專利名稱：一種凝結(jié)芽孢桿菌及其在混合發(fā)酵產(chǎn)l-乳酸中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種凝結(jié)芽孢桿菌及其在混合發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸中的應(yīng)用，屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乳酸是一種古老且重要的有機(jī)酸，乳酸、乳酸鹽及其衍生產(chǎn)物，被廣泛應(yīng)用于藥品、醫(yī)藥、飼料、化工的等領(lǐng)域。在食品工業(yè)上廣泛用作酸味劑、防腐劑和還原劑。乳酸，尤其是L-乳酸具有很強(qiáng)的殺菌作用，可直接用作手術(shù)室、病房、實驗室等場所的消毒劑。L-乳酸、L-乳酸鈉與葡萄糖、氨基酸等復(fù)合配制成輸液，可治療酸中毒及高鉀血癥。乳酸可添加至煙草中，能保持煙草的濕度，提高卷煙的質(zhì)量。還可以用來處理紡織纖維，可使之易于著 色，增加光澤等。L-乳酸經(jīng)聚合可生成立鏈的或環(huán)狀的聚乳酸，在人體內(nèi)能被分解成L-乳酸為人體代謝，因此可用于生產(chǎn)緩釋膠囊制劑、生物降解纖維、生物降筋塑料、生物植片等。聚L-乳酸在自然條件下緩慢分解，它不像PVC、PP塑料那樣造成“白色污染”。因此在制造食品包裝材料和農(nóng)用薄膜等方面有很大的潛力。由此可見，L-乳酸的發(fā)展前景十分誘人。乳酸可以通過化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法(同型乳酸發(fā)酵、異型乳酸發(fā)酵)及酶法幾種方法合成得到。由于微生物發(fā)酵能夠?qū)I(yè)得到L-乳酸且無污染，因此發(fā)酵法被廣泛應(yīng)用于L-乳酸的生產(chǎn)。目前國內(nèi)外多以米根霉、德氏乳桿菌等進(jìn)行L-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)。根霉屬于異型乳酸發(fā)酵，營養(yǎng)要求簡單，但轉(zhuǎn)化率相對較低，且發(fā)酵產(chǎn)物光學(xué)純度不高。乳酸細(xì)菌屬于同型乳酸發(fā)酵，轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)物光學(xué)純度也較高，屬于化能異養(yǎng)型微生物，必須由外界提供多種營養(yǎng)物質(zhì)及生長因子，如氨基酸、維生素、核酸堿基等。自然界中產(chǎn)L-乳酸能力強(qiáng)，并可應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的菌種只有霉菌中德根霉屬及細(xì)菌中的乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、鏈球菌屬。為了提高發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)制備成本，提高生產(chǎn)質(zhì)量，國內(nèi)外對其生產(chǎn)過程進(jìn)行了大量研究，主要包括生產(chǎn)菌種誘變改良、低價原料的開發(fā)利用、發(fā)酵工藝的優(yōu)化等方面。由此可見，提高L-乳酸發(fā)酵產(chǎn)物光學(xué)純度、提高發(fā)酵糖酸轉(zhuǎn)化率、提高產(chǎn)物耐高糖能力等已經(jīng)成為發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的研究熱點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一在于提供一種凝結(jié)芽孢桿菌及其誘變選育方法，使其發(fā)酵產(chǎn)物L(fēng)-乳酸產(chǎn)量大幅度提高。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二在于提供所述凝結(jié)芽孢桿菌在混合發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸中的應(yīng)用。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
一種凝結(jié)芽抱桿菌(BacillusBC-N6242,已于2012年5月10日保藏于中
