專利名稱：一種調(diào)控火鶴體細(xì)胞胚胎發(fā)生的SERK編碼基因cDNA的構(gòu)建方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生，尤其是一種調(diào)控火鶴體細(xì)胞胚胎發(fā)生的SERK編碼基因cDNA的構(gòu)建方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
火鶴(Anthurium andraeanum)又名紅掌、安祖花，為天南星科(Araceae)花燭屬(Anthurium)植物,原產(chǎn)南美洲熱帶雨林中。其花型獨(dú)特，佛焰荀明艷華麗，色彩豐富，花期長，葉形別致，觀葉觀花俱佳，是現(xiàn)在居室不可多得的裝飾珍品，世界花卉貿(mào)易中，紅掌是僅次于熱帶蘭的第二大熱帶花卉。我國在20世紀(jì)70年代引入栽培，目前已成為市場中名貴的切花品種。 火鶴常用分株繁殖，速度很慢，偶爾也用扦插等方法進(jìn)行繁殖，但成活率很低，而用播種繁殖必須經(jīng)過人工授粉才能獲得種子，耗費(fèi)人力，而且種子繁殖有較大變異，所以用常規(guī)方法難以擴(kuò)大生產(chǎn)。目前，花燭組培快繁主要是通過器官發(fā)生途徑由不同外植體誘導(dǎo)形成愈傷組織，然后由愈傷組織誘導(dǎo)不定芽再生，進(jìn)行繼代增殖。通過器官發(fā)生途徑獲得再生植株并進(jìn)行快速繁殖已成為一種較有效的繁殖方式，但仍存在外植體誘導(dǎo)愈傷組織周期較長，、無菌苗長期連續(xù)增殖極易發(fā)生退化和變異、接種工序中切割材料較耗人工等缺點。而通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑再生植株在繁殖率、遺傳穩(wěn)定性等方面均具有許多優(yōu)勢，例如繼代培養(yǎng)中節(jié)省了人工切割材料的時間、一次性產(chǎn)生的體胚數(shù)量多，繁殖速度明顯比器官發(fā)生途徑快，遺傳性穩(wěn)定、不易發(fā)生體細(xì)胞變異，還可以用于遺傳改良等。Geie T.在1982年最先報道了通過培養(yǎng)花燭屬火鶴的肉穗花序獲得胚狀體，但胚狀體未能發(fā)育成苗。1992年Kuehnle A. R.等首次從花燭的葉片誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚，他們用4種花燭雜交種幼苗的葉片在暗中培養(yǎng)一個月發(fā)現(xiàn)有半透明的胚胎發(fā)生。1997年Musa等研究發(fā)現(xiàn)，花燭屬植物火鶴也存在體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑。2002年，MBalachandran等在第26屆國際園藝學(xué)會會議上報道了花燭品種‘DragonTongue’等不同外植體誘導(dǎo)體細(xì)胞胚獲得成功，并用于遺傳轉(zhuǎn)化研究。2004年Duong Tan Nhut等通過實驗獲得花燭品種‘Tropical ’的體細(xì)胞胚，并進(jìn)行了人工種子萌發(fā)條件的研究。2006年Sompong Te-chato等研究了品種、培養(yǎng)基、外植體類型和刻傷對安祖花屬植物器官再生和體細(xì)胞胚再生的影響。2008年Nydiadel Rivero-Bautista等研究了花燭屬植物試管苗葉片通過間接途徑誘導(dǎo)胚性愈傷、體細(xì)胞胚的分化和萌發(fā)的最適激素濃度。國內(nèi)的研究則是從2006年才開始的，辛偉杰等以花燭盆花品種無菌苗葉片、葉柄、根段為外植體，對花燭體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生進(jìn)行了研究，建立了花燭體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系，并研究了相關(guān)的生理生化特征。2010年，許傳營等以花燭品種Amigo為材料，研究了懸浮培養(yǎng)條件下花燭體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中相關(guān)生理生化特征。他還研究了花燭體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程各階段蛋白質(zhì)組成變化，發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織階段比體細(xì)胞胚胎形成階段蛋白表達(dá)量高且多出3條特異蛋白質(zhì)譜帶。