專利名稱：非復(fù)制性微生物及其免疫強(qiáng)化效應(yīng)的制作方法
非復(fù)制性微生物及其免疫強(qiáng)化效應(yīng)本發(fā)明一般涉及微生物領(lǐng)域，特別是食品級(jí)細(xì)菌。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及屬于乳桿菌屬、雙歧桿菌屬或其組合的非復(fù)制性益生菌，例如副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)、乳酸雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)、短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve)或其組合，以及這些細(xì)菌的應(yīng)用。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及非復(fù)制性益生菌及其在制備用于治療或預(yù)防涉及受損(compromised)免疫防御的疾病的組合物中的用途。益生菌可定義為“當(dāng)以足量施用時(shí)，對(duì)宿主產(chǎn)生健康益處的活的微生物”(FA0/WHO(2001)Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food includingPowder Milk with Live Lactic Acid Bacteria. Report of a Joint FAO/WHO ExpertConsultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probioticsin Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria)。因此，絕大多數(shù)公開的文獻(xiàn)都涉及活的益生菌。然而，一些研究探討了由非復(fù)制性細(xì)菌產(chǎn)生的健康益處，但得出的結(jié)論是熱失活益生菌一般導(dǎo)致喪失其聲稱的健康益處(Rachmilewitz, D. , K.等人，2004, Gastroenterology 126 :520-528 ;Castagliuolo, I.等人，2005, FEMS Immunol. Med.Microbiol. 43 :197-204 ；Gill, H. S.和 K. J. Rutherfurd. 2001，Br. J. Nutr· 86 :285-289 ；Kaila, M.等 A, 1995, Arch. Dis. Child 72 :51-53 ；ffagner, R. D.等人，2000，J. FoodProt. 63 :638-644)。然而，一些研究顯示殺死的益生菌可能保留了一些健康效應(yīng)。這可能取決于例如用于失活它們的方法(Rachmi lewitz, D. ,K.等人，2004, Gastroenterology 126:520-528;Gill,H. S.和 K. J. Rutherfurd. 2001，Br. J. Nutr. 86 :285-289)。文獻(xiàn)中用于殺死益生菌菌株的技術(shù)大部分是熱處理、Y-輻射、UV處理或化學(xué)劑(福爾馬林、低聚甲醛)。一般而言，在如今的食品工業(yè)中，添加益生菌的食品一般在低溫運(yùn)輸系統(tǒng)(coldchain)中儲(chǔ)藏較長(zhǎng)時(shí)間和/或經(jīng)處理降低了細(xì)菌負(fù)載。然而，降低產(chǎn)品中的細(xì)菌負(fù)載、長(zhǎng)的儲(chǔ)藏時(shí)間以及任何種類的加工如噴霧干燥等，降低了產(chǎn)品中的可復(fù)制性(viable)益生菌的量。而降低產(chǎn)品中的可復(fù)制性益生菌的量在本領(lǐng)域中通常等同于降低或者甚至喪失所聲稱的益生菌的上述健康效應(yīng)。一些包含特定的被殺死的益生菌的制品可能保留了一部分健康效應(yīng)，該發(fā)現(xiàn)是令人鼓舞的，一般認(rèn)為活的益生菌具有比失活的益生菌更好的或者至少相同的效應(yīng)。然而，理想的是獲得在失活后具有改善的或新的健康效應(yīng)的可獲得的微生物細(xì)胞制品。受損的免疫防御對(duì)對(duì)象的健康狀態(tài)可能具有許多負(fù)面的影響。例如可以導(dǎo)致更大的感染風(fēng)險(xiǎn)和/或增加的感染嚴(yán)重程度。還可以促進(jìn)或加強(qiáng)免疫缺陷相關(guān)性疾病，或?qū)е逻^敏。因此，對(duì)于所有年齡段的所有對(duì)象，加強(qiáng)免疫防御對(duì)保護(hù)身體是重要的。特別的是，對(duì)這樣的對(duì)象而言是重要的，所述對(duì)象的免疫系統(tǒng)處于受損的或暫時(shí)受抑制，例如新生兒、老年人、經(jīng)受高壓力條件的對(duì)象，服用免疫抑制劑的患者，處于放療或化療的患者或出、現(xiàn)過敏性疾病的對(duì)象。其中，抗感染和免疫缺陷相關(guān)性疾病的天然防御暗示宿主能夠發(fā)起有效且快速的先天性免疫防御，包括激活例如巨噬細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞。此外，有效的免疫防御還暗示宿主能夠下調(diào)免疫系統(tǒng)的過度反應(yīng)，例如過敏中發(fā)生的。巨噬細(xì)胞響應(yīng)病原體的吞噬作用的殺傷活性通常伴隨有暫時(shí)加強(qiáng)的促炎性細(xì)胞因子，例如 TNF-a、IL-6、IL-1 和 IL-12 (Shoda, L.等人，2000, Infection and Immunity68 :5139-5145)。由抗原呈遞細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞)生產(chǎn)的IL-12激活天然殺傷細(xì)胞生產(chǎn)IFN- Y，并通過分化生產(chǎn)IFN- Y的T輔助細(xì)胞而促進(jìn)獲得性免疫應(yīng)答的出現(xiàn)。此外，TNF-α和IFN-Y在自分泌環(huán)路中的作用刺激吞噬細(xì)胞的殺傷活性(Soehnlein，O.等人，2008, Journal of Clinical Investigation 118:3491-3502)。相反，許多免疫細(xì)胞類型生產(chǎn)的IL-10抑制由巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞生產(chǎn)的促炎性細(xì)胞因子的生產(chǎn)，如IL-l、IL-6、IL-12和TNF-α (Mosser,D.