專利名稱：核酸的擴(kuò)增檢測方法以及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于對核酸進(jìn)行擴(kuò)增、檢測所擴(kuò)增的核酸的方法以及試劑盒。
背景技術(shù)：
為了使用PCR對DNA進(jìn)行擴(kuò)增，需要以作為靶標(biāo)的核酸為其一對間的區(qū)域的引物核酸、聚合酶、作為該聚合酶的底物并形成擴(kuò)增后的核酸的核苷三磷酸。擴(kuò)增后，使用任意的方法，例如使用具有與靶序列互補(bǔ)的序列的特異性探針核酸，能夠檢測作為靶標(biāo)的核酸。另外，還有使用逆轉(zhuǎn)錄(RT)PCR對cDNA進(jìn)行擴(kuò)增的方法，此時(shí)，可以利用具有逆轉(zhuǎn)錄活性的聚合酶。而且，為了防止擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，已知有使用作為非天然型核苷三磷酸的脫氧尿苷三磷酸的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)法(專利第3392863號)。·
但是，在這樣的現(xiàn)有技術(shù)中，一般存在如下問題，⑴具有逆轉(zhuǎn)錄活性的聚合酶的種類受限制；(2) —般的聚合酶大多不攝取作為擴(kuò)增時(shí)的底物的脫氧尿苷三磷酸，有時(shí)不能利用UNG法中的尿嘧啶N糖基化酶進(jìn)行分解，不能防止污染；(3)擴(kuò)增的速度優(yōu)選較快。這樣，期待一種能夠進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄、能夠使用脫氧尿苷三磷酸的迅速對長鏈的靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增及檢測的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種能夠進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄、能夠使用脫氧尿苷三磷酸、能夠防止合成的核酸鏈分解、迅速對長鏈的靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增及檢測的方法。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，將序列編號I中的第653位的脯氨酸取代為谷氨酸的Tth聚合酶具有逆轉(zhuǎn)錄活性，能夠攝取脫氧尿苷三磷酸，而且通過使序列編號I中的第I 77位或者第I 291位的氨基酸缺失，能夠降低5’ 一 3’核酸外切酶活性，從而完成了本發(fā)明。SP，本發(fā)明如下所述。(I) 一種對試樣中所含的核酸進(jìn)行擴(kuò)增的方法，該方法包括(a)將用于對該核酸的任意區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的引物、聚合酶、以及作為核酸擴(kuò)增底物的核苷酸，與含有該核酸的試樣混合的工序；以及(b)利用聚合酶反應(yīng)對該區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的工序，其中，該聚合酶具有由序列編號I構(gòu)成的氨基酸序列或者與序列編號I同源的氨基酸序列，并且對應(yīng)于該氨基酸序列的653位的氨基酸殘基被谷氨酸取代。(2) 一種對試樣中所含的核酸進(jìn)行擴(kuò)增并檢測的方法，該方法包括(a)將用于對該核酸的任意區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的引物、聚合酶、作為核酸擴(kuò)增底物的核苷酸、以及用于檢測所擴(kuò)增的核酸的探針，與含有該核酸的試樣混合的工序；(b)利用聚合酶反應(yīng)對該區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的工序；以及(C)使用該探針檢測該區(qū)域的工序，其中，該聚合酶具有由序列編號I構(gòu)成的氨基酸序列或者與序列編號I同源的氨基酸序列，并且對應(yīng)于該氨基酸序列的653位的氨基酸殘基被谷氨酸取代。(3)根據(jù)(2)中所述的方法，其中，所述(C)的檢測工序通過擴(kuò)增反應(yīng)中蓄積的PCR產(chǎn)物的檢測或者熔解曲線分析而進(jìn)行。(4)根據(jù)⑴至(3)中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述進(jìn)行擴(kuò)增的核酸為DNA或RNA。(5)根據(jù)(4)中所述的方法，其中，所述(b)的擴(kuò)增工序?yàn)镻CR或RT-PCR。(6)根據(jù)(I)至(5)中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述作為核酸擴(kuò)增底物的核苷
