專利名稱：基于基因芯片的水體中13種病原微生物同步快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
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本發(fā)明屬于環(huán)境科學(xué)與工程技術(shù)。
背景技術(shù)：
現(xiàn)階段國內(nèi)外常用于檢測和鑒定致病微生物的方法主要有傳統(tǒng)生化鑒定法、免疫學(xué)檢測技術(shù)、PCR等一些簡單的分子生物學(xué)和免疫學(xué)方法。傳統(tǒng)生化鑒定法(如分離培養(yǎng)、生化鑒定等)應(yīng)用最廣泛，是《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)(GB/T 4789-2003 )等國標(biāo)檢測程序，該方法能夠得到樣品中細(xì)菌數(shù)量和特性等方面的定性及定量結(jié)果，但是大都需要經(jīng)過前增菌、增菌、選擇性平板分離、生物化學(xué)試驗(yàn)和血清學(xué)分型鑒定4個(gè)步驟，整個(gè)過程通常需要3 7天，檢測周期長，并且要求所要檢測的細(xì)菌增殖為可見菌落，另外，培養(yǎng)基制備、細(xì)菌培養(yǎng)、菌落計(jì)數(shù)和生化指標(biāo)的檢測都增加了實(shí)驗(yàn)室的工作量，并且檢測靈敏度低，不能實(shí)現(xiàn)有效的實(shí)時(shí)快速監(jiān)測和防控。免疫學(xué)檢測技術(shù)主要是采用酶聯(lián)免疫分析(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay, ELISA), ELISA是把抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性和酶的高效催化作用有機(jī)地結(jié)合起來的一種檢測技術(shù)，既可測抗原，也可測抗體，可進(jìn)行定性和定量測定，基本原理是預(yù)先結(jié)合在固相載體上的抗體或抗原分子與樣品中的抗原或抗體分子在一定條件下進(jìn)行免疫學(xué)反應(yīng)。該法可檢測沙門氏菌、軍團(tuán)菌、大腸桿菌0157等致病微生物。免疫學(xué)檢測技術(shù)簡單、方便，較傳統(tǒng)檢測技術(shù)快速，但存在交叉反應(yīng)比較嚴(yán)重、假陽性多、靈敏度偏低等不足之處。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Ploymerase Chain Reaction, PCR)是一種體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，其基本原理是在體外適宜的條件(如鎂離子濃度)和Taq DNA聚合酶的作用下，利用游離的脫氧核糖核苷酸(dNTP)，以目標(biāo)基因組DNA上正、反相兩引物間的特定的雙鏈DNA片段(或稱靶DNA)進(jìn)行高效擴(kuò)增，故又稱基因體外擴(kuò)增法。一般的PCR需要經(jīng)過預(yù)變性，變性、退火、延伸的25 35次循環(huán)，可將靶DNA序列擴(kuò)增近百萬倍，經(jīng)瓊脂糖或聚丙烯酰氨凝膠電泳和染色劑如溴化乙錠(EB)染色后在紫外光下觀測到相應(yīng)的條帶。PCR雖為一種特異、靈敏、簡便快速的檢測技術(shù)，但該方法需要較長時(shí)間的樣品純化處理過程，且一旦有極少量外源性DNA污染，就可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果；多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增，各種實(shí)驗(yàn)條件控制不當(dāng)，很容易導(dǎo)致擴(kuò)增失敗或非特異性產(chǎn)物；引物的設(shè)計(jì)及靶序列的選擇不當(dāng)?shù)榷伎赡芙档推潇`敏度和特異性；同時(shí)，一次一般只能檢測一種或少數(shù)幾種微生物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提出一種基于基因芯片的水體中13種病原微生物同步快速檢測方法。本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
一種基于基因芯片的水體中13種病原微生物同步快速檢測方法，采用多重PCR擴(kuò)增13種致病微生物大腸埃希菌、腸出血性大腸桿菌0157:H7、嗜肺軍團(tuán)菌、腸炎沙門菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、幽門螺旋桿菌、結(jié)核分枝桿菌、肺炎克雷伯菌、霍亂弧菌、炭疽桿菌和鼠疫耶爾森菌的特異性基因序列片段，再通過基因芯片雜交和芯片掃描圖像分析，獲得檢測結(jié)果。所述方法具體包括以下步驟
(1)水樣處理
采集水樣，用無菌塑料瓶封裝，室溫靜置，取上清液加入濃縮儀進(jìn)行濃縮集菌，然后抽干濾膜，取出放入離心管內(nèi)，剪成細(xì)末狀；