同年，劉雪蓮等以火鶴亞利桑娜幼嫩葉片為外植體，篩選出了最優(yōu)的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基和胚狀體誘導(dǎo)及成苗培養(yǎng)基。大量研究表明，體胚中絕大部分基因，如BBM (ΒΑΒΥΒ00Μ)、WUS (WUSChEL), LEC2(LEAFYC0TYLED0N2)和 AGL15 (AGAM0US_Likel5)等基因(Schmidt et al. , 1997 ；Thomas,1993)具有提高體胚發(fā)生率或維持體胚發(fā)生的作用，但它們是在體胚發(fā)生后才起作用的，并不是在體細(xì)胞從營養(yǎng)生長向胚性生長的轉(zhuǎn)化中起作用，而唯一例外的是SERK基因。SERK (Somatic Embryogenesis Receptor-like Kinase)基因廣泛地存在于單子葉和雙子葉植物中，在不同的植物中存在著特定的表達(dá)方式。已經(jīng)報道的除少數(shù)SERK基因的表達(dá)在體細(xì)胞胚內(nèi)檢測不到外，其他已經(jīng)報導(dǎo)功能的SERK基因一般都參與了體細(xì)胞胚的發(fā)生，這表明SERK基因的表達(dá)與體細(xì)胞胚的發(fā)生密切相關(guān)。另外，有些研究表明SERK基因不僅參與促進(jìn)體細(xì)胞胚的發(fā)生，還標(biāo)志著體細(xì)胞從營養(yǎng)生長向胚性生長轉(zhuǎn)變，預(yù)示著SERK基因可能會被發(fā)展成為體細(xì)胞胚發(fā)生的標(biāo)記基因。分離并克隆火鶴體胚SERK基因cDNA全長序列，并從轉(zhuǎn)錄水平對不同培養(yǎng)階段的各個時期SERK基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，是 闡明SERK基因調(diào)控火鶴體細(xì)胞胚胎發(fā)生機(jī)制的重要步驟；縮短外植體誘導(dǎo)愈傷組織周期、減少接種工序中切割材料的人工耗費(fèi)、高通量快繁火鶴種苗、提供遺傳性穩(wěn)定且不易發(fā)生體細(xì)胞變異的植株、提供高生活力種苗是繁育火鶴必須要解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種繁殖速度快、遺傳穩(wěn)定的調(diào)控火鶴體細(xì)胞胚胎發(fā)生的SERK編碼基因cDNA及其構(gòu)建方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一種調(diào)控火鶴體細(xì)胞胚胎發(fā)生的SERK編碼基因，該編碼基因cDNA序列為AGGTGGTGAG GGGAGAAGAT GGCGCCGGCG GCGGCGCCGT GGCTGCTCTG CATGATCGTG60CTGCTCCATC CGATCGCGAG GATTCTCGCC AACGTGGAAG GTGATGCTTT GAATAGTCTA120AAAACTAATT TACATGATCC TAGTAATGTT CTTCAGAGTT GGGATCCAAC CCTTGTGAAT180CCATGCACTT GGTTCCATGT AACGTGCAAC AATGACAATA ATGTTATAAG AGTTGACCTT240GGAAATGCAG CATTATCTGG TTCTTTGGTC CCACAGCTTG GTCTGCTCAA AAGTTTGCAA300TACCTGGAAC TTTATAGCAA CAATATAAGT GGGGAAATTC CTATTGAACT TGGGAATTTG360TCAAGCTTGG TGAGCTTGGA TCTCTATTTG AACAAGTTCA CTGGCCCAAT TCCTGGCACC420CTGGAAAAGC TGGCAAAGCT GCGTTTCCTC CGGCTCAACA ACAACAGCTT GTCGGGACCA480ATTCCCATGT CTCTAACCAA CATTACTACA CTGCAAGTTC TGGATCTGTC TAACAACGGC540TTATCAGGAG TAGTTCCATC AAATGGTTCC TTTTCGCTAT TCACCCCAAT CAGTTTTAGT600AACAATCCTT TATTATGTGG CCCGGGTGCA