專利名稱：一種生產(chǎn)重組混合異淀粉酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及構(gòu)建微生物工程菌生產(chǎn)重組蛋白。具體是應(yīng)用微生物工程菌生產(chǎn)重組混合異淀粉酶。
背景技術(shù)：
異淀粉酶(Isoamylase EC 3. 2. I. 68),亦稱α -1,6_葡萄糖苷酶,支鏈淀粉酶。異淀粉酶廣泛存在于微生物界，現(xiàn)已知產(chǎn)異淀粉酶的微生物有細(xì)菌和真菌兩大類。異淀粉酶能夠水解支鏈淀粉分支點(diǎn)的α-1，6_葡萄糖苷鍵，催化支鏈淀粉、糖原及某些分支糊精中 的α_1，6糖苷鍵的斷裂反應(yīng)。異淀粉酶廣泛應(yīng)用于淀粉エ業(yè)生產(chǎn)、啤酒生產(chǎn)、飼料エ業(yè)和飲食等行業(yè)。不同的用途對(duì)于異淀粉酶作用的適合溫度和PH有著不同的要求。當(dāng)前市場(chǎng)上的異淀粉酶產(chǎn)品是來源于天然菌株生產(chǎn)的異淀粉酶，當(dāng)前的異淀粉酶產(chǎn)品的適合反應(yīng)溫度范圍和適合反應(yīng)pH范圍窄，不能滿足當(dāng)前市場(chǎng)的需求。由于異淀粉酶有多種來源，那么，不同來源的異淀粉酶的基因序列可不相同，不同來源的異淀粉酶的理化特性可不相同。畢赤酵母(Pichia pastoris, P. pastoris)是最近迅速發(fā)展的ー種真核表達(dá)宿主，營(yíng)養(yǎng)要求不高，適合于大規(guī)模生產(chǎn)方式，分泌很少的自身蛋白，表達(dá)的外源蛋白容易純化。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)異淀粉酶有多種來源，不同來源的異淀粉酶的基因序列可不相同，不同來源的異淀粉酶的理化特性可不相同，如果將某些不同理化特性的異淀粉酶基因重組于同一個(gè)細(xì)胞的基因組進(jìn)行表達(dá)，那么，所表達(dá)的混合異淀粉酶將具有理化特性多祥性，即具有多個(gè)最適溫度和最適pH。這種混合酶將比其中單種酶的使用價(jià)值高。來源于解淀粉假單胞桿菌(Pseudomonas amyloderamosa)的異淀粉酶最適合pH 5. 6,最適溫度是56°C ;來源于軟腐細(xì)菌(Pectobacterium chrysanthemi)的異淀粉酶最適pH7,最適溫度40°C。由于這兩種酶的功能相同，若將這兩種酶聯(lián)合應(yīng)用，就有兩個(gè)最適合的PH反應(yīng)點(diǎn)和溫度反應(yīng)點(diǎn)，那么，其用途將比其中的単獨(dú)酶廣。若分別用不同的菌株來表達(dá)這兩種酶，其生產(chǎn)成本將高于用一個(gè)菌株同時(shí)生產(chǎn)這兩種酶的混合酶。本發(fā)明構(gòu)建含解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架和軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌，生產(chǎn)重組混合解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因編碼的異淀粉酶和軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因編碼的異淀粉酶。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是I.克隆酶基因應(yīng)用PCR技木，分別從解淀粉假單胞桿菌基因組和軟腐細(xì)菌基因組中擴(kuò)增異淀粉酶基因。2.獲得應(yīng)用于表達(dá)載體構(gòu)建所需的啟動(dòng)子，重組序列，信號(hào)肽，轉(zhuǎn)錄終止子和抗性基因。3.構(gòu)建如附圖的含解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架和軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)載體。
4.應(yīng)用電轉(zhuǎn)化法將含解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架和軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母基因組。[說明.表達(dá)框架啟動(dòng)子-信號(hào)肽-基因-轉(zhuǎn)錄終止子]5.篩選高表達(dá)解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因編碼的異淀粉酶和軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因編碼的異淀粉酶的重組子作為含解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架和軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌。6.發(fā)酵畢赤酵母工程菌生產(chǎn)重組混合異淀粉酶。本發(fā)明構(gòu)建含解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架和軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌生產(chǎn)重組混合異淀粉酶的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)于
本發(fā)明通過構(gòu)建畢赤酵母工程菌，應(yīng)用工程菌生產(chǎn)兩種重組異淀粉酶的混合酶產(chǎn)品，一方面提供最適pH7和最適pH5. 6,最適溫度40°C和50°C的混合異淀粉酶新產(chǎn)品，另ー方面取代發(fā)酵含解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因的菌株生產(chǎn)異淀粉酶，發(fā)酵含軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因的菌株生產(chǎn)異淀粉酶。即用ー個(gè)發(fā)酵エ序生產(chǎn)兩種異淀粉酶取代用兩個(gè)エ序分別生產(chǎn)兩種異淀粉酶。達(dá)到節(jié)省原材料、能耗和人力資源的作用。


附圖.含解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架和含軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)載體。p.畢赤酵母三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子；S. α因子信號(hào)肽；genel.解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因；gene2.軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因；TT.轉(zhuǎn)錄終止子；G418. G418抗性基因(應(yīng)用于篩選畢赤酵母重組子)；ColEl.大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)；AMP.氨芐青霉素抗性基因(應(yīng)用于篩選大腸桿菌轉(zhuǎn)化子)；p. pastoris rDNA.畢赤酵母的rDNA序列。
