機鹽液體培養(yǎng)基中，置于28土1°C、130r/min恒溫搖床富集培養(yǎng)7d ;然后吸取5mL培養(yǎng)液重新轉接入新鮮的石油/無機鹽液體培養(yǎng)基中，再進行3次富集、馴化，每次7d ;所述石油/無機鹽液體培養(yǎng)基的組成為NaNO3O. 15%, (NH4) SO4O. 15%, K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%, KC10. 05%, FeSO4 7H200. 001%,CaCl2O. 0002%,蒸餾水lOOOmL，原油(延長石油脫水原油)0. 5%，以上均為質量百分比，培養(yǎng)基 pH 值 7. 0 7. 5，105KPa 滅菌 20min 25min ；步驟二、篩選和純化將步驟一中富集培養(yǎng)后的富集培養(yǎng)液按十倍稀釋法稀釋，取10_4、10_5、10_63個稀釋度的培養(yǎng)液各0. ImL涂布于石油/無機鹽固體平板培養(yǎng)基上，置于37土 TC恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)48h，選取不同顏色及形態(tài)的優(yōu)勢單菌落，在石油/無機鹽固體平板培養(yǎng)基上進行多次劃線分離，以純化得到形態(tài)一致的純化菌株，將純化菌株保存于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上進行進一步篩選、活化，得到菌株，待用；所述石油/無機鹽固體平板培養(yǎng)基的組成為=NaNO3O. 15%，(NH4) SO4O. 15%，K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%,KC10. 05%, FeSO4 7H200. 001%, CaCl2O. 0002%，瓊脂 2%，蒸餾水 lOOOmL，原油(延長石油脫水原油)0. 5%，以上均為質量百分比，培養(yǎng)基pH值7. 0 7. 5，105KPa滅菌20min 25min ；
步驟三、復篩將步驟二中活化好的菌株分別接種于IOOmL含有l(wèi)wt%正十二烷和lwt%環(huán)己烷的無機鹽液體培養(yǎng)基中，28 土 1°C、130r/min搖床培養(yǎng)，當培養(yǎng)液明顯渾濁后，取ImL培養(yǎng)液接種到含lwt%正十二烷和lwt%環(huán)己烷的無機鹽固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后再將培養(yǎng)的菌株接種于IOOmL含有l(wèi)wt%正十二烷和lwt%環(huán)己烷的無機鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如此重復3次，保存最終仍能使含有正十二烷和環(huán)己烷的無機鹽液體培養(yǎng)基變渾濁的菌株。3、該菌株的鑒定方法為步驟一、提取總DNA 101、取過夜培養(yǎng)菌株(至多2X109個)，10000r/min離心Imin收集菌體，加入180 u L 溶菌溶液(20mg/mL 溶菌酶，20mMTris_HCl pH8，2. 5mMEDTA, l%TritonX-100),重懸菌液，37 °C水浴30min 60min ;然后向重懸菌液中添加20 y L蛋白酶K溶液(10mg/mL)，充分振蕩混勻，56°C水浴30min至細胞完全裂解，接著加入200 u L溶液BD，充分振蕩混勻， 70°C水浴lOmin，再加入200 u L無水乙醇，充分振蕩混勻；102、將吸附柱放入收集管中，用移液器將101中振蕩混勻后的菌液全部加入吸附柱中，靜置2min, 12000r/min離心3min,倒掉濾液；向吸附柱中加入500 u L溶液PW,10000r/min離心Imin,倒掉濾液；向吸附柱中加入500 u L漂洗溶液Wash buffer, IOOOOr/min離心lmin，倒掉濾液；將吸附柱放入收集管中，于12000r/min離心2min，除去殘留的漂洗液 Wash buffer ；103、取出吸附柱，放入一個新的1.5mL的離心管，加入50iiL預熱(60°C)的洗脫液Elution buffer,靜置3min, 10000r/min室溫離心lmin,收集DNA溶液；采用濃度為2%瓊脂糖對提取的總DNA進行檢測，片段大小在13kb左右；步驟二、16SrDNA的PCR擴增以步驟一中提取的總DNA為模板進行PCR擴±曾，PCR反應體系DNA模板lOpmol，上游引物(IOiiM)IiU,下游引物(IOiiM)IiU ；dNTP (IOMm) I U I ; 10 X Taq reaction Buffer5 U I ；Taq (5U/ U I) 0. 