GCCAAGCCTT GTCCTGGATC TCCTCCATTT660TCTCCACCAC CACTTGTTCC ACAGGCTACA GTCCCCTCTC CAGGAAGTAG TGCCTCCAGC720ACAGGTGCAA TTGCCGGTGG AGTGGCTGCA GGTGCTGCTT TGCTTTTTGC TGCACCTGCA780ATCGGGTTTG CATGGTGGCG GCGACGGAAA CCACAAGAAA ATTTCTTTGA TGTACCTGCT840GAAGAGGATC CAGAGGTTCA TCTGGGGCAG CTTAAAAGAT TTTCTCTGCG AGAATTACAA900GTTGCAACTG ATAGCTTTAG TAATAAAAAC ATCTTGGGAA GAGGTGGATT TGGCAAAGTC960TACAAGGGAC GGCTGGCAGA CGGTTCACTT GTGGCAGTAA AGAGGCTAAA GGAAGAGCGC1020ACACCTGGTG GAGAGCTCCA GTTTCAGACG GAGGTAGAGA TGATTAGCAT GGCTGTGCAC1080
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權(quán)利要求
1.一種調(diào)控火鶴體細(xì)胞胚胎發(fā)生的SERK編碼基因cDNA，其特征在于，該編碼基因cDNA序列為 AGGTGGTGAG GGGAGAAGAT GGCGCCGGCG GCGGCGCCGT GGCTGCTCTG CATGATCGTG60 CTGCTCCATC CGATCGCGAG GATTCTCGCC AACGTGGAAG GTGATGCTTT GAATAGTCTA120 AAAACTAATT TACATGATCC TAGTAATGTT CTTCAGAGTT GGGATCCAAC CCTTGTGAAT180 CCATGCACTT GGTTCCATGT AACGTGCAAC AATGACAATA ATGTTATAAG AGTTGACCTT240 GGAAATGCAG CATTATCTGG TTCTTTGGTC CCACAGCTTG GTCTGCTCAA AAGTTTGCAA300 TACCTGGAAC TTTATAGCAA CAATATAAGT GGGGAAATTC CTATTGAACT TGGGAATTTG360 TCAAGCTTGG TGAGCTTGGA TCTCTATTTG AACAAGTTCA CTGGCCCAAT TCCTGGCACC420 CTGGAAAAGC TGGCAAAGCT GCGTTTCCTC CGGCTCAACA ACAACAGCTT GTCGGGACCA480 ATTCCCATGT CTCTAACCAA CATTACTACA CTGCAAGTTC TGGATCTGTC TAACAACGGC540 TTATCAGGAG TAGTTCCATC AAATGGTTCC TTTTCGCTAT TCACCCCAAT CAGTTTTAGT600 AACAATCCTT TATTATGTGG CCCGGGTGCA GCCAAGCCTT GTCCTGGATC TCCTCCATTT660 TCTCCACCAC CACTTGTTCC ACAGGCTACA GTCCCCTCTC CAGGAAGTAG TGCCTCCAGC720 ACAGGTGCAA TTGCCGGTGG AGTGGCTGCA GGTGCTGCTT TGCTTTTTGC TGCACCTGCA780 ATCGGGTTTG CATGGTGGCG GCGACGGAAA CCACAAGAAA ATTTCTTTGA TGTACCTGCT840 GAAGAGGATC CAGAGGTTCA TCTGGGGCAG CTTAAAAGAT TTTCTCTGCG AGAATTACAA900 GTTGCAACTG ATAGCTTTAG TAATAAAAAC ATCTTGGGAA GAGGTGGATT TGGCAAAGTC960 TACAAGGGAC GGCTGGCAGA CGGTTCACTT GTGGCAGTAA AGAGGCTAAA GGAAGAGCGC1020 ACACCTGGTG GAGAGCTCCA GTTTCAGACG GAGGTAGAGA TGATTAGCAT GGCTGTGCAC1080 CGAAACCTCC TTCGCCTTCG TGGATTTTGC ATGACACCCA CTGAAAGGTT GCTCGTGTAT1140 CCTTACATGA AAAATGGAAG TGTTGCCTCA