國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號CCTCC M 2012156。本發(fā)明所述的凝結(jié)芽孢桿菌BC-N6242的篩選方法是凝結(jié)芽孢桿菌BC-3出發(fā)菌株經(jīng)低能氮離子注入誘變后，利用高糖平板、琥珀酸平板、純?nèi)樗崞桨搴Y選得到耐高糖、EMP途徑強(qiáng)化且不分解利用乳酸的菌株。然后將所得的菌株按一定比例與干酪乳桿菌LC-N235混合接入發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)搖瓶發(fā)酵篩選出發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸含量最高的凝結(jié)芽孢桿菌作為下一輪誘變篩選的出發(fā)菌株，重復(fù)上述過程，直至篩選到目標(biāo)菌株，即凝結(jié)芽孢桿菌{Bacillus coagulans) BC-N6242。本發(fā)明誘變得到的凝結(jié)芽孢桿菌BC-N6242菌株的形態(tài)學(xué)及生理生化學(xué)特征如下
菌落顏色米白色；
需氧方式兼性厭氧；
菌落大小2 6mm ；
適宜生長溫度4(T45°C ；
適宜生長pH :7. 0 7.4 ;
菌落形態(tài)圓形；
革蘭氏染色陽性；
本發(fā)明所提供的凝結(jié)芽孢桿菌BC-N6242的誘變方法，具體步驟如下
(a)、單孢子懸浮液制備將凝結(jié)芽孢桿菌BC-3出發(fā)菌株孢子制成孢子懸液，調(diào)整孢子濃度為IO6個/毫升。(b)、低能氮離子注入誘變?nèi)?. ImL的步驟(a)中孢子懸液均勻涂布于無菌平皿上，以無菌風(fēng)吹干，在20KeV、注入劑量為180X1013ionS/Cm2下對其進(jìn)行氮離子注入，離子注入完畢后，取出平皿，在無菌環(huán)境下用ImL無菌水洗脫，涂布到高糖平板培養(yǎng)基上；在40 45°C下倒置培養(yǎng)2 3d。(C)、琥珀酸平板初篩將步驟(b)篩選到的能生長良好且透明圈大的菌株挑接至琥珀酸平板培養(yǎng)基上，在4(T45°C下倒置培養(yǎng)2 3d，篩選菌株。(d)、純?nèi)樗崞桨宄鹾Y將步驟(C)篩選到比出發(fā)菌株延遲出現(xiàn)菌落的單菌落挑接至純?nèi)樗崞桨迮囵B(yǎng)基上，在4(T45°C下倒置培養(yǎng)2 3d，篩選在純?nèi)樗崞桨迳喜荒苌L的菌株。(e)、發(fā)酵復(fù)篩將步驟(d)篩選出的凝結(jié)芽孢桿菌接入斜面培養(yǎng)基，在4(T45°C下培養(yǎng)f 2d，取斜面培養(yǎng)物接入種子培養(yǎng)基在4(T45°C下擴(kuò)培12 20h。取種子液與干酪乳桿菌LC-N235種子液按比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量59Tl5% (v/v)，250mL搖瓶裝液量2(T50mL，發(fā)酵溫度4(T45°C，發(fā)酵3(T50h后測定L-乳酸含量，篩選出發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸含量最高的凝結(jié)芽孢桿菌作為下一輪誘變篩選的出發(fā)菌株，重復(fù)上述步驟直至篩選到目標(biāo)菌株，即凝結(jié)芽孢桿菌BC-N6242。在上述篩選方法中步驟(b)所采用的高糖平板培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分碳源25% 35%、氮源I. 0% 2. 0%、無機(jī)鹽0. 02% 0. 08%、中和劑2% 4%，瓊脂I. 0% 1. 5%,其余為水，pH 7. (T7. 4 ;其中所述碳源為葡萄糖和淀粉中的一種或兩種的混合；氮源為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或幾種的混合；無機(jī)鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽和磷酸鹽中的一種或幾種的混合；中和劑為重質(zhì)碳酸鈣。步驟(c)所采用的琥珀酸平板培養(yǎng)基以259^35%的琥珀酸代替高糖培養(yǎng)基中碳源，其他成分不變。步驟(d)所采用的純?nèi)樗崞桨迮囵B(yǎng)基以
0.49TO. 6%的乳酸代替高糖培養(yǎng)基中碳源，其他成分不變。在上述篩選方法中步驟(b)所采用的斜面培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分碳源0. 4% 0. 6%、氮源I. 0% 2. 0%、無機(jī)鹽0. 02% 0. 08%、中和劑0. 2% 0. 4%，瓊脂