酸含有脫氧尿苷三磷酸。(7)根據(jù)(I)至(6)中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述聚合酶是，為使5’一 3’核酸外切酶活性缺失或降低而使N末端的氨基酸缺失的改性Tth聚合酶。
·I 77位的氨基酸缺失的改性Tth聚合酶。(9)根據(jù)(7)中所述的方法，其中，所述聚合酶為序列編號I的氨基酸序列中的第I 291位的氨基酸缺失的改性Tth聚合酶。(10)根據(jù)(I)至(9)中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述(b)工序?yàn)樵?0個堿基以上/秒的條件下對核酸進(jìn)行擴(kuò)增的工序。(11)根據(jù)(10)中所述的方法，其中，所述(b)工序?yàn)閿U(kuò)增600個堿基以上的堿基
長度的工序。(12) 一種試劑盒，其用于對試樣中所含的核酸進(jìn)行擴(kuò)增，該試劑盒含有用于對任意的核酸區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的引物、聚合酶、以及作為核酸擴(kuò)增底物的核苷酸，其中，該聚合酶具有由序列編號I構(gòu)成的氨基酸序列或者與序列編號I同源的氨基酸序列，并且對應(yīng)于該氨基酸序列的653位的氨基酸殘基被谷氨酸取代。(13) 一種試劑盒，其用于對試樣中所含的核酸進(jìn)行擴(kuò)增并檢測，該試劑盒含有用于對任意的核酸區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的引物、聚合酶、作為核酸擴(kuò)增底物的核苷酸、以及對所擴(kuò)增的核酸進(jìn)行檢測的探針，其中，該聚合酶具有由序列編號I構(gòu)成的氨基酸序列或者與序列編號I同源的氨基酸序列，并且對應(yīng)于該氨基酸序列的653位的氨基酸殘基被谷氨酸取代。(14)根據(jù)(12)或(13)中所述的試劑盒，其中，所述作為核酸擴(kuò)增底物的核苷酸含
有脫氧尿苷三磷酸。本發(fā)明中使用的聚合酶由于具有逆轉(zhuǎn)錄活性，因此能夠?qū)NA或RNA中任一種核酸進(jìn)行擴(kuò)增。本發(fā)明中使用的聚合酶由于能夠攝取脫氧尿苷三磷酸，因此，優(yōu)選實(shí)施UNG法，能夠防止擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。通過本發(fā)明的方法，能夠在20個堿基以上/秒的條件下對核酸進(jìn)行擴(kuò)增，能夠提高擴(kuò)增速度。本發(fā)明的方法尤其在對600個堿基以上的長鏈堿基長度進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)極其有效。本發(fā)明中使用的聚合酶進(jìn)一步通過使序列編號I中的第I 77位或者第I 291位的氨基酸缺失，能夠使5’ 一3’核酸外切酶活性缺失或降低。本發(fā)明的方法由此能夠不分解反應(yīng)液中的核酸探針，而進(jìn)行擴(kuò)增中的探針檢測行為和擴(kuò)增后的熔解曲線分析。