和Zhang,X. ,2008,Immunological Reviews 226 :205-218)。已知特定的活益生菌菌株在體外刺激促炎性細(xì)胞因子，例如IL-12和TNF-α，所述促炎性細(xì) 胞因子與大鼠腹膜巨噬細(xì)胞增強(qiáng)的吞噬作用活性相關(guān)聯(lián)(Ishida-Fujii，K. ,2007, Biosc.Biotechnol. Biochem 71 :866-873)。在人中(健康的成人和老年人)，已報(bào)道消耗活的益生菌或含益生菌的食品增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞的吞噬活性和/或天然殺傷細(xì)胞的殺傷活性，提示一些活的益生菌菌株的免疫增強(qiáng)效應(yīng)(Sheih,Y-H.等人,2001, J Ameriacn College Nutrition 20 :149-156 ;Chiang,B.等人，2000, European J Clinical Nutrition 54 :849-855 ；Parra, M.等人，2004,J Physiol Biochem 60 :85-92 ;Nagao, F.等人，2000, Biosc Biotechnol Biochem 64:2706-2708)。然而。本領(lǐng)域仍然需要包含對(duì)宿主的免疫系統(tǒng)具有有益效應(yīng)的益生菌的微生物細(xì)胞制品，其中所述細(xì)胞制品僅在處理后表現(xiàn)出它們的有益效應(yīng)或處理后表現(xiàn)特別好，其中所述處理?xiàng)l件不允許所述微生物細(xì)胞復(fù)制和/或保留可復(fù)制性。因此，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是進(jìn)一步改善本領(lǐng)域的現(xiàn)狀，提供對(duì)一些條件下的宿主的免疫系統(tǒng)表現(xiàn)出新的或改善的有益效應(yīng)的微生物細(xì)胞制品，其中處理所述微生物細(xì)胞的方式不允許它們復(fù)制和/或保留可復(fù)制性。獨(dú)立權(quán)利要求的主題解決了該目標(biāo)。從屬權(quán)利要求進(jìn)一步發(fā)展了本發(fā)明?，F(xiàn)有技術(shù)一般教導(dǎo)了熱處理益生菌導(dǎo)致部分或完全喪失它們的健康有益特性。僅在例外情況下維持了一些測(cè)試到的健康益處(Verdu等人,2004, Gastroenterology, 127,第 826 頁，Rousseaux, 2007, Nature Medicine, 13,第 35 頁；Kamiya 等人，2006, Gut, 55,第191 頁)。現(xiàn)在，本發(fā)明人令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，熱處理后可以增強(qiáng)益生菌菌株刺激例如人細(xì)胞生產(chǎn)促炎性細(xì)胞因子的能力。已在若干乳桿菌和雙歧桿菌中觀察到該效應(yīng)。非復(fù)制性益生微生物具有遠(yuǎn)比其活的相應(yīng)微生物更易于處理的優(yōu)勢(shì)。此外，它們的儲(chǔ)藏更加穩(wěn)定并需要較不嚴(yán)格的包裝條件。非復(fù)制性益生微生物可允許開發(fā)大量的功能食品，這些功能食品在沒有額外的保護(hù)措施的條件下，本質(zhì)上不允許添加活的益生菌。這在例如提供壓塊干糧、果汁、UHT飲料、耐貯存飲料等中發(fā)揮了作用。
此外，例如在免疫受損的消費(fèi)者中，由于出現(xiàn)菌血癥的潛在風(fēng)險(xiǎn)，因此使用活的益生菌可能受限制。在此，本發(fā)明人展示了產(chǎn)生具有體外免疫增強(qiáng)譜(profile)的不能復(fù)制的細(xì)菌的方法，而不論所述細(xì)菌初始的免疫譜?？蓮?fù)制時(shí)沒有免疫增強(qiáng)譜的細(xì)菌可以提供免疫增強(qiáng)譜；而可復(fù)制時(shí)具有免疫增強(qiáng)譜的細(xì)菌可以提供提高的免疫增強(qiáng)譜。額外的，提供非復(fù)制性益生微生物允許熱沖調(diào)，例如粉末狀的營(yíng)養(yǎng)組合物。因此，現(xiàn)在能夠產(chǎn)生比其活的相應(yīng)微生物更有效地提高免疫防御的非復(fù)制性益生微生物?，F(xiàn)有技術(shù)一般教導(dǎo)由熱處理導(dǎo)致非復(fù)制性的細(xì)菌通常在展現(xiàn)其益生特性時(shí)比活細(xì)胞的效率低，本發(fā)明人能夠證實(shí)熱處理的益生菌相比其活的相應(yīng)微生物更好地刺激免疫系統(tǒng)。因此，本發(fā)明涉及包含益生菌的組合物，所述益生菌通過在至少約70°C下熱處理 至少約3分鐘致使其不復(fù)制。還涉及包含益生菌的組合物，其用于治療或預(yù)防涉及受損免疫防御的疾病，所述益生菌通過在至少約70°C下熱處理至少約3分鐘致使其不復(fù)制。本發(fā)明涉及益生菌的用途，用于制備治療或預(yù)防涉及受損免疫防御的疾病的組合物，所述益生菌通過在至少約70°C下熱處理至少約3分鐘致使其不復(fù)制。因此，本發(fā)明的非復(fù)制性益生菌可用于制備增強(qiáng)免疫防御的組合物?！胺菑?fù)制性”意指通過經(jīng)典的涂板方法不能檢測(cè)到可復(fù)制的細(xì)胞和/或集落形成單位。此類經(jīng)典的涂板方法概括在微生物學(xué)書籍中James Monroe Jay,Martin J. Loessner,David A. Golden. 2005. Modern food microbiology,第 7版，Springer Science, New York,N. Y.第790頁。典型的，缺少可復(fù)制細(xì)胞可表現(xiàn)如下在用不同濃度的細(xì)菌制品(“非復(fù)制性”樣品)接種并在恰當(dāng)?shù)臈l件(好氧和/或厭氧氣氛下至少24小時(shí))下孵育后，在瓊脂平板上沒有可見的集落，或在液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中沒有增加的渾濁度。例如，可以通過熱處理致使雙歧桿菌(例如長(zhǎng)雙歧桿菌、乳酸雙歧桿菌和短雙歧桿菌)或乳桿菌(例如副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌)非復(fù)制，特別是低溫/長(zhǎng)時(shí)間熱處理的情況下。