25 U I ;加水至 50 U I ;PCR 反應條件預變性 98°C 5min ;循環(huán) 95°C 35s，55°C 35s，72°C 30s，35 個循環(huán)，最后 72 V延伸8min，4°C保存；所述PCR擴增的引物序列為上游引物(SEQID NO. I) :5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’ ；下游引物(SEQID NO. 2) :5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’ ；步驟三、菌株16SrDNA序列分析及比對對步驟二中PCR擴增的產物(片段大小I. 4kb左右)進行測序(由生工生物工程(上海)有限公司協(xié)助完成)，得到的16SrDNA部分基因序列(SEQ ID NO. 3)與GenBank中已發(fā)表的藤黃微球菌(Micrococcus Iuteus)的16SrDNA序列進行同源性比較，相似度達99. 0%。綜合生理生化鑒定、16SrDNA序列分析鑒定結果，鑒定本發(fā)明的菌株為藤黃微球菌。本發(fā)明還提供了上述用于藤黃微球菌在降解石油污染物中的應用。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點I、本發(fā)明的藤黃微球菌源于土壤，因此該菌株進入土壤后很快成為優(yōu)勢菌群，占據(jù)一定生態(tài)位，有效促進石油烴類的降解，優(yōu)化土壤微生物體系，改善土壤的物理性狀，增強土壤的生物活性，修復板結退化的土壤。
2、本發(fā)明的藤黃微球菌是以原油為唯一碳源篩選出來的優(yōu)勢菌株，菌株在生長繁殖過程中可改變原油的性質，使原油的組分發(fā)生變化，起到乳化、潤濕和分散原油的作用。3、本發(fā)明的藤黃微球菌可在短時間內降解土壤中的石油污染物。下面通過實施例，對本發(fā)明的技術方案做進一步的詳細描述。
具體實施例方式菌株的篩選步驟一、富集將從西安市未央?yún)^(qū)長安大學渭水校區(qū)陜西省地下水與生態(tài)環(huán)境工程研究中心試驗場土壤石油污染10000mg/kg修復區(qū)IOcm左右紅三葉草根際修復區(qū)采集的土樣以無菌方式稱取10. Og,接入100. OmL石油/無機鹽液體培養(yǎng)基中，置于28土1°C、130r/min恒溫搖床富集培養(yǎng)7d ;然后吸取5mL培養(yǎng)液重新轉接入新鮮的石油/無機鹽液體培養(yǎng)基中，再進行3次富集、馴化，每次7d ;所述石油/無機鹽液體培養(yǎng)基的組成為 NaNO3O. 15%, (NH4) SO4O. 15%, K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%, KC10. 05%, FeSO4 7H200. 001%,CaCl2O. 0002%,蒸餾水lOOOmL，原油(延長石油脫水原油)0. 5%，以上均為質量百分比，培養(yǎng)基 pH 值 7. 0 7. 5，105KPa 滅菌 20min 25min ；步驟二、篩選和純化將步驟一中富集培養(yǎng)后的富集培養(yǎng)液按十倍稀釋法稀釋，取10_4、10_5、10_63個稀釋度的培養(yǎng)液各0. ImL涂布于石油/無機鹽固體平板培養(yǎng)基上，置于37土 TC恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)48h，選取不同顏色及形態(tài)的優(yōu)勢單菌落，在石油/無機鹽固體平板培養(yǎng)基上進行多次劃線分離，以純化得到形態(tài)一致的純化菌株，將純化菌株保存于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上進行進一步篩選、活化，得到菌株，待用；所述石油/無機鹽固體平板培養(yǎng)基的組成為=NaNO3O. 15%，(NH4) SO4O. 15%，K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%,KC10. 05%, FeSO4 7H200. 001%, CaCl2O. 0002%，瓊脂 2%，蒸餾水 lOOOmL，原油(延長石油脫水原油)0. 