專利名稱：基于多重pcr的水中13種病原微生物同步快速檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬于環(huán)境科學與工程、環(huán)境保護技術領域。
背景技術：
現階段國內外常用于檢測和鑒定致病微生物的方法主要有傳統(tǒng)生化鑒定法、免疫學檢測技術、常規(guī)PCR等一些簡單的分子生物學和免疫學方法。傳統(tǒng)生化鑒定法(如分離培養(yǎng)、生化鑒定等)應用最廣泛，是《食品衛(wèi)生微生物學檢驗(GB/T 4789-2003 )等國標檢測程序，該方法能夠得到樣品中細菌數量和特性等方面的定性及定量結果，由于操作簡單、經濟且準確性好而被廣泛采用，但是大都需要經過前增菌、增菌、選擇性平板分離、生物化學試驗和血清學分型鑒定4個步驟，整個過程通常需要3^7天，檢測周期長，并且要求所要檢測的細菌增殖為可見菌落，另外，培養(yǎng)基制備、細菌培 養(yǎng)、菌落計數和生化指標的檢測都增加了實驗室的工作量，并且檢測靈敏度低，不能實現有效的實時快速監(jiān)測和防控。免疫學檢測技術主要是采用酶聯免疫分析(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay, ELISA), ELISA是把抗原抗體免疫反應的特異性和酶的高效催化作用有機地結合起來的一種檢測技術，既可測抗原，也可測抗體，可進行定性和定量測定，基本原理是預先結合在固相載體上的抗體或抗原分子與樣品中的抗原或抗體分子在一定條件下進行免疫學反應。該方法可檢測沙門氏菌、軍團菌、大腸桿菌0157等致病微生物。免疫學檢測技術簡單、方便，較傳統(tǒng)檢測技術迅速，但存在交叉反應比較嚴重、假陽性多、靈敏度偏低等不足之處。聚合酶鏈式反應(Ploymerase Chain Reaction, PCR)是一種體外核酸擴增技術，其基本原理是在體外適宜的條件(如鎂離子濃度)和Taq DNA聚合酶的作用下，利用游離的脫氧核糖核苷酸(dNTP)，以目標基因組DNA上正、反相兩引物間的特定的雙鏈DNA片段(或稱靶DNA)進行高效擴增，故又稱基因體外擴增法。一般的PCR需要經過預變性，變性、退火、延伸的25 35次循環(huán)，可將靶DNA序列擴增近百萬倍，經瓊脂糖或聚丙烯酰氨凝膠電泳和染色劑如溴化乙錠(EB)染色后在紫外光下觀測到相應的條帶。常規(guī)PCR雖為一種特異靈敏、簡便快速的檢測技術，但該方法需要較長時間的樣品純化處理過程，且一旦有極少量外源性DNA污染，就可能出現假陽性結果；多對引物同時擴增，各種實驗條件控制不當，很容易導致擴增失敗或非特異性產物；引物的設計及靶序列的選擇不當等都可能降低其靈敏度和特異性；同時，一次一般只能檢測一種致病微生物。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對現有檢測和鑒定致病微生物方法存在的以上不足，提出一種基于多重PCR的水中13種病原微生物同步快速檢測方法。本發(fā)明的技術方案如下
一種基于多重PCR的水中13種病原微生物同步快速檢測方法，采用多重PCR —次性同時擴增13種致病微生物的特異性基因片段大腸埃希菌、腸出血性大腸桿菌0157:H7、嗜肺軍團菌、腸炎沙門菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌、幽門螺旋桿菌、結核分枝桿菌、肺炎克雷伯菌、霍亂弧菌、炭疽桿菌和鼠疫耶爾森菌，再通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。所述方法具體包括以下步驟
(1)水樣處理
采集水樣，用無菌塑料瓶封裝，室溫靜置，取上清液加入濃縮儀進行濃縮集菌(濃縮儀采用Milliflex Plus濃縮儀)，然后抽干濾膜，取出放入離心管內，剪成細末狀；(2)DNA模板提取
