專利名稱：一種葡萄籽原花青素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種葡萄籽原花青素的制備方法，具體涉及ー種采用兩株真菌發(fā)酵葡萄籽漿后提取原花青素的方法，屬生物工程領(lǐng)域。
(ニ)
背景技術(shù)：
近年來(lái)，多酚類物質(zhì)的生物活性及對(duì)人體的保健防病作用日益受到廣泛關(guān)注。自由基被認(rèn)為是人體衰老和某些慢性疾病發(fā)生的原因之一。當(dāng)人體內(nèi)的自由基產(chǎn)生過(guò)多或清除過(guò)慢，就會(huì)轉(zhuǎn)而攻擊各種細(xì)胞，器官并使之受到損傷，加速機(jī)體的衰老過(guò)程并誘發(fā)各種疾病。多酚類化合物分子結(jié)構(gòu)中含有若干個(gè)酚羥基，對(duì)自由基有較強(qiáng)的清除能力，從而起到對(duì)生物組織的保護(hù)作用。原花青素是廣泛存在于植物中的ー類天然多酚類化合物，具有水溶、無(wú)毒、無(wú)過(guò)敏、安全性好等特性，是ー種天然的自由基清除劑和抗氧化劑，而且還有抗衰老，抗腫瘤，抗癌變，預(yù)防心腦血管疾病，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等功能。葡萄籽作為原花青素的重要來(lái)源之一，在國(guó)外已得到很好的利用.我國(guó)葡萄年產(chǎn)量約有200萬(wàn)噸，約有10%用于釀酒和加工果汁，其下角料葡萄籽約占鮮果總量的4% — 5%，這些葡萄廢棄物利用率很低，大部分作為飼料、燒材或被丟棄，不僅造成環(huán)境污染，對(duì)資源也是ー種浪費(fèi)。因此，研究和解決葡萄籽利用問(wèn)題，可以變廢為寶，防止環(huán)境污染，具有很好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。葡萄籽提取物原花青素是從葡萄籽中提取出的生物類黃酮，具有抗氧化活性，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域，其銷售額近年來(lái)一直位于美國(guó)膳食補(bǔ)充劑的前十名。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于葡萄籽花青素的提取方法主要有溶劑萃取法、微波法和超臨界CO2萃取法等，這些方法得到的產(chǎn)品得率和純度較低，主要原因在于原花青素在葡萄籽中與高分子纖維素和半纖維素形成致密的結(jié)合體，難以在溶劑或者微波狀態(tài)下打開(kāi)，直接導(dǎo)致提取效率較低。本發(fā)明采用兩株真菌復(fù)合發(fā)酵葡萄籽漿，將原花青素在葡萄籽中與高分子纖維素和半纖維素形成的致密結(jié)合體充分水解而使原花青素釋放出來(lái)，大大提高了原花青素的得率和純度。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供ー種葡萄籽原花青素的制備方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明中所涉及的百分比除另有注明之外為質(zhì)量比，本發(fā)明的產(chǎn)品采用這樣的方法來(lái)制備的
I.發(fā)酵菌株的選擇及培養(yǎng)基的制備
發(fā)酵菌株采購(gòu)于中國(guó)エ業(yè)微生物菌種保藏管理中心，分別如下