I.09T1. 5%，其余為水，pH 7. (T7. 4 ;其中所述碳源為葡萄糖和淀粉中的一種或兩種的混合；氮源為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或幾種的混合；無機(jī)鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽和磷酸鹽中的一種或幾種的混合；中和劑為重質(zhì)碳酸鈣。在上述篩選方法中步驟(e)所采用的種子培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分碳源4% 8%、氮源I. 0% 5. 0%、無機(jī)鹽0. 02% 0. 08%、中和劑2% 4%，其余為水，pH 7. 0 7. 4 ；其中所述碳源為葡萄糖、淀粉中的一種或幾種；氮源為蛋白胨、牛肉膏和酵母膏中的一種或多種；無機(jī)鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、磷酸鹽中的一種或幾種混合；中和劑為重質(zhì)碳酸鈣。在上述篩選方法中步驟(e)所采用的發(fā)酵培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分碳源10% 20%、氮源I. 0% 3. 0%、無機(jī)鹽0. 02% 0. 08%、中和劑5% 10%，其余為水，pH
7.(T7. 4 ;其中所訴碳源為葡萄糖、玉米粉糖化液、大米糖化液、蔗糖中的一種或幾種；氮源為蛋白胨、酵母膏、牛肉膏中的一種或幾種混合；無機(jī)鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽磷酸鹽中的一種 或多種；中和劑為重質(zhì)碳酸鈣。本發(fā)明混合發(fā)酵所用的干酪乳桿菌{LactobaciIluscase已于2012年5月10日，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號CCTCC M 2012157。所述的凝結(jié)芽孢桿菌BC-N6242與干酪乳桿菌LC-N235在混合發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸中的應(yīng)用。包含如下步驟
1)、平板培養(yǎng)將凝結(jié)芽孢桿菌BC-N6242和干酪乳桿菌LC-N235分別接種至平板基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35 45°C，培養(yǎng)時間為2 3 d ；
2)、斜面培養(yǎng)將步驟I)平板培養(yǎng)的兩種菌分別接種至斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35 45°C，培養(yǎng)時間I 2 d ；
3)、種子培養(yǎng)將步驟2)中的兩種菌的斜面培養(yǎng)物分別接種至種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35 45°C，250ml搖瓶裝液量l(T30ml，培養(yǎng)時間12 20h ；
4)、混合發(fā)酵將步驟3)中的兩種菌的種子培養(yǎng)液按凝結(jié)芽孢菌BC-N6242:干酪乳桿LC-N235=(0. 5 2) :1的比例接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量5 15%(v/v)，250ml搖瓶裝液量2(T50ml，發(fā)酵溫度40 45 V，發(fā)酵培養(yǎng)30 50h。所述步驟I)平板基本培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分碳源4%飛％、氮源
I.0% 2. 0%、無機(jī)鹽0. 02% 0. 08%、中和劑2% 4%，瓊脂I. 0% 1. 5%、其余為水，pH 7. 0 7. 4 ;其中所述碳源為葡萄糖和淀粉中的一種或兩種的混合；所述氮源為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或幾種的混合；所述無機(jī)鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽和磷酸鹽中的一種或幾種的混合；所述中和劑為重質(zhì)碳酸鈣。所述斜面培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分碳源0. 390). 6%、氮源I. 09T2. 0%、無機(jī)鹽0. 02% 0. 08%、中和劑0. 2% 0. 4%、瓊脂I. 0% 1. 5%、其余為水，pH 7. 0 7. 4 ;其中所述碳源為葡萄糖和淀粉中的一種或兩種的混合；所述氮源為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或幾種的混合；所述無機(jī)鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽和磷酸鹽中的一種或幾種的混合；所述中和劑為重質(zhì)碳酸鈣。