至少95%重量，優(yōu)選至少97. 5%重量，更優(yōu)選至少99%重量的益生菌生物量是非復(fù)制性的，最優(yōu)選的是所有的益生菌都是非復(fù)制性的。通過熱處理致使益生菌非復(fù)制。該熱處理可以在約70_150°C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行約3分鐘-2小時(shí)，優(yōu)選在80-140°C的范圍內(nèi)進(jìn)行5分鐘-40分鐘。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，熱處理越久和/或溫度越高，破壞和/或釋放的細(xì)菌細(xì)胞或細(xì)菌化合物越多。益生菌可選自乳桿菌屬、雙歧桿菌屬或其組合，例如副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、乳酸雙歧桿菌、短雙歧桿菌或其組合，例如菌株副干酪乳桿菌NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007、長(zhǎng)雙歧桿菌NCC3001、乳酸雙歧桿菌NCC2818、短雙歧桿菌NCC2950或
其組合。長(zhǎng)雙歧桿菌NCC3001根據(jù)布達(dá)佩斯條約以ATCC BAA-999保藏，可獲得自例如日本的 Morinaga Milk Industry Co. Ltd.,商標(biāo)為 BB536。乳酸雙歧桿菌NCC2818根據(jù)布達(dá)佩斯條約以CNCM 1-3446保藏。
鼠李糖乳桿菌NCC4007根據(jù)布達(dá)佩斯條約以CGMCC I. 3724保藏。副干酪乳桿菌NCC2461根據(jù)布達(dá)佩斯條約以CNCM 1-2116保藏。短雙歧桿菌NCC2950 (菌株A)根據(jù)布達(dá)佩斯條約以CNCM 1-3865保藏。通過體外免疫分型(immunoprofiling)驗(yàn)證非復(fù)制性益生菌的免疫增強(qiáng)效應(yīng)。所使用的體外模型使用人外周血單核細(xì)胞(PBMC)的細(xì)胞因子譜，是本領(lǐng)域普遍接受作為測(cè)試免疫調(diào)節(jié)性化合物的標(biāo)準(zhǔn)模型(Schultz等人,2003, Journal of Dairy Research70,165-173 ;Taylor 等人，2006, Clinical and Experimental Allergy,36,1227-1235 ；Kekkonen 等人，2008, World Journal of Gastroenterology, 14,1192-1203)。已有一些作者/研究小組使用體外PBMC測(cè)定例如根據(jù)益生菌的免疫譜分類益生菌，S卩，它的抗炎性或促炎性特征(Kekkonen等人，2008, World Journal ofGastroenterology, 14,1192-1203)。例如，該測(cè)定表現(xiàn)出允許在腸道結(jié)腸炎的小鼠模型中預(yù)測(cè)益生菌候選物的抗炎性效應(yīng)(Foligne, B.等人,2007, World J. Gastroenterol. 13 ·236-243)。此外，該測(cè)定常規(guī)上用作臨床試驗(yàn)的讀出結(jié)果，并表現(xiàn)出獲得與臨床結(jié)論符合的結(jié)果(Schultz 等人，2003, Journal of Dairy Research 70,165-173 ;Taylor 等人，2006,Clinical and Experimental Allergy,36,1227-1235)。在過去數(shù)十年間，過敏性疾病穩(wěn)步增加，目前已被WHO認(rèn)為是流行病。一般而言，過敏被認(rèn)為是免疫系統(tǒng)的Thl和Th2應(yīng)答失衡的結(jié)果，導(dǎo)致強(qiáng)烈的偏向于生產(chǎn)Th2介質(zhì)。因此，通過重建免疫系統(tǒng)的Thl和Th2臂(arm)之間恰當(dāng)?shù)钠胶猓梢詼p輕、下調(diào)或預(yù)防過敏。這暗示必須降低Th2應(yīng)答或增強(qiáng)，至少暫時(shí)的增強(qiáng)Thl應(yīng)答。后者是免疫增強(qiáng)應(yīng)答的特征，通常伴隨著例如較高水平的IFN Y、TNF- α和IL-12 (Kekkonen等人，2008，World Journalof Gastroenterology, 14,1192-1203 ；Vil janen M.等人，2005, Allergy, 60,494-500)。本發(fā)明允許治療或預(yù)防涉及受損免疫防御的疾病。因此，可以被使用本發(fā)明制備的組合物治療或預(yù)防的與受損免疫防御相關(guān)聯(lián)的疾病沒有特別的限制。例如，可以選自感染，特別是細(xì)菌、病毒、真菌和/或寄生蟲感染；吞噬細(xì)胞缺陷；低至嚴(yán)重的免疫抑制水平例如由壓力或免疫抑制藥物、化學(xué)療法或放射療法誘導(dǎo)的；自然狀態(tài)下較低免疫活性的免疫系統(tǒng)例如新生兒或老年人的；過敏；及其組合。本發(fā)明描述的組合物還允許增強(qiáng)對(duì)象對(duì)疫苗的應(yīng)答，特別是對(duì)口服疫苗的應(yīng)答。同樣的，使用本發(fā)明制備的組合物的種類沒有特別的限制。例如，可以是藥物組合物、營(yíng)養(yǎng)食品、食物添加劑、寵物食物、食品或飲料。本發(fā)明的組合物可以是任何種類的組合物。組合物可以例如是口服、腸道、不經(jīng)腸道(皮下或肌肉內(nèi))、局部或眼部施用的。例如，可以是選自食物組合物、食品包括寵物食物、飲料、營(yíng)養(yǎng)配方、飼料配方、營(yíng)養(yǎng)食品、食物添加劑、藥物組合物、化妝品組合物和藥物。食物添加劑或藥物可以是例如片劑、膠囊、錠劑或液體的形式。這些組合物可以進(jìn)一步包含保護(hù)性的水狀膠體(例如樹膠、蛋白質(zhì)、改性淀粉)、粘合劑、成膜劑、封裝劑/材料、壁/殼材料、基質(zhì)化合物、包衣、乳化劑、表面活性劑、增溶劑(油、脂、蠟、卵磷脂等)、吸附劑、載體、填充劑、輔助化合物、分散劑、濕潤(rùn)劑、加工助劑(溶劑)、助流劑、口味遮蔽劑、增重劑、成凝膠劑、凝膠形成劑、抗氧化劑和抗菌劑。還可以含有常規(guī)的藥物添加劑和佐劑、賦形劑和稀釋劑，包括但不限于水、任何起源的明膠、植物性樹膠、木質(zhì)素磺酸鹽(Iigninsulfonate)、滑石、糖、淀粉、阿拉伯膠、植物油、聚亞燒基二醇、芳香劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、緩沖液、潤(rùn)滑劑、著色劑、濕潤(rùn)劑、填充劑等。此外，組合物可以含有適合口服、舌下、局部、眼部、腸道或不經(jīng)腸道(例如皮下或肌肉內(nèi))施用的有機(jī)或無機(jī)載體材料，以及維生素、痕量礦物質(zhì)和根據(jù)政府機(jī)構(gòu)如USRDA推薦的其他微量營(yíng)養(yǎng)素。根據(jù)組合物的計(jì)劃用途，本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步包含其他試劑。例如可以幫助最小化由涉及免疫防御減弱的疾病導(dǎo)致的不舒適感的疼痛或發(fā)熱緩解劑。 可以添加穩(wěn)定劑來穩(wěn)定組合物及其構(gòu)件?？梢蕴砑臃枷銊┖?或著色劑來調(diào)節(jié)香味和賦予組合物顏色，使其易于鑒別和/或愉快的接受。