具體實(shí)施例方式下面用非限定性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步說明。實(shí)施例I :I. I構(gòu)建含解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架和含軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母組表達(dá)載體I. I. I構(gòu)建克隆載體由專業(yè)的DNA序列合成公司合成含氨芐青霉素(AMP)基因序列，多克隆接頭和大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)的兩條堿基互補(bǔ)的雙鏈，并且在每條DNA鏈序列的兩端形成粘性末端。通過DNA連接酶的作用使其環(huán)化，形成DNA克隆載體。將其克隆載體命名為pPM。I. I. 2猶取基因①PCR擴(kuò)增解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因引物I :5’ ggTTCGAAgccatcaacagcatgagcct3 [說明5’ 的 8 個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和酶識(shí)別位點(diǎn)(有下劃線的6個(gè)堿基)]引物 2 : 5，C A GCGGCCGCC T A 區(qū) TGATGATGATGATGATG
cttggagatcaacagcagcagcgat3’ [說明5’的10個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和酶識(shí)別位點(diǎn)(8個(gè)堿基)，方框中的18個(gè)堿基是編碼6個(gè)組氨酸的DNA序列。]
提取解淀粉假單胞桿菌基因組DNA，以解淀粉假單胞桿菌基因組DNA為模板，應(yīng)用引物I和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳證明PCR擴(kuò)增出符合解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因大小的擴(kuò)增帯。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA序列測(cè)定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因序列。②PCR擴(kuò)增軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因引物I :5’ gctacKtaatgggtgaactgttggcggg3 [說明5’ 的 8 個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和酶識(shí)別位點(diǎn)(有下劃線的6個(gè)堿基)]引物2:5， CAGCGGCCGCTTA ATGATGATGATGATGATG ttgttttaccagtacgcacaccgcatt3，[說
明5’的10個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和酶識(shí)別位點(diǎn)(8個(gè)堿基)，方框中的18個(gè) 堿基是編碼6個(gè)組氨酸的DNA序列。]提取軟腐細(xì)菌基因組DNA，以軟腐細(xì)菌基因組DNA為模板，應(yīng)用引物I和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳證明PCR擴(kuò)增出符合軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因大小的擴(kuò)增帯。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA序列測(cè)定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因。I. I. 3分別構(gòu)建含解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架和含軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架。①用PCR擴(kuò)增畢赤酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子序列。提取畢赤酵母的基因組DNA，應(yīng)用以基因組DNA為模板，應(yīng)用如下引物(5’ CCTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTC3’，5’ GGGCATGCTGTGTTTTGATAGTTGTTCAA 3’ )進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)序列測(cè)定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是其三磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動(dòng)子序列[如下序列的5’端和3’端的有下劃線的8個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和酶識(shí)別位點(diǎn)出個(gè)堿基)，沒有下劃線的是三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子序列]:CCTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTCCTCGTCCAATCAGGTAGCCATCTCTGAAATATCTGGCTCCG TTGCAACTCCGAACGACCTGCTGGCAACGTAAAATTCTCCGGGGTAAAACTTAAATGTGGAGTAATGGAACCAGAAACGT CTCTTCCCTTCTCTCTCCTTCCACCGCCCGTTACCGTCCCTAGGAAATTTTACTCTGCTGAGAGCTTCTTCTACGGCCCC CTTGCAGCAATGCTCTTCCCAGCATTACGTTGCGGGTAAAACGGAGGTCGTGTACCCGACCTAGCAGCCCAGGGATGGAA AAGTCCCGGCCGTCGCTGGCAATAATAGCGGGCGGACGCATGTCATGAGATTATTGGAAACCACCAGAATCGAATATAAA AGGCGAACACCTTTCCCAATTTTGGTTTCTCCTGACCCAAAGACCTTAAATTTAATTTATTTGTCCCTATTTCAATCAAT TGAACAACTATCAAAACACAGCATGCCC[說明畢赤酵母基因組DNA提取方法將畢赤酵母細(xì)胞加于9mg/ml的蝸牛酶溶液(蝸牛酶用lmol/L的山梨醇溶解)于30°C振搖30分鐘，然后按照常規(guī)的細(xì)菌基因組DNA提取方法提取其基因組DNA。]②由專業(yè)的DNA序列合成公司合成α因子信號(hào)肽[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒有下劃線的是α因子信號(hào)肽序列]:CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACT ACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGC TGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAG AAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC③由專業(yè)的DNA序列合成公司合成轉(zhuǎn)錄終止子序列[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒有下劃線的是轉(zhuǎn)錄終止子序列]:GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCG GTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCT TCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTC TTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGG GGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGT ACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCC④用套疊PCR法合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒有下劃線的是G418抗性基因序列]
GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATAC CATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTAT CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAA ATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGC CATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACG CGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATT TTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCAT CAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTA ACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGT CGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCC TCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGG⑤從畢赤酵母基因組中PCR擴(kuò)增rDNA序列PCR 引物引物I :5，CCGGTACCggcttccaggacgtatcgcggatcgctgcgttcttcatc3>引物2 :5， CCTTCGAAagccccgtggcacacgaccaatcttcccagccgaca 3，說明引物的5’端的8個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和酶識(shí)別位(有下劃線的6個(gè)堿基)。提取畢赤酵母基因組DNA，以基因組DNA為模板，應(yīng)用引物I和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是畢赤酵母基因組中的rDNA序列。⑥表達(dá)框架構(gòu)建過程A.含解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架的構(gòu)建通過DNA限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶的作用，將三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子DNA序列重組于pPM載體的多克隆位點(diǎn)；將α因子信號(hào)肽DNA序列重組于pPM載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于啟動(dòng)子序列的下游；將PCR擴(kuò)增獲得的解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因序列重組于PPM載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于信號(hào)肽序列的下游；將轉(zhuǎn)錄終止子序列重組于pPM載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于基因序列下游。此含解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架的載體稱為PPM1。B.含軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架的構(gòu)建通過DNA限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶的作用，將三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子DNA序列重組于pPM載體的多克隆位點(diǎn)；將α因子信號(hào)肽DNA序列重組于pPM載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于啟動(dòng)子序列的下游；將PCR擴(kuò)增獲得的軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因序列重組于PPM載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于信號(hào)肽序列的下游；將轉(zhuǎn)錄終止子序列重組于PPM載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于基因序列下游。此含軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架的載體稱為PPM2。⑦完成畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建A.將兩套表達(dá)框架組裝于同一個(gè)克隆載體。
·
通過DNA限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶的作用，切下pPM2載體的表達(dá)框架，并將其切下的表達(dá)框架重組于PPMl的多克隆位點(diǎn)。此載體稱為pPM12.B.通過DNA限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶的作用依次將畢赤酵母的rDNA序列(DNA重組序列)和G418基因重組于pPM12載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)成含解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架和含軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)載體(附圖)。I. 2構(gòu)建含解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架和含軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌用電轉(zhuǎn)化方法將以上構(gòu)建的畢赤酵母表達(dá)載體(見附圖)轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，將經(jīng)過電轉(zhuǎn)化的GSl 15細(xì)胞涂布G418抗性平板。以重組子(在G418抗性平板上生長(zhǎng)的克隆)基因組DNA為模板，分別用解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因的特異引物和軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因的特異引物進(jìn)行PCR進(jìn)行擴(kuò)増，將擴(kuò)增出符合目標(biāo)分子量的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列測(cè)定而驗(yàn)證獲得了正確的重組子。