5%，以上均為質量百分比，培養(yǎng)基pH值7. 0 7. 5，105KPa滅菌20min 25min ；步驟三、復篩將步驟二中活化好的菌株分別接種于IOOmL含有l(wèi)wt%正十二烷和lwt%環(huán)己烷的無機鹽液體培養(yǎng)基中，28 土 1°C、130r/min搖床培養(yǎng)，當培養(yǎng)液明顯渾濁后，取ImL培養(yǎng)液接種到含lwt%正十二烷和lwt%環(huán)己烷的無機鹽固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后再將培養(yǎng)的菌株接種于IOOmL含有l(wèi)wt%正十二烷和lwt%環(huán)己烷的無機鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如此重復3次，保存最終仍能使含有正十二烷和環(huán)己烷的無機鹽液體培養(yǎng)基變渾濁的菌株。菌株的鑒定步驟一、提取總DNA 101、取過夜培養(yǎng)菌株(至多2X109個)，10000r/min離心Imin收集菌體，加入180 u L 溶菌溶液(20mg/mL 溶菌酶，20mMTris_HCl pH8，2. 5mMEDTA, l%TritonX-100),重懸菌液，37 °C水浴30min 60min ;然后向重懸菌液中添加20 y L蛋白酶K溶液(10mg/mL)，充分振蕩混勻，56°C水浴30min至細胞完全裂解，接著加入200 u L溶液BD，充分振蕩混勻，70°C水浴lOmin，再加入200 u L無水乙醇，充分振蕩混勻；102、將吸附柱放入收集管中，用移液器將101中振蕩混勻后的菌液全部加入吸附柱中，靜置2min, 12000r/min離心3min,倒掉濾液；向吸附柱中加入500 u L溶液PW,10000r/min離心lmin,倒掉濾液；向吸附柱中加入500 u L漂洗溶液Wash buffer, 10000r/min離心lmin，倒掉濾液；將吸附柱放入收集管中，于12000r/min離心2min，離去殘留的漂洗液 Wash buffer ；103、取出吸附柱，放入一個新的1.5mL的離心管，加入50iiL預熱(60°C)的洗脫液Elution buffer,靜置3min, 10000r/min室溫離心lmin,收集DNA溶液；采用濃度為2%瓊脂糖對提取的總DNA進行檢測，片段大小在13kb左右；步驟二、16SrDNA的PCR擴增以步驟一中提取的總DNA為模板進行PCR擴±曾，PCR反應體系DNA模板lOpmol，上游引物(IOiiM)IiU,下游引物(IOiiM)IiU ；dNTP (IOMm) I U I ; 10 X Taq reaction Buffer5 U I ；Taq (5U/ U I) 0. 25 U I ;加水至 50 U I ;PCR 反應條件預變性 98°C 5min ;循環(huán) 95°C 35s，55°C 35s，72°C 30s，35 個循環(huán)，最后 72 V延伸8min，4°C保存；所述PCR擴增的引物序列為上游引物(SEQID NO. I) :5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’ ；
下游引物(SEQID NO. 2) :5，-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3，；步驟三、菌株16SrDNA序列分析及比對對步驟二中PCR擴增的產物(片段大小
I.4kb左右)進行測序(由生工生物工程(上海)有限公司協(xié)助完成)，得到的16SrDNA部分基因序列(SEQ ID NO. 3)與GenBank中已發(fā)表的藤黃微球菌(Micrococcus Iuteus)的16SrDNA序列進行同源性比較，相似度達99. 0%。綜合生理生化鑒定、16SrDNA序列分析鑒定結果，鑒定本發(fā)明的菌株為藤黃微球菌,并命名為藤黃微球菌Micrococcus luteus4006，保藏編號CGMCC No. 6072。本發(fā)明的藤黃微球菌的應用效果試驗I、藤黃微球菌對原油的降解能力試驗將本發(fā)明的藤黃微球菌接種于含有原油的無機鹽液體培養(yǎng)基中，于28±1°C,130rpm 發(fā)酵培養(yǎng) 7 天，培養(yǎng)基組成NaN030. 15%, (NH4) SO4O. 15%, K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%, KC10. 