采用E. Z. N. A. Bacterial DNA Kit (D3350-01)試劑盒或者與之有同等作用的其他商業(yè)化DNA提取試劑盒進行核酸提取，取IOuL樣本DNA進行下一步程序；
(3)多重PCR擴增目的片段
采用15 ii L的PCR體系，包括10 X PCR Taq酶緩沖液I. 0 — 2. Oii L，濃度為2. 5 mmol/L dNTP 0. I - 0.3 UL,濃度為10 - 20 u mo I/L的各種(即13種病原微生物)引物混合液0. 4 - 0. 8 u L, 50 X T-Taq DNA 聚合酶 0. I — 0. 5 y L，DNA 模板 0. 5 — I. 5 y L，雙蒸水補至15u L ；
PCR循環(huán)參數95°C預變性3 min，接著作30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94°C變性30s，68°C退火并延伸30s ;循環(huán)結束后68°C延伸5 min ;4°C保存?zhèn)溆茫?br> (4)電泳檢測
對三組多重PCR反應產物進行電泳觀察，第一組產物的電泳圖中含有5個不同長度的產物片段，分別為志賀菌113bp ;金黃色葡萄球菌283bp ;腸出血性大腸桿菌0157:H7 366bp ;大腸埃希菌471bp ;腸炎沙門氏菌679bp ;第二組產物的電泳圖中含有4個不同長度的產物片段，分別為單核細胞增生李斯特菌155bp ;嗜肺軍團菌252bp，肺炎克雷伯菌319bp ;幽門螺旋桿菌364bp ;第三組產物的電泳圖中含有5個不同長度的產物片段，分別為結合分枝桿菌135bp ;鼠疫耶爾森菌184bp ;炭疽芽孢桿菌275bp ;霍亂弧菌465bp ；16S:370bp。其中16S做為檢測結果的陽性質控。發(fā)明的優(yōu)點及積極效果
本檢測方法采用的多重PCR技術，具有較強的特異性、靈敏度和實際檢測的適用性，本方法多重基因組DNA檢測靈敏度為2 X 10_2 ng/yL。用常規(guī)的方法檢測上述13種致病菌，需要的時間至少為兩天，而對于李斯特菌的常規(guī)檢測方法全過程至少需要四至七天，本檢測方法可將整個檢測時間縮短至8小時以內，比現有的細菌學診斷更快速、簡便、經濟和實用，并且同時檢測多種致病菌。通常水體中的致病微生物含量相對較少，尤其是水源水體，有時部分致病微生物處于亞致死狀態(tài)，這就需要一個前增菌過程以達到系統(tǒng)的檢測限。本檢測方法采用Milliflex Plus微生物過濾系統(tǒng)對水樣進彳丁如期濃縮集囷后，就可以快速地完成微量致病微生物的快速檢測。通過對水樣的濃縮集菌，多重PCR對致病菌的檢出率達到103cfu/mL，較原來提高了 100倍。因此，本檢測方法具備重復性好、穩(wěn)定性強、靈敏度及特異性高、操作簡單、高通量及快速檢測等諸多優(yōu)點，為水體致病菌檢測技術的發(fā)展提供了良好的理論和實踐基礎。


圖I同時進行13中病原微生物檢測的電泳 圖2腸炎沙門氏菌菌液梯度稀釋提取DNA的多重PCR結果；
圖3腸炎沙門氏菌菌液梯度稀釋，濃縮富集后提取DNA的多重PCR結果。
具體實施例方式I、檢測對象
本方法主要針對水中可能存在的和突發(fā)公共事件發(fā)生時可能進入水中的13種致病微生物，分別是大腸埃希菌、腸出血性大腸桿菌0157:H7、嗜肺軍團菌、腸炎沙門菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌、幽門螺旋桿菌、結核分枝桿菌、肺炎克雷伯菌、霍亂弧菌、炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌。2、檢測過程
2.I水樣處理