A菌-像今木霉，Trichoderma koningii編號(hào)為CICC40505,培養(yǎng)基為取去皮的馬
鈴薯200克，切成小塊，加水1000毫升煮沸30分鐘，濾去馬鈴薯塊，將濾液補(bǔ)足至1000毫升，加葡萄糖20克，溶化后分裝，15磅滅菌30分鐘。B菌——黑曲霉，Asperぬ7ΛΛ5 niger,編號(hào)為CICC41130，培養(yǎng)基為鹿糖30克，硝酸鈉2克，硫酸鎂O. 5克，氯化鉀O. 5克，硫酸亞鐵O. 01克，磷酸氫ニ鉀I克，蒸餾水1000毫升，15磅滅菌30分鐘。
2.直投式發(fā)酵劑的制備過(guò)程
2.I凍干菌粉末的活化
分別量取O. 9%的生理鹽水IOml于2只試管內(nèi)，經(jīng)121°C滅菌20分鐘冷卻至30°C，將2株菌安瓶?jī)?nèi)的凍干菌粉末在無(wú)菌狀態(tài)下全部倒入O. 9%的生理鹽水中，震蕩使其溶解，在30°C恒溫箱中靜止活化30分鐘，備用。
2. 2擴(kuò)大培養(yǎng)
2.2. I母發(fā)酵劑的制備
分別量取2株菌培養(yǎng)基各200ml于2只500ml三角瓶?jī)?nèi)，121 °C滅菌20分鐘冷卻至300C，按培養(yǎng)基體積的10%接種2. I步驟中已經(jīng)活化的菌種，在30°C、150轉(zhuǎn)/分鐘，搖床培養(yǎng)24小時(shí)，作為母發(fā)酵劑。2. 2. 2生產(chǎn)發(fā)酵劑的制備
首先配置10%的脫脂奶乳濁液，向脫脂乳中加入5%的液態(tài)甘油、2%低聚木糖、2%蔗糖，121 °C滅菌20分鐘冷卻至30°C，分別按5%體積比例接種母發(fā)酵劑，在30°C、150轉(zhuǎn)/分鐘，搖床培養(yǎng)30— 36小時(shí)，檢測(cè)2株菌生產(chǎn)發(fā)酵劑活菌數(shù)，各生產(chǎn)發(fā)酵劑活菌數(shù)> IO9個(gè)/ml，視同為發(fā)酵成熟，如果活菌數(shù)< IO9個(gè)/ml，繼續(xù)培養(yǎng)，直至達(dá)到IO9個(gè)/ml。2. 3粉末凍干菌種的制備
將成熟的生產(chǎn)發(fā)酵劑在無(wú)菌條件下導(dǎo)入玻璃安瓶中，液面高度O. 8 — lcm，加蓋瓶塞后放入_30°C冰柜速凍,凍結(jié)后將玻璃安瓶用托盤盛裝,放入凍干機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。2. 4直投式發(fā)酵劑的復(fù)配
按凍干菌粉末重量，取A菌粉末2-4份，B菌粉末3-5份，充分混勻后制成直投式發(fā)酵齊U，用于發(fā)酵葡萄籽漿，直投式發(fā)酵劑的添加量為葡萄籽漿中固形物重量的O. 125%。需要進(jìn)ー步說(shuō)明的是本發(fā)明中選用的菌種購(gòu)于中國(guó)エ業(yè)微生物菌種保藏管理中心，這些菌的活化、凍干方法不僅僅限于本發(fā)明所述的具體方法，培養(yǎng)基的成分也不限于此，其它常規(guī)技術(shù)和方法都是可以的，只要可以提高菌種的活力、并將其制備成凍干粉狀而方便使用即可。3.葡萄籽原花青素的制備
3.I原料粉漿
選擇無(wú)蟲(chóng)害、無(wú)病害、未發(fā)熱霉變、水分含量5%以下的葡萄籽，按葡萄籽重量的3倍添加去離子水，然后進(jìn)入膠體磨，循環(huán)磨漿制成葡萄籽漿。3. 2 配料
按葡萄籽漿重量的1%添加葡萄糖粉，充分?jǐn)嚢?，溶解葡萄糖，制成加糖葡萄籽漿。3. 3高溫滅菌