可以添加益生元。益生元可以在益生菌被導(dǎo)致不復(fù)制之前幫助其生長(zhǎng)，或者在攝入的情況下，刺激腸道中的有益微生物生長(zhǎng)。益生元還可以與組合物中存在的和/或添加的活的益生細(xì)菌協(xié)同作用?！耙嫔币庵复龠M(jìn)腸道中的健康的、有益的微生物和/或益生菌生長(zhǎng)的不可消化的食物物質(zhì)。在攝入的個(gè)體中，它們?cè)谖负?或腸道上段不被降解，在胃腸道中不被吸附，但卻被胃腸道微生物叢和/或益生菌發(fā)酵。益生兀是例如Glenn R. Gibson和MarcelB. Roberfroid, Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota !Introducingthe Concept of Prebiotics, J. Nutr. 1995 125 :1401-1412 定義的。根據(jù)本發(fā)明使用的益生元沒有特別的限制，包括促進(jìn)腸道中的益生菌和/或健康的有益細(xì)菌生長(zhǎng)的所有食物物質(zhì)。優(yōu)選的，可以選自寡糖，任選的含有果糖、半乳糖、甘露糖；膳食纖維，特別是可溶性纖維、大豆纖維；菊粉；或其混合物。優(yōu)選的益生元是果糖寡糖(FOS)、半乳糖寡糖(GOS)、異麥芽糖寡糖(IMO)、木糖寡糖(XOS)、阿拉伯-木糖寡糖(AXOS)、甘露糖寡糖(MOS)、大豆的寡糖、葡萄糖基蔗糖(GS)、乳糖基蔗糖(LS)、半乳糖苷果糖(LA)、帕拉金糖(palatinose)寡糖(PAO)、麥芽寡糖、樹膠和/或其水解產(chǎn)物、果膠、淀粉，和/或其水解產(chǎn)物。所有益生性微生物都可以與本發(fā)明描述的非復(fù)制性益生菌組合使用。優(yōu)選例如添加的益生菌可以選自雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬(Lactococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、足球菌屬(Pediococcus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、酵母屬(Saccharoymces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)、耶氏酵母屬(Yarrowia)、假絲酵母屬(Candida)，特別是選自長(zhǎng)雙歧桿菌、乳酸雙歧桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)、青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、副干酪乳桿菌、唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)、植物乳桿菌(Lactobacillus pi ant arum)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)、路氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、戈氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)、鼠李糖乳桿菌、乳球菌物種例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳脂乳球菌(Lactococcuscremoris)、Lactococcus diacetylactis、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、幾腸球菌(Enterococcus faecalis)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、布拉氏酵母(Saccharomyces boulardii)、栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、Yarrowia Iypolitica或其混合物，優(yōu)選選自約氏乳桿菌(NCC533 ；CNCM 1-1225)、長(zhǎng)雙歧桿菌(NCC490 ；CNCM 1-2170)、長(zhǎng)雙歧桿菌(NCC2705 ；CNCM 1-2618)、長(zhǎng)雙歧桿菌(NCC3001 ；ATCC BAA-999)、乳酸雙歧桿菌(NCC2818 ；CNCM 1-3446)、短雙歧桿菌(NCC2950)、副干酪乳桿菌(NCC2461 ；CNCM 1-2116)、鼠李糖乳桿菌GG (ATCC53103)、鼠李糖乳桿菌LPR(NCC4007 ；CGMCC I. 3724)、屎腸球菌SF68(NCMB10415)，及其混合物。所有這些益生菌都可以添加復(fù)制性的或非復(fù)制性的形式。使用本發(fā)明制備的組合物可預(yù)計(jì)用于任何哺乳動(dòng)物，優(yōu)選預(yù)計(jì)用于人或?qū)櫸?。例如，可?jì)劃用于免疫系統(tǒng)減弱的或暫時(shí)被抑制的對(duì)象，例如新生兒、老年人、經(jīng) 受高壓力條件的對(duì)象、服用免疫抑制藥物的患者、處于放療或化療的患者。本發(fā)明的組合物還可以與疫苗共同施用，來增強(qiáng)疫苗的效率。共同施用包括在疫苗接種方案的3個(gè)月前、過程中，至2個(gè)月后，通過相同或不同的途徑施用。本發(fā)明組合物施用的量足以至少部分的治療免疫缺陷相關(guān)性疾病、感染及其病理性效應(yīng)。足以實(shí)現(xiàn)此的量被定義為“治療有效劑量”。