采集適量水樣，用無菌塑料瓶封裝，當日送往實驗室。室溫靜置Ihlh后，取上清液加AMilliflex Plus微生物過濾系統(tǒng)濾清漏斗裝置的漏斗內。開啟濃縮儀進行濃縮集菌，時間3分鐘。濃縮完成后，抽干濾膜，將整個漏斗開口放入4°C冰柜，30mirT60min后待濾膜表面完全干燥后取出，用鑷子將含有細菌的濾膜從濃縮儀濾瓶內取下，放入1.5mL離心管內，用已經滅菌過的手術剪剪成細末狀。采用E. Z. N. A. Bacterial DNA Kit (D3350-01)試劑盒進行核酸提取，按試劑盒說明書所述的試劑量的3倍進行加樣和提取，DNA最后溶解于50uL ddH20中。取每份水樣中提取的核酸IOyL分別進行1%瓊脂糖電泳，觀察核酸提取質量；取IOuL樣本DNA進行下一步程序。2. 2多重PCR擴增目的片段
采用15 ii L的PCR體系，包括10XPCR Taq酶緩沖液I. 5 ii L，濃度為2. 5 mmol/L dNTP
0.L，濃度為20iimol/L的各種(13種致病微生物)引物混合液0. 6 y L (每對引物各加入
0.6u L),50 XT-Taq DNA 聚合酶 0. 2 y L，DNA 模板 I. 0 y L，ddH20 11. 5u L0 PCR 循環(huán)參數:95°C預變性3 min,接著作30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94°C變性30s，68°C退火并延伸30s ;循環(huán)結束后68°C延伸5 min ;4°C保存?zhèn)溆谩?.3樣本檢測
所有多重PCR反應產物都要經過3%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。從每個多重PCR樣品中取出2iiL PCR擴增產物，加入5 ii L 2 X Loading Buffer上樣緩沖液混合均勻，用I X TAE作為緩沖溶液，150 V電壓下電泳20 min，通過紫外成像系統(tǒng)拍攝電泳圖，參見圖1，從左至右
1.金葡菌，2.0157菌,3.志賀菌,4.大腸桿菌,5.沙門菌,6.第I組多重,7. Marker, 8.軍團菌，9.克雷伯菌，10.李斯特菌，11.幽門菌，12.第2組多重，13.結核，14.霍亂，15.炭疽，16.鼠疫，17. 16S，18.第3組多重，19. Marker。根據電泳圖上產物條帶大小，判斷樣本中所含有的微生物種類。3實施例
以腸炎沙門氏菌為例，標準菌株培養(yǎng)液經10倍梯度稀釋后，提取DNA進行多重PCR，所 得結果如圖2所示。電泳結果顯示，在I泳道至5泳道均出現明顯的條帶，6泳道以后沒有條帶出現，說明該方法可檢測細菌的量為IO5 cfu/mL。圖中每個泳道的細菌量分別為A: IO9cfu/mL; B: IO8 cfu/mL; C: IO7 cfu/mL; D: IO6 cfu/mL; E: IO5 cfu/mL; F: IO4 cfu/mL; G: IO3 cfu/mL; H: IO2 cfu/mL; I: water; M: Marker。為提高檢測水平，通過Milliflex Plus濃縮儀對稀釋后的菌液進行濃縮富集后再提取DNA,試驗結果見圖3。由電泳圖可以看出，使用Milliflex Plus濃縮儀濃縮集菌后，可以顯著提高多重PCR的檢測水平，可檢測腸炎沙門氏菌的量達到IO3 cfu/mL。圖中每個泳道的菌液濃度分別為M: Marker ;A: IO7 cfu/mL; B: IO6 cfu/mL; C: IO5 cfu/mL; D:IO4 cfu/mL; E: IO3 cfu/mL; F: IO2 cfu/mL。本發(fā)明中，13種細菌的引物和探針序列見《水體中致病菌快速檢測的 基因芯片技術研究》(解放軍醫(yī)學雜志，2010年第9期，1117-1120)
用于檢測13種細菌的引物和探針序列
權利要求
1.一種基于多重PCR的水中13種病原微生物同步快速檢測方法，所述方法是采用多重PCR同時擴增13種病原微生物的特異性基因片段大腸埃希菌、腸出血性大腸桿菌0157:H7、嗜肺軍團菌、腸炎沙門菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌、幽門螺旋桿菌、結核分枝桿菌、肺炎克雷伯菌、霍亂弧菌、炭疽桿菌和鼠疫耶爾森菌，再通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，實現對13種病原微生物同步快速檢測。