將加糖葡萄籽漿加熱至121°C滅菌20分鐘，然后冷卻至30°C。3. 4接菌發(fā)酵
按加糖葡萄籽漿中固形物重量的O. 125%接種2. 4步驟制備的直投式發(fā)酵劑，30°C、150轉(zhuǎn)/分鐘，搖床培養(yǎng)48小吋。3. 5離心除渣
用管式離心機(jī)15000轉(zhuǎn)/分鐘離心去除發(fā)酵葡萄籽漿中的不溶性物質(zhì)。3. 6超濾提取用截留分子量為5000 Da的超濾膜過(guò)濾，取濾過(guò)液，再用截留分子量為150 Da的超濾膜過(guò)濾，棄濾過(guò)液，取150 Da超濾膜截留的液體。3. 7 干燥
將經(jīng)過(guò)3. 6步驟處理后獲得的150 Da超濾膜截留的液體進(jìn)行噴霧干燥，獲得葡萄籽原花青素，即為成品。
具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更詳細(xì)的描述
實(shí)施例一
1.發(fā)酵菌株的選擇及培養(yǎng)基的制備
發(fā)酵菌株采購(gòu)于中國(guó)エ業(yè)微生物菌種保藏管理中心，分別如下
A菌-像今木霉，Trichoderma koningii編號(hào)為CICC40505,培養(yǎng)基為取去皮的馬
鈴薯200克，切成小塊，加水1000毫升煮沸30分鐘，濾去馬鈴薯塊，將濾液補(bǔ)足至1000毫升，加葡萄糖20克，溶化后分裝，15磅滅菌30分鐘。B菌——黑曲霉，Asperぬ7ΛΛ5 ni’gvr，編號(hào)為:CICC41130，培養(yǎng)基為鹿糖30克，硝酸鈉2克，硫酸鎂O. 5克，氯化鉀O. 5克，硫酸亞鐵O. 01克，磷酸氫ニ鉀I克，蒸餾水1000毫升，15磅滅菌30分鐘。2.直投式發(fā)酵劑的制備過(guò)程
2.I凍干菌粉末的活化
分別量取O. 9%的生理鹽水IOml于2只試管內(nèi)，經(jīng)121°C滅菌20分鐘冷卻至30°C，將2株菌安瓶?jī)?nèi)的凍干菌粉末在無(wú)菌狀態(tài)下全部倒入O. 9%的生理鹽水中，震蕩使其溶解，在30°C恒溫箱中靜止活化30分鐘，備用。2. 2擴(kuò)大培養(yǎng)
2.2. I母發(fā)酵劑的制備
分別量取2株菌培養(yǎng)基各200ml于2只500ml三角瓶?jī)?nèi)，121 °C滅菌20分鐘冷卻至300C，按培養(yǎng)基體積的10%接種2. I步驟中已經(jīng)活化的菌種，在30°C、150轉(zhuǎn)/分鐘，搖床培養(yǎng)24小時(shí)，作為母發(fā)酵劑。2. 2. 2生產(chǎn)發(fā)酵劑的制備
首先配置10%的脫脂奶乳濁液，向脫脂乳中加入5%的液態(tài)甘油、2%低聚木糖、2%蔗糖，121 °C滅菌20分鐘冷卻至30°C，分別按5%體積比例接種母發(fā)酵劑，在30°C、150轉(zhuǎn)/分鐘，搖床培養(yǎng)30— 36小時(shí)，檢測(cè)2株菌生產(chǎn)發(fā)酵劑活菌數(shù)，各生產(chǎn)發(fā)酵劑活菌數(shù)> IO9個(gè)/ml，視同為發(fā)酵成熟，如果活菌數(shù)< IO9個(gè)/ml，繼續(xù)培養(yǎng)，直至達(dá)到IO9個(gè)/ml。2. 3粉末凍干菌種的制備
將成熟的生產(chǎn)發(fā)酵劑在無(wú)菌條件下導(dǎo)入玻璃安瓶中，液面高度O. 8 — lcm，加蓋瓶塞后放入_30°C冰柜速凍,凍結(jié)后將玻璃安瓶用托盤盛裝,放入凍干機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。2. 4直投式發(fā)酵劑的復(fù)配