對(duì)該目的有效的量取決于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種因子，例如疾病的本質(zhì)和嚴(yán)重程度、患者的體重和一般狀態(tài)，和使用的具體益生菌菌株。在預(yù)防性應(yīng)用中，向易感或者有風(fēng)險(xiǎn)患免疫疾病或感染的患者施用根據(jù)本發(fā)明的組合物，施用的量足以至少部分的降低出現(xiàn)免疫疾病的風(fēng)險(xiǎn)。所述量定義為“預(yù)防有效量”。此外，精確的量取決于多種疾病和患者的具體因素，例如患者的健康狀態(tài)和體重和所使用的細(xì)菌菌株的種類。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠恰當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)治療有效量和/或預(yù)防有效量。一般而言，本發(fā)明的組合物含有治療有效量和/或預(yù)防有效量的非復(fù)制性益生菌。典型的，治療有效量和/或預(yù)防有效量是對(duì)應(yīng)于約IO4至IO12Cfu/每日劑量的細(xì)菌質(zhì)量。因此，治療有效和/或預(yù)防有效劑量可以是在約O. 005mg-1000mg非復(fù)制性益生菌/每日劑量的范圍內(nèi)。就數(shù)量而言，組合物中存在的非復(fù)制性益生菌可以是對(duì)應(yīng)于IO2至1012CfU/g干燥組合物的量。明顯的是，非復(fù)制性細(xì)菌不形成集落；因此，該術(shù)語理解為從IO2至IO12Cfu/g復(fù)制性細(xì)菌獲得的非復(fù)制性細(xì)菌的量。包括失活的或死亡的或以片段存在的細(xì)菌，例如DNA、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物或細(xì)胞壁材料。換言之，組合物所含的細(xì)菌的量以所述量的細(xì)菌的集落形成能力來表述，如同所述細(xì)菌都是活的，而不論它們是否實(shí)際上是非復(fù)制的，例如失活的或死亡的、片段化的或任何或所有這些狀態(tài)的混合物。優(yōu)選的，益生菌存在的量等價(jià)于IO4至10lclcfu/g干燥組合物之間，更優(yōu)選的存在的量等價(jià)于IO5至109cfu/g干燥組合物之間。組合物還可以含有營(yíng)養(yǎng)上顯著量的在日常膳食中被認(rèn)為是必需的所有維生素和礦物質(zhì)。已建立了某些維生素和礦物質(zhì)的最低需求。任選的存在于組合物中的礦物質(zhì)、維生素和其他營(yíng)養(yǎng)物的實(shí)例包括維生素A、維生素BI、維生素B2、維生素B6、維生素B12、維生素E、維生素K、維生素C、維生素D、葉酸、肌醇、煙酸、生物素、泛酸、膽堿、鈣、磷、碘、鐵、鎂、銅、鋅、錳、氯、鉀、鈉、硒、鉻、鑰、?；撬岷蚅-肉毒堿。礦物質(zhì)通常以鹽的形式添加。具體礦物質(zhì)和其他維生素的存在和量將根據(jù)預(yù)計(jì)的消費(fèi)者而改變。本發(fā)明的組合物可含有至少一種蛋白質(zhì)源、至少一種碳水化合物源和至少一種脂類源?？梢允褂萌魏魏线m的膳食蛋白，例如動(dòng)物蛋白(例如奶蛋白、肉蛋白和蛋蛋白)；植物蛋白(例如大豆蛋白、小麥蛋白、稻蛋白和豌豆蛋白)；這些蛋白質(zhì)的部分或完全的水解產(chǎn)物，游離氨基酸的混合物；或其組合。如果需要水解的蛋白質(zhì)，則可以根據(jù)需要和本領(lǐng)域已知的進(jìn)行水解過程。奶蛋白和大豆蛋白是特別優(yōu)選的，例如酪蛋白和乳清。關(guān)于乳清蛋白，蛋白質(zhì)源可以基于酸乳清或甜乳清或其混合物，可以包括以任何需要的比例的α乳清蛋白和β乳球蛋白。然而優(yōu)選的，特別是如果組合物是嬰兒喂養(yǎng)配方，則蛋白質(zhì)源是基
于修飾的甜乳清。如果本發(fā)明的組合物含有蛋白質(zhì)源，則組合物中的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)等價(jià)物的量典型的在I. 6-7. 5g/100kcal組合物的范圍內(nèi)。特別是對(duì)營(yíng)養(yǎng)配方而言，蛋白質(zhì)源應(yīng)該提供滿足必需氨基酸含量的最低需求。如果組合物含有碳水化合物源，則使用的碳水化合物的種類沒有特別的限制?？梢允褂萌魏魏线m的碳水化合物，例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖漿固形物、麥芽糊精、淀粉及其混合物?？梢允褂貌煌奶妓衔镌吹慕M合。碳水化合物可優(yōu)選的提供30%至80%的組合物能量。例如，組合物可包括9-18g/100kcal組合物的量的碳水化合物源。如果組合物含有脂類源，則使用的脂類的種類沒有特別的限制。如果組合物包括脂類源，則脂類源可提供5%至70%的組合物能量?？梢蕴砑娱L(zhǎng)鏈n-3和/或n-6多不飽和脂肪酸，例如DHA、ARA和/或EPA。可以使用芥花籽油、玉米油、高油酸向日葵油和中鏈甘油三酯油的摻合物獲得合適的脂肪譜。組合物可以包含I. 5-7g/100kcal組合物的量的脂類源。還可以添加膳食纖維?？梢允强扇艿幕虿豢扇艿模话銉?yōu)選是兩種類型的摻合物。合適的膳食纖維源包括大豆、豌豆、燕麥、果膠、瓜爾膠、阿拉伯膠、果糖寡糖、半乳糖寡糖、唾液酰-乳糖和源自動(dòng)物奶的寡糖。優(yōu)選的纖維摻合物是菊粉與短鏈果糖寡糖的混合物。根據(jù)本發(fā)明的食品包括飲料，特別是基于奶或酸奶的飲料；奶產(chǎn)品例如酸奶、冰激凌或基于奶酪的產(chǎn)品；果汁和軟飲料；營(yíng)養(yǎng)配方，例如完全營(yíng)養(yǎng)的，如用于嬰兒、兒童、青少年、成人、老年人或垂危對(duì)象的；谷粒和壓塊干糧；基于奶的粉末，將溶解在水或基于奶的液體中的粉末、咖啡乳膏(coffee creamer)、湯、調(diào)味粉(spreading)。本發(fā)明的組合物包括非復(fù)制性益生菌。非復(fù)制性益生菌可選自乳桿菌屬、雙歧桿菌屬或其組合，例如副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、乳酸雙歧桿菌、短雙歧桿菌或其組合，例如副干酪乳桿菌NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007、長(zhǎng)雙歧桿菌NCC3001、乳酸雙歧桿菌NCC2818、短雙歧桿菌NCC2950或其組合。可以通過熱處理致使益生菌不復(fù)制，例如在約70_150°C的溫度范圍內(nèi)約3分鐘_2小時(shí)，優(yōu)選在80-140°C的范圍內(nèi)5分鐘-40分鐘。