圖1A、圖1B、圖1C、圖ID表示實(shí)施例I的對使用底物dNTPmix以及Tth時(shí)(圖1A)、使用底物dNTPmix以及改性Tth時(shí)(圖1B)、使用底物dAUGCmix以及Tth時(shí)(圖1C)、使用底物dAUGCmix以及改性Tth時(shí)(圖1D)的NAT2基因進(jìn)行Tm解析時(shí)的每單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度的變化量(_d熒光強(qiáng)度增加量/t)的變化。縱軸為每單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度的變化量(-d熒光強(qiáng)度增加量/t)，橫軸為溫度(V )。圖2A、圖2B表示實(shí)施例2的對使用 底物dAUGCmix以及Tth(圖2A)或者改性Tth (圖2B)的RNA(SWlnfHl區(qū)域)進(jìn)行Tm解析時(shí)的每單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度的變化量(_d熒光強(qiáng)度增加量/t)的變化。縱軸為每單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度的變化量(_d熒光強(qiáng)度增加量Λ)，橫軸為溫度(°C )。圖3A、圖3B表示實(shí)施例3的對使用底物dNTPmix以及Tth (圖3A)或者改性Tth (圖3B)的CYP2D6基因進(jìn)行Tm解析時(shí)的每單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度的變化量(_d熒光強(qiáng)度增加量/t)的變化?？v軸為每單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度的變化量(_d熒光強(qiáng)度增加量/t)，橫軸為溫度(。。)。
具體實(shí)施例方式<1>本發(fā)明的擴(kuò)增以及檢測方法本發(fā)明的方法為對試樣中所含的核酸進(jìn)行擴(kuò)增的方法，其特征在于，該方法包括(a)將用于對該核酸的任意區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的引物、聚合酶、以及作為核酸擴(kuò)增底物的核苷酸，與含有該核酸的試樣混合的工序；以及(b)利用聚合酶反應(yīng)對該區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的工序，其中，該聚合酶具有由序列編號I構(gòu)成的氨基酸序列或者與序列編號I同源的氨基酸序列，并且對應(yīng)于該氨基酸序列的653位的氨基酸殘基被谷氨酸取代。另外，本發(fā)明的方法在上述工序(a)以及(b)后，還包括(C)使用探針檢測該區(qū)域的工序。S卩，本發(fā)明的方法為對試樣中所含的核酸進(jìn)行擴(kuò)增并檢測的方法，其特征在于，該方法包括(a)將用于對該核酸的任意區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的引物、聚合酶、作為核酸擴(kuò)增底物的核苷酸、以及用于檢測所擴(kuò)增的核酸的探針，與含有該核酸的試樣混合的工序；(b)利用聚合酶反應(yīng)對該區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的工序；以及(C)使用該探針檢測該區(qū)域的工序，其中，該聚合酶具有由序列編號I構(gòu)成的氨基酸序列或者與序列編號I同源的氨基酸序列，并且對應(yīng)于該氨基酸序列的653位的氨基酸殘基被谷氨酸取代。所述(c)的檢測工序優(yōu)選通過擴(kuò)增反應(yīng)中蓄積的PCR產(chǎn)物的檢測或者熔解曲線分析而進(jìn)行。本發(fā)明的方法通過上述工序(a)、工序(b)、以及根據(jù)需要的工序(C)而進(jìn)行，除使用特定的聚合酶作為聚合酶以外，可以與現(xiàn)有技術(shù)的方法同樣地進(jìn)行工序(a) (C)。
本發(fā)明中使用的聚合酶的特征在于,作為從嗜熱性真細(xì)菌Thermus thermophilusHB8中分離的聚合酶(即Tth聚合酶)的、序列編號I的氨基酸序列的第653位的脯氨酸被取代為谷氨酸。本發(fā)明中使用的序列編號I的第653位的脯氨酸(序列編號I的第653位周邊的氨基酸序列用_Phe Gly Val Pro Pro Glu Ala Val Asp-表示,下劃線部分表示653位的脯氨酸)被取代為谷氨酸(序列編號I的第653位周邊的氨基酸序列用-Phe Gly Val ProGlu Glu Ala Val Asp-表示,下劃線部分表示被取代后的653位的谷氨酸)的改性Tth聚合酶，與第653位的脯氨酸未被取代為谷氨酸的野生Tth聚合酶相比較，聚合酶活性增加。