(2)DNA模板提取采用E. Z. N. A. Bacterial DNA Kit (D3350-01)試劑盒或者具有同等作用的其他商業(yè)化DNA提取試劑盒進(jìn)行核酸提取，取IOuL樣本DNA進(jìn)行下一步程序；
(3)多重PCR擴(kuò)增目的片段
采用15 ii L的PCR體系，包括10 X PCR Taq酶緩沖液I. 0 — 2. Oii L，濃度為2. 5 mmol/L的dNTPO. I — 0. L，濃度為10 — 20 u mol/L的各種混合引物(指13種病源微生物的引物)0. 4 - 0. 8 u L, 50 X T-Taq DNA 聚合酶 0. I — 0. 5 y L，DNA 模板 0. 5 — I. 5 y L，雙蒸水補(bǔ)至15 ii L ;
PCR循環(huán)參數(shù)
95°C預(yù)變性3 min，接著作30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94°C變性30s，68°C退火并延伸30s ;循環(huán)結(jié)束后68°C延伸5 min ;PCR產(chǎn)物4°C保存?zhèn)溆茫?br> (4)樣本標(biāo)記
在15 ii L的SBE-tags熒光標(biāo)記反應(yīng)體系(單堿基延伸標(biāo)簽SBE-tags)中含IOXReaction Bufferl. 0 — 2. 0 u L，混合 SBE-tags 引物(10 — 20 y mol/L)各 0. 4 — 0. 8U L, Cy3-ddATP( 10 u mol/L)0. 1 — 0.5 u L, Sequencing 多聚酶(5 U/ y L)0. I — 0. 5 u L,多重PCR純化產(chǎn)物2 — 6 ii L，雙蒸水補(bǔ)至15 ii L ;循環(huán)參數(shù)96°C預(yù)變性3min，接著作36個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括96°C變性30 s，60°C退火30s，72°C延伸20 s ;循環(huán)結(jié)束后在72°C延伸5 min ;標(biāo)記產(chǎn)物避光保存于4°C ；
(5)芯片雜交與洗片
芯片雜交前使用預(yù)雜交液進(jìn)行預(yù)雜交處理，之后將熒光標(biāo)記產(chǎn)物、陽性質(zhì)控和雜交液混合均勾后，滴加在芯片上，在48 C雜交2 ho雜交完成后，洗片；
(6)芯片掃描圖像分析；根據(jù)芯片排布圖(如圖1)，分析確定樣本中所含微生物的種類。發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及積極效果
本檢測方法采用基于單堿基延伸標(biāo)簽反應(yīng)的基因芯片技術(shù)(上面的(4)步驟可以看出)與多重PCR方法聯(lián)用，優(yōu)化了上述13種致病菌的基因芯片檢測方法，具有較強(qiáng)的特異性、靈敏度和實(shí)際檢測的適用性。用常規(guī)的方法檢測上述13種致病菌，需要的時(shí)間至少為兩天，而對(duì)于李斯特菌的常規(guī)檢測方法全過程至少需要四至七天，本檢測方法可將整個(gè)檢測時(shí)間縮短至8小時(shí)以內(nèi)，比現(xiàn)有的細(xì)菌學(xué)診斷更快速、簡便、經(jīng)濟(jì)和實(shí)用，并且同時(shí)檢測多種致病菌。通常水體中的病原微生物含量相對(duì)較少，尤其是水源水體，有時(shí)部分病原微生物處于亞致死狀態(tài)，這就需要一個(gè)前增菌過程以達(dá)到系統(tǒng)的檢測限。本檢測方法采用Milliflex Plus濃縮儀或者可以達(dá)到濃縮收集效果的類似儀器，對(duì)水樣進(jìn)行前期濃縮集菌后，就可以快速地完成微量病原微生物的快速檢測。通過對(duì)水樣的濃縮集菌，基因芯片對(duì)致病菌的檢出率達(dá)到5. OXlO2 cfu/mL，較原來提高了 100倍。本檢測方法具備重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、靈敏度及特異性高、操作簡單、高通量及快速檢測等諸多優(yōu)點(diǎn)，為水體致病菌檢測技術(shù)的發(fā)展提供了良好的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。


圖I是基因芯片不意 圖2是自然水體芯片雜交結(jié)果，其中A表示4號(hào)水樣檢測，B表示8號(hào)水樣檢；C表示14號(hào)水樣；
圖3是使用BLAST進(jìn)行序列比對(duì)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明的內(nèi)容
本方法主要針對(duì)水中可能存在的和突發(fā)公共事件發(fā)生時(shí)可能進(jìn)入水中的13種致病微生物，其名稱見下表。表I檢測對(duì)象
權(quán)利要求