可以以本領(lǐng)域已知的任何方式制備此類組合物。例如，如果所述組合物是營(yíng)養(yǎng)配方，例如嬰兒喂養(yǎng)配方，則可以通過以恰當(dāng)?shù)谋壤龘胶系鞍踪|(zhì)源、碳水化合物源和脂肪源來制備。使用時(shí)，摻合物中可包括乳化劑。此時(shí)可以添加維生素和礦物質(zhì)，但通常是隨后添加以避免熱降解。任何親脂性維生素、乳化劑等可以在摻合前溶解在脂肪源中。然后混入水，優(yōu)選經(jīng)過逆向透析的水，形成液體混合物。然后，可以熱處理所述液體混合物，降低細(xì)菌負(fù)載。例如，可以快速加熱液體混合物至約70-150°C的溫度范圍內(nèi)約3分鐘-2小時(shí)，優(yōu)選在80-140°C的范圍5分鐘-40分鐘。可以通過蒸汽注射或熱交換器進(jìn)行，例如平板式熱交換器。然后，可以冷卻液體混合物至約60°C至85°C ;例如通過閃蒸冷卻(flashcooling)。然后，可以進(jìn)一步冷卻均質(zhì)化的混合物，添加任何熱敏感的組分；例如維生素和礦物質(zhì)。此時(shí)，將均質(zhì)的混合物的pH和固體含量進(jìn)行常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)化。將均質(zhì)的混合物轉(zhuǎn)移至適當(dāng)干燥的裝置中，例如噴霧干燥器、冷凍干燥器或滾筒干燥器，并轉(zhuǎn)化為粉末。粉末應(yīng)該具有按重量計(jì)少于約5%的水含量。 可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的方法培養(yǎng)益生菌，并通過例如冷凍干燥或噴霧干燥制備成用于向營(yíng)養(yǎng)組合物中添加的。然后，在熱處理組合物以降低細(xì)菌負(fù)載之前，可以向組合物中添加益生菌。這將自動(dòng)導(dǎo)致益生菌不復(fù)制。一般而言，使用非復(fù)制性益生菌具有這樣的優(yōu)點(diǎn)，即所述細(xì)菌可以在熱處理步驟(例如滅菌步驟)前方便的加入到任何組合物中。此類滅菌可以通過長(zhǎng)時(shí)間的溫和熱處理實(shí)現(xiàn)。以該方式，可以避免必須在加熱步驟后向產(chǎn)物中添加細(xì)菌組合物，使得——與此同時(shí)——節(jié)省了一個(gè)生產(chǎn)步驟，并降低了在加熱步驟后的細(xì)菌污染的風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)然可選的，也可以單獨(dú)熱處理益生菌，然后作為非復(fù)制性益生菌添加到組合物中。添加產(chǎn)生健康益處的非復(fù)制性益生菌還允許熱沖調(diào)粉末狀的食物組合物。如果除所述組合物外還添加任何益生菌，則可以根據(jù)任何合適的方法培養(yǎng)選定的益生菌，并通過例如冷凍干燥或噴霧干燥制備成用于添加到組合物中的。可選的，細(xì)菌制品可以購(gòu)自專業(yè)供應(yīng)商已經(jīng)制備成適合向食品中添加的合適形式。發(fā)明人在本文中首次描述了增加益生菌治療或預(yù)防免疫缺陷相關(guān)疾病的效率的方法。方法涉及通過熱處理致使至少一部分益生菌不復(fù)制。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是增加益生菌在施用后治療或預(yù)防涉及受損免疫防御的疾病的效率的方法，所述益生菌選自例如乳桿菌屬、雙歧桿菌屬或其組合，例如副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、乳酸雙歧桿菌、短雙歧桿菌或其組合，例如副干酪乳桿菌NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007、長(zhǎng)雙歧桿菌NCC3001、乳酸雙歧桿菌NCC2818、短雙歧桿菌NCC2950或其組合，包括步驟使益生菌經(jīng)歷致使至少一部分益生菌(例如雙歧桿菌或乳桿菌)不復(fù)制的處理。該處理可以是熱處理，例如在施用前，在約70_150°C的溫度范圍內(nèi)約3分鐘_2小時(shí)，優(yōu)選在80-140°C的范圍5分鐘-40分鐘。所述的益生菌處理，例如熱處理，可以導(dǎo)致致使至少95%，優(yōu)選至少97. 5%，更優(yōu)選至少99%，最優(yōu)選所有的益生菌不復(fù)制。本發(fā)明的方法可用于增加益生菌治療或預(yù)防涉及受損免疫防御的疾病的效率。
為了細(xì)菌制品改善的穩(wěn)定性和改善的口感，可以在攝入組合物前將非復(fù)制性益生菌添加到預(yù)計(jì)消耗的組合物中。可以以該方式攝入包含非復(fù)制性益生菌的組合物，組合物的其他構(gòu)件可用于使組合物適用于它的預(yù)計(jì)目的?？蛇x的，方法可涉及向組合物中添加可復(fù)制的益生菌的步驟，然后在施用前使含益生菌的組合物經(jīng)歷致使至少一部分益生菌不復(fù)制的處理。本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解，在不脫離所公開的本發(fā)明的范圍內(nèi)，他們可以自由的組合本文所述的本發(fā)明的所有特征。特別的是，描述用于本發(fā)明用途的特征可用于本發(fā)明的組合物和方法，反之亦然。根據(jù)下列實(shí)施例和附圖
，本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)和特征是顯而易見的。
圖I顯示了用熱處理的細(xì)菌刺激的人PBMC在體外細(xì)胞因子分泌的增強(qiáng)。圖2顯示了在用生理鹽水(陰性對(duì)照)刺激的OVA敏化小鼠、用0VA(陽性對(duì)照)刺激的OVA敏化小鼠、用OVA刺激并用熱處理的或活的短雙歧桿菌NCC2950處理的OVA敏化小鼠中觀察到的腹瀉強(qiáng)度的百分比。結(jié)果展示為腹瀉強(qiáng)度的百分比(根據(jù)4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)計(jì)算的均值土SEM)，陽性對(duì)照(用過敏原敏化和刺激的)組中出現(xiàn)的癥狀為100%腹瀉強(qiáng)度。