將含以上含兩種異淀粉酶基因表達(dá)框架的重組子在接種于YPD[2%蛋白胨，1% yeast extract (酵母提取物)，2%葡萄糖]培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)兩天，將發(fā)酵液離心，收獲上清。應(yīng)用發(fā)酵液進(jìn)行SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)，其結(jié)果表明出現(xiàn)新的符合這兩個(gè)基因編碼的酶蛋白分子量的蛋白條帶。用His6融合蛋白純化試劑盒純化目標(biāo)蛋白，用His標(biāo)簽單克隆抗體對(duì)純化的兩種目標(biāo)蛋白進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明這兩種目標(biāo)蛋白都能與His標(biāo)簽單克隆抗體結(jié)合，證明解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因和軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因都能在含解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架和含軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母中表達(dá)和分泌到胞外。篩選高表達(dá)以上所述的兩種混合異淀粉酶的重組子作為含解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架和含軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌。I. 3生產(chǎn)重組混合解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因編碼的異淀粉酶和軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因編碼的異淀粉酶分別將含解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架和軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌，只含解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌，只含軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌和不含異淀粉酶基因的畢赤酵母分別接種于YPD培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)兩天。分別收集其發(fā)酵液上清于兩個(gè)條件(①pH 5. 6、56°C，②pH 7、40°C )測(cè)定異淀粉酶活性，將結(jié)果記錄于表I。表I結(jié)果表明含解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架和軟腐細(xì)菌的異淀粉酶因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌的發(fā)酵液在pH 5.6、56°C和pH 7、40°C都具有良好的酶活性，但是，含單種異淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌的發(fā)酵液只是在其中的ー個(gè)條件下具有良好的酶活性。含解淀粉假單胞桿菌的異淀粉 酶基因表達(dá)框架和軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌的發(fā)酵液在pH 5.6、56°C條件下和在pH 7、40°C的條件下的異淀粉酶活性約為含解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌的發(fā)酵液和含軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌的發(fā)酵液在同樣條件下的異淀粉酶活性之和。表I.發(fā)酵液水解異淀粉試驗(yàn)試驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)重組混合異淀粉酶的方法。其特征在于應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)克隆解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因和軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因，構(gòu)建含解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架和含軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)載體；將畢赤酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母從而獲得畢赤酵母重組子；篩選高表達(dá)以上所述的兩種異淀粉酶的畢赤酵母重組子作為含解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架和含軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌；用含解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架和含軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌生產(chǎn)重組混合異淀粉酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種生產(chǎn)重組混合異淀粉酶的方法，其特征在于利用權(quán)利要求I所述的生產(chǎn)重組混合異淀粉酶的方法制備成混合異淀粉酶產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)重組混合異淀粉酶的方法。屬生物技術(shù)領(lǐng)域。首先分別克隆解淀粉假單胞桿菌和軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因；構(gòu)建含解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架和軟腐細(xì)菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)載體，并將其表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母，篩選高表達(dá)以上所述的兩種異淀粉酶的重組子作為工程菌；發(fā)酵畢赤酵母工程菌生產(chǎn)重組混合異淀粉酶。與傳統(tǒng)的由單基因編碼的異淀粉酶不同，本發(fā)明生產(chǎn)的重組混合異淀粉酶出現(xiàn)酶反應(yīng)的兩個(gè)最適溫度和pH，理化特性高，適合于多種用途；由于實(shí)現(xiàn)兩個(gè)酶基因同時(shí)在其畢赤酵母中表達(dá)，使其異淀粉酶產(chǎn)量顯著提高，起到降低生產(chǎn)成本的作用。
文檔編號(hào)C12R1/38GK102719420SQ201210141970
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月2日
發(fā)明者劉振旺, 張?zhí)碓? 張愛聯(lián), 易國(guó)輝, 羅進(jìn)賢, 陳麗萍 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所