1.一種基于基因芯片的水體中13種病原微生物同步快速檢測方法，所述方法是采用多重PCR同時(shí)擴(kuò)增病原微生物的特異性基因片段，再通過基因芯片雜交和芯片掃描圖像分析，獲得檢測結(jié)果；所檢測的13種病原微生物包括大腸埃希菌、腸出血性大腸桿菌0157:H7、嗜肺軍團(tuán)菌、腸炎沙門菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、幽門螺旋桿菌、結(jié)核分枝桿菌、肺炎克雷伯菌、霍亂弧菌、炭疽桿菌和鼠疫耶爾森菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測方法，其特征在于所述方法具體包括以下步驟 (1)水樣處理 采集水樣，用無菌塑料瓶封裝，室溫靜置，取上清液加入濃縮儀進(jìn)行濃縮集菌，然后抽干濾膜，取出放入離心管內(nèi)，剪成細(xì)末狀； (2)DNA模板提取 采用E. Z. N. A. Bacterial DNA Kit (D3350-01)試劑盒，或者具有同等作用的其他商業(yè)化DNA提取試劑盒提取樣本的DNA，取IOuL樣本DNA進(jìn)行下一步程序； (3)多重PCR擴(kuò)增目的片段 采用15 ii L的PCR體系，包括10 X PCR Taq酶緩沖液I. 0 — 2. Oii L，濃度為2. 5 mmol/L 的 dNTPO. I — 0. L，引物各 0. 4 — 0. L，濃度為 10 — 20 y mo I/L，50 X T-Taq DNA 聚合酶0. I — 0.5 iiL，DNA模板0.5 — I. 5 y L，雙蒸水補(bǔ)至15 y L ;所述引物是指13種病原微生物的引物； PCR循環(huán)參數(shù)95°C預(yù)變性3 min，接著作30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94°C變性30s，68°C退火并延伸30s ;循環(huán)結(jié)束后68°C延伸5 min ;產(chǎn)物4°C保存?zhèn)溆茫? (4)樣本標(biāo)記 采用單堿基延伸標(biāo)簽反應(yīng)(SBE-tags)進(jìn)行；15 ii L的SBE-tags反應(yīng)體系含10 X Reaction Buffer I. 0 — 2. 0 u L, SBE-tags 引物(10 — 20 u mol/L) 0. 4 — 0. 8 u L,濃度為 10 u mol/L 的 Cy3_ddATP 0. I — 0. 5 u L,活性濃度為 5 U/ u L 的 Sequencing 多聚酶0. I — 0. 5 ii L，多重PCR純化產(chǎn)物2 — 6 ii L，雙蒸水補(bǔ)至15 y L ;循環(huán)參數(shù)96°C預(yù)變性3min，接著作36個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括96°C變性30 s，60°C退火30s，72°C延伸20 s ;循環(huán)結(jié)束后在72°C延伸5 min ； 標(biāo)記產(chǎn)物避光保存于4°C ； (5)芯片雜交與洗片 芯片雜交前使用預(yù)雜交液進(jìn)行預(yù)處理Ih以去除玻璃基片上多余的活性醛基基團(tuán)，之后將SBE產(chǎn)物、熒光質(zhì)控探針和雜交緩沖液加入，在48°C雜交2 h，雜交結(jié)束后洗片，除去芯片上未雜交上的成分； (6)芯片掃描，根據(jù)掃描結(jié)果，進(jìn)行圖像分析，判斷樣本中所含有的微生物種類。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測方法，其特征在于所述基因芯片可同時(shí)檢測水體中13種致病微生物，芯片上同時(shí)含有陽性質(zhì)控位點(diǎn)、陰性質(zhì)控位點(diǎn)、以及空白對(duì)照等位點(diǎn)；所述芯片的所有探針在5’端均修飾有氨基。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測方法，其特征在于所述芯片在進(jìn)行預(yù)雜交處理之后，進(jìn)行熒光標(biāo)記的樣本雜交，雜交完成后洗滌、甩干，進(jìn)行芯片掃描，分析掃描圖像，確定樣本中含有的微生物種類。
全文摘要
一種基于基因芯片的水體中13種病原微生物同步快速檢測方法，所述方法是采用多重PCR同時(shí)擴(kuò)增病原微生物的特異性基因片段，再通過基因芯片雜交和芯片掃描圖像分析，獲得檢測結(jié)果；所檢測的13種病原微生物包括大腸埃希菌、腸出血性大腸桿菌O157:H7、嗜肺軍團(tuán)菌、腸炎沙門菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、幽門螺旋桿菌、結(jié)核分枝桿菌、肺炎克雷伯菌、霍亂弧菌、炭疽桿菌和鼠疫耶爾森菌。
文檔編號(hào)C12Q1/14GK102703589SQ20121017285
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月9日
發(fā)明者張春秀, 敖漉, 方振東, 王大勇, 謝朝新, 陳金絲, 馬穎 申請(qǐng)人:上海生物芯片有限公司, 中國人民解放軍后勤工程學(xué)院