實(shí)施例方法學(xué)細(xì)菌制品使用五種益生菌菌株探討非復(fù)制性益生菌的免疫增強(qiáng)特性3種雙歧桿菌(長(zhǎng)雙歧桿菌NCC3001、乳酸雙歧桿菌NCC2818、短雙歧桿菌NCC2950)和2種乳桿菌(副干酪乳桿菌NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007)。細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)在MRS上，37°C分批發(fā)酵16-18h，不控制pH。為了達(dá)到約IOElOcfu/ml的終濃度，離心細(xì)菌細(xì)胞(5，000xg，4°C )，并在生理鹽水中稀釋前，重懸在磷酸鹽緩沖的生理鹽水中。長(zhǎng)雙歧桿菌NCC3001、乳酸雙歧桿菌NCC2818、副干酪乳桿菌NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007在85°C水浴中熱處理20分鐘。短雙歧桿菌NCC2950在90°C水浴中熱處理30分鐘。等分熱處理的細(xì)菌懸浮液，并保持冷凍在_80°C下直到使用?；罴?xì)菌儲(chǔ)藏在PBS-甘油15%在-80°C下直到使用。細(xì)菌制品的體外免疫譜評(píng)估活的和熱處理的細(xì)菌制品的免疫譜(即，在體外誘導(dǎo)人血細(xì)胞分泌特定細(xì)胞因子的能力)。從血液濾器中分離人外周血單核細(xì)胞(PBMC)。在通過細(xì)胞密度梯度分離后，收集單核細(xì)胞，并用Hank氏平衡鹽溶液洗滌兩次。然后將細(xì)胞重懸在補(bǔ)充了 10%胎牛血清(Bioconcept, Paris, france)、I % L-谷氨酰胺(Sigma)、I %青霉素 / 鏈霉素(Sigma)和
O.I %慶大霉素(Sigma)的Iscove修飾的Dulbecco培養(yǎng)基(IMDM,Sigma)中。然后，在48孔板中，用活的和熱處理的細(xì)菌(等價(jià)于7xl06cfu/孔)孵育PBMS(7xl05細(xì)胞/孔)36h。在分為2個(gè)獨(dú)立組、來自8個(gè)單獨(dú)供體的PBMS中，測(cè)試活的和熱處理的細(xì)菌的效應(yīng)。在孵育36h后，冷凍培養(yǎng)板，保持在_20°C下直到測(cè)量細(xì)胞因子。對(duì)活細(xì)菌及其相應(yīng)的熱處理細(xì)菌，平行的(即，在相同批次的PBMC的相同實(shí)驗(yàn)中)實(shí)施細(xì)胞因子分型。根據(jù)生產(chǎn)商的說明，通過ELISA(R&D DuoSet 人 IL-10，BD OptEIA 人 IL12p40，BD OptEIA人TNF，BD OptEIA人IFN- y )確定孵育36h后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子(IFN-Y、IL-12p40、TNF-a 和 IL-10)的水平。IFN-Y、IL_12p40 和 TNF-a 是促炎性細(xì)胞因子，而IL-10是潛在的抗炎性介質(zhì)。結(jié)果表示為4個(gè)供體的均值(pg/ml)+/-SEM，代表分別用4個(gè)供體實(shí)施的2組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)?；畹暮蜔崽幚淼亩屉p歧桿菌NCC2950在預(yù)防過敏性腹瀉中的體內(nèi)效應(yīng)使用過敏性腹瀉的小鼠模型測(cè)試短雙歧桿菌NCC2950的Thl促進(jìn)效應(yīng)(BrandtE.B等人，JCI 2003 ；112(11) :1666-1667)。在敏化(以14天的間隔2次腹膜內(nèi)注射卵清蛋白(OVA)和硫酸鋁鉀；第O和14天)后，雄性Balb/c小鼠用OVA 口服刺激6次(第27、29、32、34、36、39天)，導(dǎo)致暫時(shí)的臨床癥狀(腹瀉)和免疫參數(shù)改變(總IgE、OVA特異性IgE、小鼠肥大細(xì)胞蛋白酶I即MMCP-I的血漿濃度)。在OV A敏化前4天(第_3、-2、_1、0天和第11、12、13和14天)和刺激階段的過程中(第23至39天)，管飼活的或90°C熱處理30min的短雙歧桿菌NCC2950。使用日常細(xì)菌劑量為約IO9集落形成單位(cfu)或等價(jià)的cfu/小鼠。結(jié)果在熱處理后誘導(dǎo)“促炎性”細(xì)胞因子分泌在體外評(píng)估熱處理的細(xì)菌菌株刺激人外周血單核細(xì)胞(PBMC)分泌細(xì)胞因子的能力。在相同的體外測(cè)定中，比較基于由熱處理細(xì)菌刺激PBMC的四種細(xì)胞因子的免疫譜與由活細(xì)菌細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫譜。將熱處理的制品涂板，評(píng)估缺少任何可復(fù)制細(xì)菌的計(jì)數(shù)。在涂板后，熱處理的細(xì)菌制品沒有廣生集落。當(dāng)與人PBMC孵育時(shí)，活的益生菌誘導(dǎo)不同的和菌株依賴性的細(xì)胞因子生產(chǎn)水平(圖I)。相比相應(yīng)的活菌，熱處理的益生菌修飾了 PBMC生產(chǎn)的細(xì)胞因子的水平。熱處理的細(xì)菌比相應(yīng)的活菌誘導(dǎo)了更多的促炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IFN-Y、IL-12p40)。相反，熱處理的細(xì)菌比活細(xì)胞誘導(dǎo)了相似或更低量的IL-10 (圖I)。這些數(shù)據(jù)顯示熱處理的細(xì)菌比相應(yīng)的活菌更能夠刺激免疫系統(tǒng)，因此更能夠增強(qiáng)減弱的免疫防御。換言之，體外數(shù)據(jù)示例了熱處理后的細(xì)菌菌株的提高的免疫增強(qiáng)效應(yīng)。為了示例熱處理的短雙歧桿菌NCC2950 (相比活細(xì)胞)對(duì)免疫系統(tǒng)提高的效應(yīng)，在過敏性腹瀉的動(dòng)物模型中同時(shí)測(cè)試了活的和熱處理的短雙歧桿菌NCC2950。相比陽性對(duì)照組，用熱處理的短雙歧桿菌NCC2950治療后，腹瀉強(qiáng)度顯著且持續(xù)的減少(41.1% ±4.8)，而用活的短雙歧桿菌NCC2950治療后，腹瀉強(qiáng)度僅降低了20±28. 3%。這些結(jié)果證實(shí)，熱處理的短雙歧桿菌NCC2950表現(xiàn)出比其相應(yīng)的活菌提高的抗過敏性腹瀉的保護(hù)效應(yīng)(圖2)。結(jié)果顯示，在熱處理后改善了益生菌提高免疫防御的能力。打印輸出(原始電子表格)(該頁不作為國(guó)際申請(qǐng)的一部分并且不認(rèn)為是國(guó)際申請(qǐng)頁)
權(quán)利要求
