專(zhuān)利名稱(chēng)：鮑曼不動(dòng)桿菌多重降落pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鮑曼不動(dòng)桿菌感染的分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及多重降落PCR檢測(cè)方法在下呼吸道標(biāo)本中鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)檢測(cè)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鮑曼不動(dòng)桿菌為重要的院內(nèi)感染病原，廣泛存在于自然界中，生命力頑強(qiáng)。在醫(yī)院環(huán)境中，鮑曼不動(dòng)桿菌廣泛存在于各種醫(yī)療器械與患者的被褥中，亦可于醫(yī)護(hù)人員的手、工作服、聽(tīng)診器中檢出。近年來(lái)其在院內(nèi)感染中的重要性不斷上升，主要累及危重患者(如IUC患者)，可引起呼吸道感染、膿毒血癥與泌尿系統(tǒng)感染等，是醫(yī)院獲得性肺炎(HAP)、尤其是呼吸機(jī)相關(guān)肺炎(VAP)的重要致病菌。
Neil Woodford 等(Woodford N，et al. Multiplex PCR for genes encodingprevalent OXAcarbapenemases in Acinetobacter spp. Int J AntimicrobAgents, 2006，27 (4) : 351353.)以bla0XA_51_like基因?yàn)榘袠?biāo)建立的PCR的檢測(cè)結(jié)果支持bla^n&基因?yàn)轷U曼不動(dòng)桿菌所固有。然而Lee Y T等發(fā)現(xiàn)I株不動(dòng)桿菌基因型13TU臨床分離株亦存在 blaQXA_5Hike 基因(Lee Y T, et al. First identification of bla0XA_51_likein non-baumannii Acinetobacter spp. J Chemother, 2009，21 (5) : 514520.)。同時(shí)針對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的多個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)可提高檢測(cè)方法的特異性。Korbie，D.J.等(Korbie，D.J. and J. S. Mattick, Touchdown PCR. for increased specificity and sensitivity inPCR amplification. Nat. Protocols, 2008. 3 (9) :p. 1452-1456.)發(fā)現(xiàn)降落 PCR 可提高 PCR的特異性與靈敏度。當(dāng)前尚無(wú)同時(shí)針對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌gltA、gyrB、bla0XA_51_like基因以檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌的多重PCR報(bào)道。本發(fā)明建立的多重降落PCR可直接檢測(cè)下呼吸道標(biāo)本中的鮑曼不動(dòng)桿菌，費(fèi)時(shí)少，具高度特異性與靈敏性，有利于鮑曼不動(dòng)桿菌感染的快速診斷與流行病學(xué)調(diào)查。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種可快速特異檢測(cè)下呼吸道標(biāo)本中鮑曼不動(dòng)桿菌的多重PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)發(fā)案實(shí)現(xiàn)的一種鮑曼不動(dòng)桿菌多重降落PCR檢測(cè)試劑盒，包括10XPCR緩沖液，MgCl2, dNTP,TaqDNA聚合酶，BSA，鮑曼不動(dòng)桿菌陽(yáng)性對(duì)照DNA，3對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌引物；所述3對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌引物序列如下第I 對(duì)5 ’ -AGCGACTCAAGCAGACTACC-3 ’ ( SEQ ID NO. I)與5’ -GAGCAGAGATACCAGCAGAGAT-3’ (SEQID NO. 2)；第2 對(duì)5，-TTATTATGACCGATGCCGATGT-3，( SEQ ID NO. 3)與5’ -CAGAATGTGCTGCCATACCT-3’ (SEQID NO. 4)；第3 對(duì)5，-TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3，( SEQ ID NO. 5)與5’ -TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’ (SEQID NO. 6) (Woodford N，et al.Multiplex PCRfor genes encoding prevalent OXA carbapenemases in Acinetobacter spp.Int JAntimicrob Agents, 2006，27(4):351353.)；本發(fā)明還公開(kāi)了應(yīng)用上述試劑盒的檢測(cè)方法(一)提取待檢樣本DNA(二)多重降落PCR法擴(kuò)增檢測(cè)待檢樣本DNA中的gltA、gyrB、blaQXA_51_like基因，具
體步驟如下
反應(yīng)體系25 nl
H2OI，V fd
緩沖液 110 X PCR)2.5
BSA(10 mg/ml)0.25 ^il
AB—glt.A-F (10 MmoI/L)0. 5 nl
AS—gltA-R (10 (Jfliol/L)0. 5 pi
AB—gyrB-F (10 Umol/L)I p.1
AB—gyrB-R (10 剛ol/L)Ipl
AB—0XA-F (10 rtiiol/L)I yd
AB—0XA-R (10 Wnol/L)Ipl
MgCl2 (25 niM)2 |il
dNTP (10 mM)0.5^1
Taq DNA 聚合j* (5 U/nl)0.2 ^il