本發(fā)明中使用的聚合酶除可以為序列編號I的第653位的脯氨酸被取代為谷氨酸的聚合酶以外，還可以為序列編號I中的第I 77位或者第I 291位的氨基酸缺失、5’ 一 3’核酸外切酶活性缺失或降低的聚合酶。對本發(fā)明中使用的野生聚合酶進(jìn)行編碼的堿基序列例如有登錄為GenBank Acc.No. D28878的喊基序列?！?br> 在本發(fā)明中，聚合酶具有由序列編號I構(gòu)成的氨基酸序列或者與序列編號I同源的氨基酸序列。在本發(fā)明的方法中使用上述的Tth聚合酶，但是，只要序列編號I的第653位的脯氨酸被取代為谷氨酸，并且不喪失聚合酶活性，例如，還可以是在序列編號I的氨基酸序列或者序列編號I中的第I 77位或者第I 291位的氨基酸缺失的氨基酸序列中，具有I個或多個、2 10個、或者2 5個氨基酸殘基被取代、缺失、插入、或添加的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。上述氨基酸取代變異的位置為序列編號I的Tth聚合酶的氨基酸序列中的位置，但是，在序列編號I的氨基酸序列中，除所述特定的變異以外，在具有I個或多個氨基酸殘基被取代、缺失、插入、或添加的氨基酸序列的Tth聚合酶的同系物或變異體中，在與序列編號I的氨基酸序列的比對中，表示對應(yīng)于所述氨基酸取代位置的位置。例如，在I 652位的區(qū)域中具有I個氨基酸殘基缺失的Tth聚合酶的保守變異體中，653位表示所述變異體的652位。另外，在具有第I 77位的氨基酸殘基的缺失的Tth聚合酶的保守變異體中，653位表示所述變異體的576位。另外，在具有第I 291位的氨基酸殘基的缺失的Tth聚合酶的保守變異體中，653位表示所述變異體的362位。同樣地，本發(fā)明的Tth聚合酶只要序列編號I的第653位的脯氨酸(序列編號I的第653位周邊的氨基酸序列用-Phe Gly Val Pro Pro GluAla Val Asp-表示,下劃線部分表示653位的脯氨酸)被取代為谷氨酸(序列編號I的第653位周邊的氨基酸序列用-PheGly Val Pro Glu Glu Ala Val Asp-表示,下劃線部分表示被取代后的653位的谷氨酸)，并且不喪失聚合酶活性，也可以為相對于序列編號I的氨基酸序列或者序列編號I中的第I 77位或者第I 291位的氨基酸缺失的氨基酸序列，至少具有80%、85%、90%、或者95%的氨基酸相一性的蛋白質(zhì)。此外，本發(fā)明中使用的聚合酶具有逆轉(zhuǎn)錄活性，因此，即使以DNA和RNA中任一種為模板也可以進(jìn)行擴(kuò)增，還可以進(jìn)行RT-PCR?；旌鲜褂媚孓D(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶時(shí)，有時(shí)需要適當(dāng)調(diào)節(jié)酶反應(yīng)，但是，只要是本發(fā)明中使用的聚合酶就可以不進(jìn)行細(xì)微調(diào)節(jié)而使用。另夕卜，由于能夠使用單一的酶實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR，因此，不需要在各自的管(tube)內(nèi)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR的兩步操作，可以利用一步操作實(shí)施RT-PCR。本發(fā)明中使用的引物，只要以對目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的方式進(jìn)行設(shè)計(jì)，就沒有特別的限制，使用通常的方法設(shè)計(jì)即可。本發(fā)明中使用的優(yōu)選的脫氧核糖核苷酸的組合為脫氧腺苷三磷酸(dATP)、脫氧鳥苷三磷酸(dGTP)、脫氧胞苷三磷酸(dCTP)、以及脫氧胸苷三磷酸(dTTP)的組合，或者，脫氧腺苷三磷酸(dATP)、脫氧鳥苷三磷酸(dGTP)、脫氧胞苷三磷酸(dCTP)、以及脫氧尿苷三磷酸(dUTP)的組合，還可以使用ddNTP或修飾核苷等。本發(fā)明的聚合酶由于能夠攝取脫氧尿苷三磷酸，因此，在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選實(shí)施UNG法，還能夠防止擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。本發(fā)明的方法中使用的用于檢測所擴(kuò)增的核酸的核酸探針，例如可以使用特開2001-286300號公報(bào)以及特開2002-119291號公報(bào)等中記載的末端部利用熒光染料標(biāo)記的淬滅探針。核酸探針優(yōu)選與未與靶序列雜交時(shí)比較，與靶序列雜交時(shí)熒光染料的熒光減少或者增加。本發(fā)明中的核酸探針優(yōu)選為未雜交時(shí)熒光染料的熒光發(fā)光，雜交時(shí)熒光染料的·