1.通過在至少約70°c下熱處理至少約3分鐘致使不復(fù)制的益生菌的用途，用于制備治療或預(yù)防涉及受損免疫防御的疾病的組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的用途，其中所述益生菌選自乳桿菌屬(Iactobacilli)、雙歧桿菌屬(bifidobacteria)或其組合,例如副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、乳酸雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)或其組合，例如菌株副干酪乳桿菌NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007、長(zhǎng)雙歧桿菌NCC3001、乳酸雙歧桿菌NCC2818、短雙歧桿菌NCC2950或其組合。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的用途，其中所述熱處理是在約70-150°C的溫度范圍進(jìn)行約3分鐘-2小時(shí)，優(yōu)選在80-140°C的范圍進(jìn)行5分鐘-40分鐘。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的用途，其中所述疾病選自感染，特別是細(xì)菌、病毒、真菌和/或寄生蟲感染；吞噬細(xì)胞缺陷；低至嚴(yán)重的免疫抑制水平例如由壓力或免疫抑制藥物、化學(xué)療法或放射療法誘導(dǎo)的那些；自然狀態(tài)下較低免疫活性的免疫系統(tǒng)例如新生兒或老年人的；過敏；及其組合。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的用途，其中所述組合物選自食物組合物、食品包括寵物食物、飲料、營(yíng)養(yǎng)配方、飼料配方、營(yíng)養(yǎng)食品、食物添加劑、藥物組合物、化妝品組合物、藥物。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的用途，其中所述組合物還包括疼痛或發(fā)熱緩解劑、穩(wěn)定劑、芳香劑、著色劑、潤(rùn)滑劑、益生菌和/或益生元。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的用途，其中所述組合物計(jì)劃用于人或?qū)櫸铩?br> 8.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的用途，其中所述組合物含有相應(yīng)于約IO4至IO12Cfu/每日劑量的非復(fù)制性益生菌的量。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的用途，其中所述組合物含有約O.005mg-1000mg非復(fù)制性益生菌/每日劑量。
10.包含非復(fù)制性益生菌的組合物，其中益生菌選自乳桿菌屬、雙歧桿菌屬或其組合，例如副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、乳酸雙歧桿菌、短雙歧桿菌或其組合，例如菌株副干酪乳桿菌NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007、長(zhǎng)雙歧桿菌NCC3001、乳酸雙歧桿菌NCC2818、短雙歧桿菌NCC2950或其組合，其中所述益生菌通過在約70_150°C的溫度范圍熱處理約3分鐘-2小時(shí)，優(yōu)選在80-140°C的范圍熱處理5分鐘-40分鐘而致使其不復(fù)制。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的組合物，含有約0.005mg-1000mg非復(fù)制性益生菌/每日劑量。
12.增加益生菌治療或預(yù)防涉及受損免疫防御的疾病的療效的方法，特別是選自乳桿菌屬、雙歧桿菌屬或其組合的益生菌，例如副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、乳酸雙歧桿菌、短雙歧桿菌或其組合，例如菌株副干酪乳桿菌NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007、長(zhǎng)雙歧桿菌NCC3001、乳酸雙歧桿菌NCC2818、短雙歧桿菌NCC2950或其組合，包括步驟在施用前將所述益生菌經(jīng)過熱處理，優(yōu)選在約70-150°C的溫度范圍進(jìn)行約3分鐘-2小時(shí)，優(yōu)選在80-140°C的范圍進(jìn)行5分鐘-40分鐘，其中所述益生菌的熱處理導(dǎo)致至少95%，優(yōu)選至少97. 5%，更優(yōu)選至少99%，最優(yōu)選所有的益生菌不復(fù)制。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，以增加益生菌治療或預(yù)防涉及受損免疫防御的疾病的療效。
14.根據(jù)權(quán)利要求12-13之一的方法，包括將非復(fù)制性益生菌添加到計(jì)劃施用的組合物中的步驟。
15.根據(jù)權(quán)利要求12-13之一的方法，和/或包括向組合物中添加可復(fù)制的益生菌以及在施用前使含益生菌的組合物經(jīng)過熱處理的步驟。
全文摘要
本發(fā)明一般涉及益生菌領(lǐng)域。特別的是，本發(fā)明涉及非復(fù)制性益生菌，例如乳桿菌屬(Lactobacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)或其組合，例如副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、乳酸雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)或其組合，以及這類細(xì)菌的應(yīng)用。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及非復(fù)制性益生菌及其用于制備治療或預(yù)防涉及受損免疫防御的疾病的組合物的用途。描述了增加益生菌治療或預(yù)防免疫疾病的方法。
文檔編號(hào)A61K35/74GK102724987SQ201080031176
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2010年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月11日
發(fā)明者A·梅賽尼爾, G·普里烏特, S·努特恩 申請(qǐng)人:雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司