2.根據權利要求I所述的檢測方法，其特征在于，所述方法具體包括以下步驟 (1)水樣處理 采集水樣，用無菌塑料瓶封裝，室溫靜置，取上清液加入濃縮儀進行濃縮集菌，然后抽干濾膜，取出放入離心管內，剪成細末狀；(2)DNA模板提取 采用E. Z. N. A. Bacterial DNA Kit (D3350-01)試劑盒或者與之有同等作用的其他商業(yè)化DNA提取試劑盒進行核酸提取，取IOuL樣本DNA進行下一步程序； (3)多重PCR擴增目的片段 采用15 ii L的PCR體系，包括10 X PCR Taq酶緩沖液I. 0 — 2. Oii L，濃度為2. 5 mmol/L 的 dNTP 0. I — 0. L，濃度為 10 — 20iimol/L 的引物各 0. 4 — 0. 8 u L, 50 X T-Taq DNA聚合酶0. I - 0. L，DNA模板0. 5 — I. 5 y L，雙蒸水補至15 y L ;多重PCR循環(huán)參數95°C預變性3 min,接著作30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94°C變性30s，68°C退火并延伸30s ;循環(huán)結束后68°C延伸5 min ;4°C保存?zhèn)溆茫?3種病原微生物的檢測分為三組多重PCR進行；上述引物是指權利要求I的13種病原微生物的引物； (4)電泳檢測 對三組多重PCR反應產物進行電泳觀察，第一組產物的電泳圖中含有5個不同長度的產物片段，分別為志賀菌113bp ;金黃色葡萄球菌283bp ;腸出血性大腸桿菌0157:H7 366bp ;大腸埃希菌471bp ;腸炎沙門氏菌679bp ;第二組產物的電泳圖中含有4個不同長度的產物片段，分別為單核細胞增生李斯特菌155bp ;嗜肺軍團菌252bp，肺炎克雷伯菌319bp ;幽門螺旋桿菌364bp ;第三組產物的電泳圖中含有5個不同長度的產物片段，分別為結合分枝桿菌135bp ;鼠疫耶爾森菌184bp ;炭疽芽孢桿菌275bp ;霍亂弧菌465bp ；16S 370bp ;其中16S做為檢測結果的陽性質控。
3.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于所述步驟(4)中的電泳檢測使用3%瓊脂糖凝膠。
4.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于所述步驟(I)的濃縮儀采用Milliflex Plus微生物過濾系統(tǒng)。
全文摘要
一種基于多重PCR的水中13種病原微生物同步快速檢測方法，所述方法是采用多重PCR同時擴增13種病原微生物的特異性基因片段大腸埃希菌、腸出血性大腸桿菌O157:H7、嗜肺軍團菌、腸炎沙門菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌、幽門螺旋桿菌、結核分枝桿菌、肺炎克雷伯菌、霍亂弧菌、炭疽桿菌和鼠疫耶爾森菌，再通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，實現對13種病原微生物同步快速檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102703588SQ201210172849
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月30日 優(yōu)先權日2011年8月9日
發(fā)明者張春秀, 敖漉, 方振東, 王大勇, 謝朝新, 陳金絲, 馬穎 申請人:上海生物芯片有限公司, 中國人民解放軍后勤工程學院