所述種子培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分碳源49T8%、氮源19T5%、無機(jī)鹽0. 029T0. 08%,中和劑29T4%，其余為水，pH 7. (T7. 4 ;其中所述碳源為葡萄糖和淀粉中的一種或兩種的混合；所述氮源為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或幾種的混合；所述無機(jī)鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、磷酸鹽中的一種或幾種的混合；所述中和劑為重質(zhì)碳酸鈣。所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分碳源109^20%、氮源I. 09T3. 0%、無機(jī)鹽0. 02% 0. 08%、中和劑5. 0% 10. 0%，其余為水，pH 7. 0 7. 4 ;其中所述碳源為葡萄糖、玉米粉糖化液、大米糖化液、蔗糖中的一種或多種的混合；所述氮源為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或多種的混合；所述無機(jī)鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽和磷酸鹽中的一種或幾種的混合；所述中和劑為重質(zhì)碳酸鈣。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明采用低能氮離子注入誘變凝結(jié)芽胞桿菌BC-3出發(fā)菌株，利用高糖平板、琥珀酸平板、純?nèi)樗崞桨搴Y選出能夠耐高糖、EMP途徑強(qiáng)化且不分解利用乳酸的菌株，再通過“混合發(fā)酵實驗”篩選出高產(chǎn)菌株作為下一輪誘變的出發(fā)菌株，直至篩選到目標(biāo)菌株，即凝結(jié)芽胞桿菌BC-N6242。最后將其與干酪乳桿菌LC-N235按2:1的比例混合接入發(fā)酵培養(yǎng)基，該混合菌株能高效地利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸，糖酸轉(zhuǎn)化率高，且能有效的縮短發(fā)酵時間。在5L發(fā)酵罐中，按凝結(jié)芽孢菌BC-N6242 :干酪乳桿LC-N235=2:1的比例，L-乳酸產(chǎn)量達(dá)到了 235g/L，比同等培養(yǎng)條件下的干酪乳桿菌LC-N235或凝結(jié)芽胞桿菌BC-3原始出發(fā)菌株或凝結(jié)芽孢桿菌BC-N6242單獨發(fā)酵分別提高了 45. 1%、 57. 7%、14. 6%，具有重大的社會意義和經(jīng)濟(jì)價值。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實施例I
本實施例說明將凝結(jié)芽孢桿菌原始菌株進(jìn)行低能氮離子注入誘變篩選的方法。進(jìn)行第一步低能氮離子注入誘變篩選的具體步驟如下
(a)、單孢子懸浮液制備取4(T45°C恒溫培養(yǎng)2 3d的凝結(jié)芽孢桿菌BC-3原始出發(fā)菌株新鮮斜面加無菌水10mL，刮洗下孢子傾于帶有一定玻璃珠的250mL三角瓶內(nèi)震蕩搖勻20min (250rpm)，打散孢子鏈，三層脫脂紗布過濾，濾液用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整孢子濃度IO6個/暈升。(b)、低能氮離子注入誘變?nèi)?. ImL步驟(a)中孢子懸液均勻涂布于無菌平皿上，鏡檢無細(xì)胞重疊者進(jìn)行低能氮離子注入。本實驗低能氮離子注入機(jī)為離子束生物工程裝置。在20KeV的能量下對干酪乳桿菌進(jìn)行離子注入。注入劑量為180X1013ions/cm2，靶室真空度為10_3Pa，以20S脈沖式注入，間隔15s，靶室內(nèi)放置不接受注入的對照樣。離子注入完畢后，取出平皿，在無菌環(huán)境下用Iml無菌水洗脫，涂布到高糖平板培養(yǎng)基上，在4(T45°C下倒置培養(yǎng)2 3d。(C)、誘變菌株的篩選