CGTTTAAGAG AGCGTTCATC GACAGAGCCA1200 CCACTTGATT GGTCAACTAG AAAAGGAGTT GCGTTGGGAT CTGCAAGAGG GCTATCTTAC1260 TTACATGATC ACTGTGACCC AAAGATTATT CACCGTGATG TGAAAGCTGC AAATATATTA1320 CTGGATGAAG AGTTTGAAGC AGTTGTAGGA GATTTTGGAT TGGCTAAGCT CATGGATTAC1380 AAAGATACCC ATGTGACGAC TGCTGTCCGT GGCACCATTG GGCATATAGC TCCAGAGTAT1440 CTTTCCACAG GGAAATCCTC AGAGAAGACA GATGTTTTTG GGTATGGGAT TACACTTCTG1500 GAGCTCATTA CTGGACAGAG GGCCTTTGAT CTTGCTAGGC TTGCCAACGA TGATGATGTC1560 ATGTTGCTTG ACTGGGTGAA AGGACTCTTA AAGGAGAAAA AGCTGGACAT GCTGGTAGAT1620 CCTGATCTAC CAAGCTATTT GGAGGCTGAA GTGGAGCAAC TTATCCGAGT TGCCCTGCTC1680 TGTACTCAAG GCTCACCAAC GGAACGTCCC AAGATGTCAG AGGTGGTGAG GATGCAGGAA1740 GGTGACGGCC TCGCAGAGAG ATGGGAAGAA TGGCAGAGGG TTGAAGTTCG ACATGAGGCA1800 GAGCTTGCAC CACACCGCAA CTCTGAATGG AATATAGAAG ACTCCACGTA CAATCTCCCT1860 GCAGTCGAAT TATCTGGACC AAGGTGATCT AACCAAAAAT ATCACCTCTG AAGCGTGAAA1920 GGAAATTGTT TACCCCTCAT TTTTATCCGA ATCGTCGACC TGCAGGCATG CAAGCTGCAC1980 TGCCGTCGTACTCA1994 ； 其中，起始密碼子位于19bp處，終止密碼子位于1888bp處，共編碼622個氨基酸。
2.一種調(diào)控火鶴體細(xì)胞胚胎發(fā)生的SERK編碼基因cDNA的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法包括a.提取火鶴胚性愈傷組織總RNA； b.cDNA第一鏈的合成； c.火鶴SERK基因保守片段的擴(kuò)增，引物序列為
3.一種如權(quán)利要求I所述的調(diào)控火鶴體細(xì)胞胚胎發(fā)生的SERK編碼基因cDNA在火鶴快繁中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種調(diào)控火鶴體細(xì)胞胚胎發(fā)生的SERK編碼基因cDNA的構(gòu)建方法及應(yīng)用，編碼基因cDNA序列起始密碼子位于19bp處，終止密碼子位于1888bp處，共編碼622個氨基酸。以火鶴成熟植株剛展開幼嫩葉片為外植體，通過啟動培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、發(fā)育培養(yǎng)三個階段的培養(yǎng)從間接體胚發(fā)生途徑成功獲得再生小植株；外植體誘導(dǎo)愈傷組織周期較短，植株成活率高、繁殖速度快、遺傳性穩(wěn)定、不易發(fā)生細(xì)胞變異；分離并克隆火鶴SERK基因cDNA全長序列，并從轉(zhuǎn)錄水平對不同培養(yǎng)階段的各個時期SERK基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，加深對火鶴體胚發(fā)生機(jī)制的理解，揭示了調(diào)控火鶴體細(xì)胞胚胎發(fā)生的SERK編碼基因cDNA及其構(gòu)建方法，為SERK基因在體細(xì)胞胚性轉(zhuǎn)化中的作用提供很高的參考價值。
文檔編號C12N15/10GK102776214SQ20121019554
公開日2012年11月14日 申請日期2012年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月13日
發(fā)明者崔金騰, 張克中, 張睿鸝, 王愛香 申請人:北京農(nóng)學(xué)院