按凍干菌粉末重量，取A菌粉末2份，B菌粉末3份，充分混勻后制成直投式發(fā)酵劑，用于發(fā)酵葡萄籽漿，直投式發(fā)酵劑的添加量為葡萄籽漿中固形物重量的O. 125%。3.葡萄籽原花青素的制備
3.I原料粉漿選擇無(wú)蟲(chóng)害、無(wú)病害、未發(fā)熱霉變、水分含量5%以下的葡萄籽，按葡萄籽重量的3倍添加去離子水，然后進(jìn)入膠體磨，循環(huán)磨漿制成葡萄籽漿。3. 2 配料
按葡萄籽漿重量的1%添加葡萄糖粉，充分?jǐn)嚢瑁芙馄咸烟?，制成加糖葡萄籽漿。
3. 3高溫滅菌
將加糖葡萄籽漿加熱至121°C滅菌20分鐘，然后冷卻至30°C。3. 4接菌發(fā)酵
按加糖葡萄籽漿中固形物重量的O. 125%接種2. 4步驟制備的直投式發(fā)酵劑，30°C、150轉(zhuǎn)/分鐘，搖床培養(yǎng)48小吋。3. 5離心除渣
用管式離心機(jī)15000轉(zhuǎn)/分鐘離心去除發(fā)酵葡萄籽漿中的不溶性物質(zhì)。3. 6超濾提取
用截留分子量為5000 Da的超濾膜過(guò)濾，取濾過(guò)液，再用截留分子量為150 Da的超濾膜過(guò)濾，棄濾過(guò)液，取150 Da超濾膜截留的液體。3. 7 干燥
將經(jīng)過(guò)3. 6步驟處理后獲得的150 Da超濾膜截留的液體進(jìn)行噴霧干燥，獲得葡萄籽原花青素，即為成品。實(shí)施例ニ
1.發(fā)酵菌株的選擇及培養(yǎng)基的制備
發(fā)酵菌株采購(gòu)于中國(guó)エ業(yè)微生物菌種保藏管理中心，分別如下
A菌-像今木霉，Trichoderma koningii編號(hào)為CICC40505,培養(yǎng)基為取去皮的馬
鈴薯200克，切成小塊，加水1000毫升煮沸30分鐘，濾去馬鈴薯塊，將濾液補(bǔ)足至1000毫升，加葡萄糖20克，溶化后分裝，15磅滅菌30分鐘。B菌——黑曲霉，Asperぬ7ΛΛ5 niger,編號(hào)為CICC41130，培養(yǎng)基為鹿糖30克，硝酸鈉2克，硫酸鎂O. 5克，氯化鉀O. 5克，硫酸亞鐵O. 01克，磷酸氫ニ鉀I克，蒸餾水1000毫升，15磅滅菌30分鐘。2.直投式發(fā)酵劑的制備過(guò)程
2.I凍干菌粉末的活化
分別量取O. 9%的生理鹽水IOml于2只試管內(nèi)，經(jīng)121°C滅菌20分鐘冷卻至30°C，將2株菌安瓶?jī)?nèi)的凍干菌粉末在無(wú)菌狀態(tài)下全部倒入O. 9%的生理鹽水中，震蕩使其溶解，在30°C恒溫箱中靜止活化30分鐘，備用。2. 2擴(kuò)大培養(yǎng)
2.2. I母發(fā)酵劑的制備
分別量取2株菌培養(yǎng)基各200ml于2只500ml三角瓶?jī)?nèi)，121 °C滅菌20分鐘冷卻至300C，按培養(yǎng)基體積的10%接種2. I步驟中已經(jīng)活化的菌種，在30°C、150轉(zhuǎn)/分鐘，搖床培養(yǎng)24小時(shí)，作為母發(fā)酵劑。2. 2. 2生產(chǎn)發(fā)酵劑的制備