05%, FeSO4 7H200. 001%, CaCl2O. 0002%，原油 1%，蒸餾水 IOOOmL,以上均為質量百分比，PH7. 0 7. 5，滅菌20min 25min ;與未接種藤黃微球菌的培養(yǎng)基相比，發(fā)酵液的顏色明顯加深，而且，接種藤黃微球菌的發(fā)酵液中的原油具有不掛瓶的特點。這說明，本發(fā)明的藤黃微球菌以原油為唯一碳源生長，改變了原油的性質，使原油的組分發(fā)生了變化。將接種藤黃微球菌發(fā)酵后的原油在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)原油中有菌液存在，細菌存在在油水界面上，并以油為碳源，適應環(huán)境產生趨油物質，從而起到乳化、潤濕和分散原油的作用。2、藤黃微球菌對培養(yǎng)基中石油的降解試驗將本發(fā)明的藤黃微球菌接種于含有原油的無機鹽液體培養(yǎng)基中，于28±1°C,130rpm發(fā)酵培養(yǎng)7天，含有原油的無機鹽液體培養(yǎng)基組成=NaNO3O. 15%，(NH4) SO4O. 15%，K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%, KC10. 05%g, FeSO4 7H200. 001%, CaCl2O. 0002%，原油 1%，蒸餾水IOOOmL,以上均為質量百分比，pH7. 0 7. 5，滅菌20min 25min ;然后分別取IOmL發(fā)酵液接種于IOOmL新鮮的含有原油的無機鹽液體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成同上)、含有正十二烷的無機鹽液體培養(yǎng)基和含有環(huán)己烷的無機鹽液體培養(yǎng)基中，于28土 TC，130rpm發(fā)酵培養(yǎng)7天，含有正十二烷的無機鹽液體培養(yǎng)基組成=NaNO3O. 15%，(NH4) SO4O. 15%，K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%, KC10. 05%g, FeSO4 7H200. 001%, CaCl2O. 0002%,正十二烷 1%，蒸餾水IOOOmL,以上均為質量百分比，pH7. 0 7. 5，滅菌20min 25min ;含有環(huán)己烷的無機鹽液體培養(yǎng)基組成=NaNO3O. 15%, (NH4) SO4O. 15%, K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%, KC10. 05%g,FeSO4 7H200. 001%, CaCl2O. 0002%,環(huán)己烷1%,蒸餾水IOOOmL,以上均為質量百分比，pH7. 0 7. 5，滅菌20min 25min ;以未接種的三種液體培養(yǎng)基為空白對照，于28 土 1°C，130rpm發(fā)酵培養(yǎng)7天進行取樣，分別檢測接種藤黃微球菌的發(fā)酵液和空白對照的總石油烴(TPH)降解率、直鏈烷烴降解率和環(huán)烷烴降解率，結果見表I。表I菌株的石油降解率及其功能
權利要求
1.一種藤黃微球菌，其特征在于，所述藤黃微球菌為Micrococcus Iuteus 4006,保藏編號 CGMCC No. 6072 o
2.一種如權利要求I所述藤黃微球菌在降解石油污染物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種藤黃微球菌Micrococcus luteus4006，保藏編號CGMCC No.6072。另外，本發(fā)明還公開了該藤黃微球菌在降解石油污染物中的應用。本發(fā)明的藤黃微球菌源于土壤，因此該菌株進入土壤后很快成為優(yōu)勢菌群，占據(jù)一定生態(tài)位，有效促進石油烴類的降解，優(yōu)化土壤微生物體系，改善土壤的物理性狀，增強土壤的生物活性，修復板結退化的土壤。該藤黃微球菌是以原油為唯一碳源篩選出來的優(yōu)勢菌株，菌株在生長繁殖過程中可改變原油的性質，使原油的組分發(fā)生變化，起到乳化、潤濕和分散原油的作用，可在短時間內降解土壤中的石油污染物。
文檔編號C12R1/265GK102747023SQ201210264209
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月27日 優(yōu)先權日2012年7月27日
發(fā)明者李春榮, 王周峰, 王文科, 申圓圓 申請人:長安大學