作為含有進(jìn)行核酸擴(kuò)增時(shí)的模板核酸的試樣，含有核酸即可，沒有特別的限制，例如為血液、口腔粘膜懸濁液、指甲或毛發(fā)等體細(xì)胞；生殖細(xì)胞、乳汁、腹水液、石蠟包埋組織、胃液、胃灌洗液、腹膜液、羊水、細(xì)胞培養(yǎng)等任意的來自于或能夠來自于生物學(xué)起源的試樣。作為模板的核酸，可以從該起源得到后直接使用，或者為使該樣品的特性改變而進(jìn)行前處理后使用。另外，一般試樣中的核酸為DNA或者RNA，可以為單鏈或者雙鏈。本發(fā)明的方法中的上述工序(a)可以通過將規(guī)定量的上述聚合酶、引物、以及底物核苷酸、根據(jù)需要的核酸探針、與含有核酸的試樣一起添加到反應(yīng)液中并進(jìn)行混合而進(jìn)行。本發(fā)明的方法中的上述工序(b)可以通過通常的核酸擴(kuò)增方法、例如PCR、RT_PCR等進(jìn)行。另外，通過ICAN法可以使用DNA-RNA嵌合引物、RNase H、上述聚合酶對靶基因進(jìn)行擴(kuò)增。另外，還可以通過LAMP法使用內(nèi)引物、外引物、環(huán)狀引物、上述聚合酶對靶基因進(jìn)行擴(kuò)增。進(jìn)行擴(kuò)增核酸的檢測時(shí)，優(yōu)選在核酸探針的存在下進(jìn)行擴(kuò)增。即，進(jìn)行上述工序(C)時(shí)，優(yōu)選在工序(a)中增加探針。本發(fā)明的方法中的上述工序(b)可以通過使用本發(fā)明的聚合酶，優(yōu)選在20個堿基以上/秒的條件下對核酸進(jìn)行擴(kuò)增。本發(fā)明的方法中的上述工序(C)優(yōu)選為使用所述探針進(jìn)行熔解曲線分析、檢測擴(kuò)增區(qū)域的工序。在本發(fā)明的方法中，除使用本發(fā)明的聚合酶以外，可以根據(jù)通常的核酸擴(kuò)增以及熔解曲線分析(Tm解析)的方法進(jìn)行。更優(yōu)選工序(C)為對所擴(kuò)增的核酸，通過使用利用熒光染料標(biāo)記后的核酸探針來測定熒光染料的熒光，從而進(jìn)行熔解曲線分析，并根據(jù)熔解曲線分析的結(jié)果來檢測擴(kuò)增區(qū)域的工序。本發(fā)明的方法中的工序(C)可以根據(jù)通常的熔解曲線分析(Tm解析)的方法來進(jìn)行?；蛘?，本發(fā)明的方法中的工序(C)還可以通過擴(kuò)增反應(yīng)中蓄積的PCR產(chǎn)物的檢測來進(jìn)行。具體地，工序(C)可以是使用依賴擴(kuò)增產(chǎn)物的量而熒光變化的體系，通過熒光的測定來實(shí)時(shí)進(jìn)行PCR中的擴(kuò)增產(chǎn)物的定量，根據(jù)其結(jié)果來對樣品中的DNA進(jìn)行定量的定量PCR，還可以根據(jù)公知的方法進(jìn)行。作為這樣的方法的例子，可列舉出使用與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的熒光標(biāo)記的探針的方法，作為熒光標(biāo)記的探針，可以使用所述探針。本發(fā)明的方法中的工序(c)，除使用所述探針以外，可以根據(jù)通過測定熒光染料的熒光而進(jìn)行的實(shí)時(shí)PCR法來進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易根據(jù)所使用的探針來調(diào)節(jié)擴(kuò)增的反應(yīng)條件等。此外，在本發(fā)明的方法中，所述工序(C)還可以與所述工序(b)同時(shí)進(jìn)行。本發(fā)明的方法中的工序(C)，由于只在核酸的擴(kuò)增后解析探針的Tm或者檢測作為熒光值的PCR產(chǎn)物的量，因此，反應(yīng)結(jié)束后沒必要處理擴(kuò)增產(chǎn)物。