DNA模板2 nl3對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌引物為AB_gltA-F :5，-AGCGACTCAAGCAGACTACC-3’(SEQ ID NO. I)AB_gltA-R :5，-AGCAGAGATACCAGCAGAGAT-3，(SEQ ID NO. 2)AB_gyrB-F :5’ -TTATTATGACCGATGCCGATGT-3’(SEQ ID NO. 3)AB_gyrB-R :5，-CAGAATGTGCTGCCATACCT-3，(SEQ ID NO. 4)AB_0XA-F :5’ -TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’ (SEQ ID NO. 5)AB_0XA-R :5’ -TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’ (SEQ ID NO. 6)(三)PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)如下94 °C 5min ；94 V 30s, 65 °C (每循環(huán)降低 0. 5 °C ) 30s, 72 V lmin, 20 個(gè)循環(huán)；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin, 20 個(gè)循環(huán)；72°C 7min。(四)電泳檢測(cè)鑒定對(duì)多重降落PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，如電泳圖中含有353bp、551bp、719bp條帶中的任意2條或3條則代表檢出鮑曼不動(dòng)桿菌。有益效果本發(fā)明所建立的多重降落PCR可克服常規(guī)培養(yǎng)的耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低等問(wèn)題，具有快速、簡(jiǎn)便、特異、靈敏度高等特征?？捎诋?dāng)天出檢測(cè)結(jié)果報(bào)告，可同時(shí)檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌的3個(gè)基因，對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌DNA的檢測(cè)下限達(dá)0. 82pg。該多重降落PCR可用于鮑曼不動(dòng)桿菌感染的快速診斷與流行病學(xué)調(diào)查。


圖I為建立的多重降落PCR的特異性檢測(cè)結(jié)果；泳道I — 13模板依次對(duì)應(yīng)為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、卡它莫拉菌(Moraxe Ila (Branhame 11a) catarrhal is )> 幾腸球菌(Enterococcus faecals)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)、肺炎鏈 球菌(Streptococcu spneumoniae)、b型流感嗜血桿菌、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)、牛分枝桿菌 BCG (Mycobacteriumbovis BCG);泳道14為DL2000DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；泳道15-16模板依次為陽(yáng)性對(duì)照鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)與陰性對(duì)照。圖2為實(shí)施例I檢測(cè)結(jié)果；泳道M為DL2000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1_9模板為臨床痰標(biāo)本基因組DNA，泳道7、8于353bp、551bp、719bp處出現(xiàn)3條對(duì)應(yīng)大小的條帶，判為檢出鮑曼不動(dòng)桿菌，其相應(yīng)標(biāo)本的細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果亦證實(shí)檢出鮑曼不動(dòng)桿菌；泳道10、11為陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照。圖3為建立的多重降落PCR的檢測(cè)限檢測(cè)結(jié)果泳道1-7模板依次對(duì)應(yīng)為鮑曼不動(dòng)桿菌基因組DNA82ng及其10 稀釋模板；泳道8為陰性對(duì)照；泳道9為DL2000DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；檢出下限為5道模板,對(duì)應(yīng)為8. 2pg鮑曼不動(dòng)桿菌基因組DNA。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :痰標(biāo)本預(yù)處理痰標(biāo)本應(yīng)用生理鹽水洗滌2次，加入等量的1%胰酶(當(dāng)天現(xiàn)配現(xiàn)用)于37°C消化90min。提取痰標(biāo)本中的細(xì)菌DNA :取已消化的痰標(biāo)本I. 5ml用Takara minibest細(xì)菌基因組提取試劑盒(Takara，大連寶生)提取痰標(biāo)本中的細(xì)菌DNA。提取的DNA直接用于PCR擴(kuò)增或置于一 20°C保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增總體系25iU，在200iUPCR小管內(nèi)依次加入12.55iU雙蒸水，2.5iU緩沖液(10XPCR)，BSA(10mg/ml)0. 25 U I、引物 AB_gltA_F (10umol/L) 0. 5u I, AB_gltA_R(10umol/L)0. 5u l,AB_gyrB-F (10umol/L)lu l,AB_gyrB-R (10umo/L)lu 1，AB_0XA_F(10 u mol/L) I u I, AB_0XA-R (10 u mol/L) I u l,2u IMgCl2 (25mM) ,0. 5u I dNTP (IOmM)，0. 2u I Taq DNA聚合酶(5U/yl )，2 提取的痰標(biāo)本基因組DNA。同時(shí)設(shè)鮑曼不動(dòng)桿菌陽(yáng)性模板對(duì)照與陰性對(duì)照(雙蒸水作為模板)。手指輕彈混勻，短暫離心后放入PCR儀。3對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌引物為針對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌gltA基因的引物對(duì)AB_gltA_F:5’ -AGCGACTCAAGCAGACTACC-3’，AB_gltA-R :5’ -GAGCAGAGATACCAGCAGAGAT-3’，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度 551bp ；針對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌gyrB基因的引物對(duì)AB_gyrB_F:5’ -TTATTATGACCGATGCCGATGT-3’，AB_gyrB-R :5’ -CAGAATGTGCTGCCATACCT-3’，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度 719bp ；針對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌blaQXA_51_like基因的弓丨物對(duì)AB_0XA-F:5’ -TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’，AB_0XA_R :5’ -TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度353bp。