琥珀酸平板初篩將步驟(b)篩選到的生長良好且透明圈大的單菌株挑接至琥珀酸平板培養(yǎng)基上，在4(T45°C下倒置培養(yǎng)2 3d，篩選比出發(fā)菌株延遲出現(xiàn)菌落的菌株。純?nèi)樗崞桨宄鹾Y將琥珀酸平板上篩選到生長良好且透明圈大的單菌落挑接至高乳酸平板培養(yǎng)基上，在4(T45°C下倒置培養(yǎng)2 3d，篩選在純?nèi)樗崞桨宀簧L的菌株。發(fā)酵復(fù)篩將初篩最終篩選到的菌株的單菌落和干酪乳桿菌LC-N235分別接至斜面培養(yǎng)基，在35 45°C條件下培養(yǎng)f2d ;將斜面培養(yǎng)物分別接入種子培養(yǎng)基在35 45°C、5(Tl20rmp搖床轉(zhuǎn)速下擴(kuò)培12 20h。取篩選到的菌株的種子液與干酪乳桿菌LC-N235混合發(fā)酵復(fù)篩，即初篩得到的所有凝結(jié)芽孢桿菌與干酪乳桿菌LC-N235按比例混合接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量5% 15% (v/v)，250mL搖瓶裝液量2(T50mL，發(fā)酵溫度35 45°C，發(fā)酵發(fā)酵時間3(T50h ;測定混合發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的含量，篩選出混合發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸含量最高的凝結(jié)芽孢桿菌作為下一輪誘變篩選的出發(fā)菌株，直至篩選到目標(biāo)菌株，即凝結(jié)芽孢桿菌BC-N6242。其中，所使用的培養(yǎng)基配方(％為質(zhì)量百分比)
步驟(b)中所用的高糖平板培養(yǎng)基為葡萄糖30%，蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.3%，硫酸鎂0.05%，碳酸鈣3%，瓊脂I. 2%，其余為蒸餾水，pH 7.0。步驟(c)中所用的琥珀酸平板培養(yǎng)基以8%琥珀酸代替高糖培養(yǎng)基中“葡萄糖30%”，其他成分不變。所用的純?nèi)樗崞桨迮囵B(yǎng)基以5%乳酸代替中高糖培養(yǎng)基中“葡萄糖30%”，其他成分不變。 步驟(a)和(C)中所用的斜面培養(yǎng)基為葡萄糖0. 5%，蛋白胨1%，牛肉膏0. 3%，酵母膏0. 3%，硫酸鎂0. 05%，碳酸鈣0. 3%，瓊脂I. 2%，其余為蒸餾水，pH 7. O。步驟(c)中所用的種子培養(yǎng)基為葡萄糖6%，蛋白胨1%，酵母膏1.0%，硫酸鎂0.05%，碳酸鈣3%，其余為蒸餾水，pH 7.0。步驟(c)中所用的發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖15%，蛋白胨0. 05%，酵母膏I. 5%，硫酸鎂0.05%，碳酸鈣7.5%，其余為蒸餾水，pH 7.0。發(fā)酵結(jié)束后檢測各菌株L-乳酸含量如表I所示
表I
I ~干酪乳桿菌"""凝結(jié)芽孢桿菌BC-3 '凝結(jié).嘗孢桿菌I
I萬LC-K235出發(fā)菌株BC-K6262
發(fā)酵吋間(h)^^ 40^I I I
L-乳酸含量(gL)162149205
經(jīng)過平板組合篩選及單因素混合發(fā)巾選獲得的凝結(jié)芽孢桿菌突變株在發(fā)酵過程中L-乳酸產(chǎn)量明顯高于出發(fā)菌株。實施例2
本實施例說明高產(chǎn)菌株凝結(jié)芽孢桿菌BC-N6262以及干酪乳桿菌LC-N235的遺傳穩(wěn)定性。傳代發(fā)酵試驗結(jié)果如表2所示
表權(quán)利要求
1.一種凝結(jié)芽孢桿菌(feci77m coa講7aas)BC-N6242，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心 CCTCC，保藏編號CCTCC M 2012156。
2.權(quán)利要求I所述的凝結(jié)芽孢桿菌BC-N6242與干酪乳桿菌LC-N235在混合發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于包含如下步驟 1)、平板培養(yǎng)將凝結(jié)芽孢桿菌BC-N6242和干酪乳桿菌LC-N235分別接種至平板基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為4(T45°C，培養(yǎng)時間為2 3 d ； 2)、斜面培養(yǎng)將步驟I)平板培養(yǎng)的兩種菌分別接種至斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為40 45°C，培養(yǎng)時間I 2 d ; 3)、種子培養(yǎng)將步驟2)中的兩種菌的斜面培養(yǎng)物分別接種至種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培 養(yǎng)溫度為35 45°C，250ml搖瓶裝液量l(T30ml，培養(yǎng)時間12 20h ； 4)、混合發(fā)酵將步驟3)中的兩種菌的種子培養(yǎng)液按凝結(jié)芽孢菌BC-N6242:干酪乳桿LC-N235=(0. 