首先配置10%的脫脂奶乳濁液，向脫脂乳中加入5%的液態(tài)甘油、2%低聚木糖、2%蔗糖， 121 °C滅菌20分鐘冷卻至30°C，分別按5%體積比例接種母發(fā)酵劑，在30°C、150轉(zhuǎn)/分鐘，搖床培養(yǎng)30— 36小時(shí)，檢測(cè)2株菌生產(chǎn)發(fā)酵劑活菌數(shù)，各生產(chǎn)發(fā)酵劑活菌數(shù)> IO9個(gè)/ml，視同為發(fā)酵成熟，如果活菌數(shù)< IO9個(gè)/ml，繼續(xù)培養(yǎng)，直至達(dá)到IO9個(gè)/ml。2. 3粉末凍干菌種的制備
將成熟的生產(chǎn)發(fā)酵劑在無(wú)菌條件下導(dǎo)入玻璃安瓶中，液面高度O. 8 — lcm，加蓋瓶塞后放入_30°C冰柜速凍,凍結(jié)后將玻璃安瓶用托盤盛裝,放入凍干機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。
2. 4直投式發(fā)酵劑的復(fù)配
按凍干菌粉末重量，取A菌粉末4份，B菌粉末5份，充分混勻后制成直投式發(fā)酵劑，用于發(fā)酵葡萄籽漿，直投式發(fā)酵劑的添加量為葡萄籽漿中固形物重量的O. 125%。3.葡萄籽原花青素的制備
3.I原料粉漿
選擇無(wú)蟲(chóng)害、無(wú)病害、未發(fā)熱霉變、水分含量5%以下的葡萄籽，按葡萄籽重量的3倍添加去離子水，然后進(jìn)入膠體磨，循環(huán)磨漿制成葡萄籽漿。3. 2 配料
按葡萄籽漿重量的1%添加葡萄糖粉，充分?jǐn)嚢瑁芙馄咸烟?，制成加糖葡萄籽漿。3. 3高溫滅菌
將加糖葡萄籽漿加熱至121°C滅菌20分鐘，然后冷卻至30°C。3. 4接菌發(fā)酵
按加糖葡萄籽漿中固形物重量的O. 125%接種2. 4步驟制備的直投式發(fā)酵劑，30°C、150轉(zhuǎn)/分鐘，搖床培養(yǎng)48小吋。3. 5離心除渣
用管式離心機(jī)15000轉(zhuǎn)/分鐘離心去除發(fā)酵葡萄籽漿中的不溶性物質(zhì)。3. 6超濾提取
用截留分子量為5000 Da的超濾膜過(guò)濾，取濾過(guò)液，再用截留分子量為150 Da的超濾膜過(guò)濾，棄濾過(guò)液，取150 Da超濾膜截留的液體。3. 7 干燥
將經(jīng)過(guò)3. 6步驟處理后獲得的150 Da超濾膜截留的液體進(jìn)行噴霧干燥，獲得葡萄籽原花青素，即為成品。
權(quán)利要求
1. ー種葡萄籽原花青素的制備方法，其特征在于它是按以下步驟進(jìn)行制備 1)發(fā)酵菌株的選擇及培養(yǎng)基的制備 發(fā)酵菌株采購(gòu)于中國(guó)エ業(yè)微生物菌種保藏管理中心，分別如下 A菌-像今木霉，Trichoderma koningii編號(hào)為CICC40505,培養(yǎng)基為取去皮的馬鈴薯200克，切成小塊，加水1000毫升煮沸30分鐘，濾去馬鈴薯塊，將濾液補(bǔ)足至1000毫升，加葡萄糖20克，溶化后分裝，15磅滅菌30分鐘。
B菌——黑曲霉，Aspergillus nigvr，編號(hào)為:CICC41130，培養(yǎng)基為鹿糖30克，硝酸鈉2克，硫酸鎂O. 5克，氯化鉀O. 5克，硫酸亞鐵O. 01克，磷酸氫ニ鉀I克，蒸餾水1000暈升，15膀滅菌30分鐘。
2)凍干菌粉末的活化 分別量取O. 9%的生理鹽水IOml于2只試管內(nèi)，經(jīng)121°C滅菌20分鐘冷卻至30°C，將2株菌安瓶?jī)?nèi)的凍干菌粉末在無(wú)菌狀態(tài)下全部倒入O. 9%的生理鹽水中，震蕩使其溶解，在30°C恒溫箱中靜止活化30分鐘，備用。