設(shè)置PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)94 V 5min ；94 V 30s, 65 °C (每循環(huán)降低0. 5°C ) 30s, 72°C lmin, 20 個(gè)循環(huán)；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin, 20 個(gè)循環(huán)；72°C 7min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，上樣量為5 Ul與6X上樣緩沖液混勻后加入膠孔中，于I X TAE溶液中，在100V電壓下，電泳30min，電泳后經(jīng)0. 5mg/L的溴化乙錠浸泡染色I(xiàn)OlOmin后，于凝膠成像分析系統(tǒng)中分析檢測(cè)結(jié)果。如陰性對(duì)照無(wú)條帶，陽(yáng)性對(duì)照于353bp、551bp、719bp處出現(xiàn)對(duì)應(yīng)大小的條帶，檢測(cè)樣本出現(xiàn)353bp、551bp、719bp條帶中的任意2條或3條則代表檢出鮑曼不動(dòng)桿菌(見(jiàn)圖2);如陽(yáng)性對(duì)照于353bp、551bp、719bp處未出現(xiàn)對(duì)應(yīng)大小的條帶或陰性對(duì)照出現(xiàn)非特異性條帶，則判為實(shí)驗(yàn)失敗，需重新檢測(cè)。 實(shí)施例2:多重降落PCR的特異性檢測(cè)。提取大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、卡它莫拉菌、糞腸球菌、流感嗜血桿菌、恥垢分枝桿菌、肺炎鏈球菌、b型流感嗜血桿菌、結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、鮑曼不動(dòng)桿菌的基因組DNA，取上述細(xì)菌的純培養(yǎng)物用Takaraminibest細(xì)菌基因組提取試劑盒(Takara，大連寶生)提取其基因組DNA。提取的DNA直接用于PCR擴(kuò)增或置于_20°C保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增總體系25iU，在200iUPCR小管內(nèi)依次加入12.55iU雙蒸水，2.5iU緩沖液(10XPCR)，BSA(10mg/ml)0. 25 U I、引物 AB_gltA_F (10 u mol/L) 0. 5u I, AB_gltA_R(10umol/L)0. 5u l,AB_gyrB-F (10umol/L)lu l,AB_gyrB-R (10umol/L)lu 1，AB_0XA_F(10 u mol/L) Iii I, AB_0XA-R (IOu mol/L) I u l,2u IMgCl2 (25mM), 0. 5 u I dNTP (IOmM),0. 2 ill Taq DNA聚合酶(5U/ U I),模板為2 U I提取的細(xì)菌基因組DNA。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照(雙蒸水作為模板)。手指輕彈混勻，短暫離心后放入PCR儀。3對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌引物為針對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌gltA基因的引物對(duì)AB_gltA_F:5’ -AGCGACTCAAGCAGACTACC-3’，AB_gltA-R :5’ -GAGCAGAGATACCAGCAGAGAT-3’，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度 551bp ；針對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌gyrB基因的引物對(duì)AB_gyrB_F 5’ -TTATTATGACCGATGCCGATGT-3’，AB_gyrB-R :5’ -CAGAATGTGCTGCCATACCT-3’，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度 719bp ；針對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌blaQXA_51_like基因的弓丨物對(duì)AB_0XA-F:5’ -TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’，AB_0XA_R :5’ -TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度353bp。設(shè)置PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)94 V 5min ；94 V 30s, 65 °C (每循環(huán)降低0. 5°C ) 30s, 72°C lmin, 20 個(gè)循環(huán)；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin, 20 個(gè)循環(huán)；72°C 7min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，上樣量為5 Ul與6X上樣緩沖液混勻后加入膠孔中，于IXTAE溶液中，在100V電壓下，電泳30min，電泳后經(jīng)0. 5mg/L的溴化乙錠浸泡染色I(xiàn)OlOmin后，于凝膠成像分析系統(tǒng)中分析檢測(cè)結(jié)果。鮑曼不動(dòng)桿菌基因組模板于353bp、55Ibp、719bp處出現(xiàn)對(duì)應(yīng)大小的條帶，其它細(xì)菌基因組模板及陰性對(duì)照無(wú)條帶出現(xiàn)(見(jiàn)圖I)。實(shí)施例3:多重降落PCR的檢測(cè)限確定。提取鮑曼不動(dòng)桿菌 的基因組DNA :取鮑曼不動(dòng)桿菌純培養(yǎng)液I. 5ml用Takaraminibest細(xì)菌基因組提取試劑盒(Takara，大連寶生)提取其基因組DNA。