5 2) :1的比例接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量5 15%(v/v)，250ml搖瓶裝液量2(T50ml，發(fā)酵溫度35 45 V，發(fā)酵培養(yǎng)30 50 h。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述步驟(I)平板基本培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分碳源4% 6%、氮源I. 09T2. 0%、無機(jī)鹽0. 029T0. 08%、中和劑2% 4%，瓊脂I.09T1. 5%、其余為水，pH 7. (T7. 4 ;其中所述碳源為葡萄糖和淀粉中的一種或兩種的混合；所述氮源為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或幾種的混合；所述無機(jī)鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽和磷酸鹽中的一種或幾種的混合；所述中和劑為重質(zhì)碳酸鈣。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述斜面培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分碳源0. 39TO. 6%、氮源I. 09T2. 0%、無機(jī)鹽0. 029T0. 08%、中和劑0. 2%"0. 4%、瓊脂I.09T1. 5%、其余為水，pH 7. (T7. 4 ;其中所述碳源為葡萄糖和淀粉中的一種或兩種的混合；所述氮源為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或幾種的混合；所述無機(jī)鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽和磷酸鹽中的一種或幾種的混合；所述中和劑為重質(zhì)碳酸鈣。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述種子培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分碳源4% 8%、氮源1% 5%、無機(jī)鹽0. 02% 0. 08%,中和劑2% 4%，其余為水，pH 7. 0 7. 4 ;其中所述碳源為葡萄糖和淀粉中的一種或兩種的混合；所述氮源為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或幾種的混合；所述無機(jī)鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、磷酸鹽中的一種或幾種的混合；所述中和劑為重質(zhì)碳酸鈣。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分碳源10% 20%、氮源I. 0% 3. 0%、無機(jī)鹽0. 02% 0. 08%、中和劑5. 0% 10. 0%，其余為水，pH7.(T7. 4 ;其中所述碳源為葡萄糖、玉米粉糖化液、大米糖化液、蔗糖中的一種或多種的混合；所述氮源為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或多種的混合；所述無機(jī)鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽和磷酸鹽中的一種或幾種的混合；所述中和劑為重質(zhì)碳酸鈣。
全文摘要
本發(fā)明公開一株凝結(jié)芽孢桿菌BC-N6242，保藏號登記號為CCTCCM2012156。本發(fā)明采用低能氮離子注入誘變凝結(jié)芽孢桿菌，分別利用高糖平板、琥珀酸平板、純?nèi)樗崞桨搴Y選，與干酪乳桿菌“混合發(fā)酵”篩選，直至最終篩選到目標(biāo)菌株。將該菌株與干酪乳桿菌LC-N235按比例混合發(fā)酵。在5L發(fā)酵罐中按2∶1的比例接入種子培養(yǎng)液后發(fā)酵培養(yǎng)48h，產(chǎn)物L(fēng)-乳酸的產(chǎn)量達(dá)到235g/L，較干酪乳桿菌LC-N235或凝結(jié)芽胞桿菌BC-3或凝結(jié)芽孢桿菌BC-N6242單獨發(fā)酵分別提高了45.1%、57.7%、14.6%，且有效縮短凝結(jié)芽胞桿菌單獨發(fā)酵時間24h，具有重大的社會意義和經(jīng)濟(jì)價值。
文檔編號C12R1/07GK102653725SQ201210172600
公開日2012年9月5日 申請日期2012年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月30日
發(fā)明者李玉燕, 虞龍, 錢夢宇, 陳曉雙, 黃思思, 龔文靜 申請人:南京工業(yè)大學(xué)