因而，不用擔(dān)心擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。另外，由于可以利用與擴(kuò)增所需的儀器相同的儀器進(jìn)行檢測，因此，甚至沒必要移動容器?！?>本發(fā)明試劑盒本發(fā)明試劑盒為用于本發(fā)明的檢測方法的試劑盒。S卩，本發(fā)明的試劑盒用于對試樣中所含的核酸進(jìn)行擴(kuò)增并檢測，含有用于對任意的核酸區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的引物、聚合酶、作為核酸擴(kuò)增底物的核苷酸、以及用于對所擴(kuò)增的核酸進(jìn)行檢測的探針，其特征在于，該聚合酶具有由序列編號I構(gòu)成的氨基酸序列或者與序列編號I同源的氨基酸序列，并且對應(yīng)于該氨基酸序列的653位的氨基酸殘基被谷氨酸取代。另外，本發(fā)明的試劑盒還可以只用于核酸的擴(kuò)增。S卩，本發(fā)明的試劑盒用于對試樣中所含的核酸進(jìn)行擴(kuò)增，含有用于對任意的核酸區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的引物、聚合酶、以及作為核酸擴(kuò)增底物的核苷酸，其特征在于，該聚合酶具有由序列編號I構(gòu)成的氨基酸序列或者與序列編號I同源的氨基酸序列，并且對應(yīng)于該氨基酸序列的653位的氨基酸殘基被谷氨酸取代。關(guān)于引物、聚合酶、底物核苷酸、以及探針，關(guān)于本發(fā)明的方法，如上所述。在本發(fā)明的試劑盒中，底物核苷酸優(yōu)選含有脫氧尿苷三磷酸。本發(fā)明的試劑盒，除引物、聚合酶、底物核苷酸、以及探針以外，還可以含有進(jìn)行本發(fā)明的檢測方法中的核酸擴(kuò)增所必要的試劑類。在本發(fā)明的試劑盒中，引物、聚合酶、底物核苷酸、探針以及其它的試劑類可以單獨(dú)容納，也可以將它們的一部分形成混合物。以下通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行具體說明。實(shí)施例實(shí)施例I (檢測NAT2基因時(shí))為了能夠?qū)?N-乙?；D(zhuǎn)移酶 2 (N-acetyltransferase 2，NAT2)的 NAT2*5 的基因的位點(diǎn)(640bp)進(jìn)行擴(kuò)增，使用表I中所示的引物以及探針。這樣的引物以及探針記載在 W02008/066161 中。表I
權(quán)利要求
1.一種對試樣中所含的核酸進(jìn)行擴(kuò)增的方法，該方法包括 (a)將用于對該核酸的任意區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的引物、聚合酶、以及作為核酸擴(kuò)增底物的核苷酸，與含有該核酸的試樣混合的工序；以及 (b)利用聚合酶反應(yīng)對該區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的工序， 其中，該聚合酶具有由序列編號I構(gòu)成的氨基酸序列或者與序列編號I同源的氨基酸序列，并且對應(yīng)于該氨基酸序列的653位的氨基酸殘基被谷氨酸取代。
2.—種對試樣中所含的核酸進(jìn)行擴(kuò)增并檢測的方法，該方法包括 (a)將用于對該核酸的任意區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的引物、聚合酶、作為核酸擴(kuò)增底物的核苷酸、以及用于檢測所擴(kuò)增的核酸的探針，與含有該核酸的試樣混合的工序； (b)利用聚合酶反應(yīng)對該區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的工序；以及 (C)使用該探針檢測該區(qū)域的工序， 其中，該聚合酶具有由序列編號I構(gòu)成的氨基酸序列或者與序列編號I同源的氨基酸序列，并且對應(yīng)于該氨基酸序列的653位的氨基酸殘基被谷氨酸取代。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，所述(c)的檢測工序通過擴(kuò)增反應(yīng)中蓄積的PCR產(chǎn)物的檢測或者熔解曲線分析而進(jìn)行。