3)母發(fā)酵劑的制備 分別量取2株菌培養(yǎng)基各200ml于2只500ml三角瓶?jī)?nèi)，121 °C滅菌20分鐘冷卻至.300C，按培養(yǎng)基體積的10%接種2)步驟中已經(jīng)活化的菌種，在30°C、150轉(zhuǎn)/分鐘，搖床培養(yǎng)24小時(shí)，作為母發(fā)酵劑。
4)生產(chǎn)發(fā)酵劑的制備 首先配置10%的脫脂奶乳濁液，向脫脂乳中加入5%的液態(tài)甘油、2%低聚木糖、2%蔗糖， .121 °C滅菌20分鐘冷卻至30°C，分別按5%體積比例接種母發(fā)酵劑，在30°C、150轉(zhuǎn)/分鐘，搖床培養(yǎng)30— 36小時(shí)，檢測(cè)2株菌生產(chǎn)發(fā)酵劑活菌數(shù)，各生產(chǎn)發(fā)酵劑活菌數(shù)> IO9個(gè)/ml，視同為發(fā)酵成熟，如果活菌數(shù)< IO9個(gè)/ml，繼續(xù)培養(yǎng)，直至達(dá)到IO9個(gè)/ml。
5)粉末凍干菌種的制備 將成熟的生產(chǎn)發(fā)酵劑在無(wú)菌條件下導(dǎo)入玻璃安瓶中，液面高度O. 8 — lcm，加蓋瓶塞后放入_30°C冰柜速凍,凍結(jié)后將玻璃安瓶用托盤盛裝,放入凍干機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。
6)直投式發(fā)酵劑的復(fù)配 按凍干菌粉末重量，取A菌粉末2-4份，B菌粉末3-5份，充分混勻后制成直投式發(fā)酵齊U，用于發(fā)酵葡萄籽漿，直投式發(fā)酵劑的添加量為葡萄籽漿中固形物重量的O. 125%。
7)原料粉漿 選擇無(wú)蟲(chóng)害、無(wú)病害、未發(fā)熱霉變、水分含量5%以下的葡萄籽，按葡萄籽重量的3倍添加去離子水，然后進(jìn)入膠體磨，循環(huán)磨漿制成葡萄籽漿。
8)配料 按葡萄籽漿重量的1%添加葡萄糖粉，充分?jǐn)嚢?，溶解葡萄糖，制成加糖葡萄籽漿。
9)高溫滅菌 將加糖葡萄籽漿加熱至121°C滅菌20分鐘，然后冷卻至30°C。
10)接菌發(fā)酵 按加糖葡萄籽漿中固形物重量的O. 125%接種6)步驟制備的直投式發(fā)酵劑，30°C、150轉(zhuǎn)/分鐘，搖床培養(yǎng)48小吋。
11)離心除渣用管式離心機(jī)15000轉(zhuǎn)/分鐘離心去除發(fā)酵葡萄籽漿中的不溶性物質(zhì)。
12)超濾提取 用截留分子量為5000 Da的超濾膜過(guò)濾，取濾過(guò)液，再用截留分子量為150 Da的超濾膜過(guò)濾，棄濾過(guò)液，取150 Da超濾膜截留的液體。
13)干燥 將經(jīng)過(guò)12)步驟處理后獲得的150 Da超濾膜截留的液體進(jìn)行噴霧干燥， 獲得葡萄籽原花青素，即為成品。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種葡萄籽原花青素的制備方法，首先制備康寧木霉和黑曲霉直投式發(fā)酵劑，然后將葡萄籽經(jīng)加水磨漿、加葡萄糖配料、高溫滅菌、接菌發(fā)酵、離心除渣、超濾提取、干燥等工藝制成葡萄籽原花青素。
文檔編號(hào)C12R1/885GK102690858SQ20121017087
公開(kāi)日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月29日
發(fā)明者佟曉芳, 姜帆, 陳成 申請(qǐng)人:哈爾濱市海澳斯生物科技開(kāi)發(fā)有限公司