提取的DNA直接用于PCR擴(kuò)增或置于一 20°C保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增總體系25iU，在200iUPCR小管內(nèi)依次加入12.55iU雙蒸水，2.5iU緩沖液(10XPCR)，BSA(10mg/ml)0. 25 U I、引物 AB_gltA_F (10 u mol/L) 0. 5u I, AB_gltA_R(10umol/L)0. 5u l,AB_gyrB-F (10umol/L)l u l,AB_gyrB-R (10umol/L)lu 1，AB_0XA_F(10 u mol/L) I u I, AB_0XA-R (10 u mol/L) I u l,2u IMgCl2 (25mM) ,0. 5u I dNTP (IOmM)，0. 2u I Taq DNA聚合酶(5U/yl)，模板為2 yl提取的鮑曼不動(dòng)桿菌基因組DNA或其10 稀釋模板。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照(雙蒸水作為模板)。手指輕彈混勻，短暫離心后放入PCR儀。3對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌引物為針對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌gltA基因的引物對(duì)AB_gltA_F:5’ -AGCGACTCAAGCAGACTACC-3’，AB_gltA-R :5’ -GAGCAGAGATACCAGCAGAGAT-3’，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度 551bp ；針對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌gyrB基因的引物對(duì)AB_gyrB_F 5’ -TTATTATGACCGATGCCGATGT-3’，AB_gyrB-R :5’ -CAGAATGTGCTGCCATACCT-3’，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度 719bp ；針對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌blaQXA_51_like基因的弓丨物對(duì)AB_0XA-F:5’ -TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’，AB_0XA_R :5’ -TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度353bp。設(shè)置PCR 反應(yīng)循環(huán)參數(shù)94°C 5min ；94°C 30s, 65°C (每循環(huán)降低 0. 5°C ) 30s, 72°Clmin，20 個(gè)循環(huán)；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin，20 個(gè)循環(huán)；72°C 7min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，上樣量為5 Ul與6X上樣緩沖液混勻后加入膠孔中，于I X TAE溶液中，在100V電壓下，電泳30min，電泳后經(jīng)0. 5mg/L的溴化乙錠浸泡染色I(xiàn)OlOmin后，于凝膠成像分析系統(tǒng)中分析檢測(cè)結(jié)果。將于353bp、551bp、719bp處出現(xiàn)對(duì)應(yīng)大小條帶的最低鮑曼不動(dòng)桿菌基因組DNA濃度定義為該多重降落PCR的檢測(cè)下限(見(jiàn)圖3)。
權(quán)利要求
1. 一種鮑曼不動(dòng)桿菌多重降落PCR檢測(cè)試劑盒，包括=IOXPCR緩沖液，MgCl2, dNTP，Taq DNA聚合酶，BSA，鮑曼不動(dòng)桿菌陽(yáng)性對(duì)照DNA，3對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌引物，其特征在于所述3對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌引物序列如下第 I對(duì)5’ -AGCGACTCAAGCAGACTACC-3’ 與 5’ -GAGCAGAGATACCAGCAGAGAT-3’ ；第 2 對(duì)5’ -TTATTATGACCGATGCCGATGT-3’ 與 5’ -CAGAATGTGCTGCCATACCT-3’ ； 第 3 對(duì)5，-TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3，與 5，-TGGATTGCACTTCATCTTGG-3，。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種可快速檢測(cè)下呼吸道標(biāo)本中鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)的多重降落PCR檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明屬于下呼吸道感染性疾病的分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，擬解決下呼吸道標(biāo)本中鮑曼不動(dòng)桿菌的快速診斷。所述試劑盒包括10×PCR緩沖液，MgCl2，dNTP，TaqDNA聚合酶，BSA，鮑曼不動(dòng)桿菌陽(yáng)性對(duì)照DNA，以及3對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌引物。本發(fā)明建立了可檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌的多重降落PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。本發(fā)明建立的多重降落PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法快速、簡(jiǎn)便、特異、靈敏，可用于鮑曼不動(dòng)桿菌感染的快速診斷與流行病學(xué)調(diào)查。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102653793SQ201210148590
公開(kāi)日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2012年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月14日
發(fā)明者侯艷嬌, 杜蓬, 潘紅, 羅欲承, 邵世和, 錢(qián)靜漪, 陳珵 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)