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述進(jìn)行擴(kuò)增的核酸為DNA或RNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述(b)的擴(kuò)增工序?yàn)镻CR或RT-PCR。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述作為核酸擴(kuò)增底物的核苷酸含有脫氧尿苷三磷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至6中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述聚合酶是，為使5’一 3’核酸外切酶活性缺失或降低而使N末端的氨基酸缺失的改性Tth聚合酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述聚合酶為序列編號I的氨基酸序列中的第I 77位的氨基酸缺失的改性Tth聚合酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述聚合酶為序列編號I的氨基酸序列中的第I 291位的氨基酸缺失的改性Tth聚合酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求I至9中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述(b)工序?yàn)樵?0個堿基以上/秒的條件下對核酸進(jìn)行擴(kuò)增的工序。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述(b)工序?yàn)閿U(kuò)增600個堿基以上的堿基長度的工序。
12.—種試劑盒，其用于對試樣中所含的核酸進(jìn)行擴(kuò)增，該試劑盒含有用于對任意的核酸區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的引物、聚合酶、以及作為核酸擴(kuò)增底物的核苷酸，其中， 該聚合酶具有由序列編號I構(gòu)成的氨基酸序列或者與序列編號I同源的氨基酸序列，并且對應(yīng)于該氨基酸序列的653位的氨基酸殘基被谷氨酸取代。
13.—種試劑盒，其用于對試樣中所含的核酸進(jìn)行擴(kuò)增并檢測，該試劑盒含有用于對任意的核酸區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的引物、聚合酶、作為核酸擴(kuò)增底物的核苷酸、以及對所擴(kuò)增的核酸進(jìn)行檢測的探針，其中， 該聚合酶具有由序列編號I構(gòu)成的氨基酸序列或者與序列編號I同源的氨基酸序列，并且對應(yīng)于該氨基酸序列的653位的氨基酸殘基被谷氨酸取代。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的試劑盒，其中，所述作為核酸擴(kuò)增底物的核苷酸含有脫氧尿苷三磷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及核酸的擴(kuò)增檢測方法以及試劑盒。具體地，本發(fā)明提供了一種對試樣中所含的核酸進(jìn)行擴(kuò)增的方法，其中，該方法包括(a)將用于對該核酸的任意區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的引物、聚合酶、以及作為核酸擴(kuò)增底物的核苷酸，與含有該核酸的試樣混合的工序；以及(b)利用聚合酶反應(yīng)對該區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的工序。其中，該聚合酶具有由序列編號1構(gòu)成的氨基酸序列或者與序列編號1同源的氨基酸序列，對應(yīng)于該氨基酸序列的653位的氨基酸殘基被谷氨酸取代。
文檔編號C12N15/10GK102876662SQ201210244770
公開日2013年1月16日 申請日期2012年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月12日
發(fā)明者細(xì)見敏也, 平井光春 申請人:愛科來株式會社