專利名稱：一種基于定量pcr技術(shù)確定灘涂貝類攝食選擇性差異的分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖餌料培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于定量PCR技術(shù)確定灘涂貝類幼體攝食選擇性差異的方法，具體是一種基于定量PCR技術(shù)，通過(guò)定量檢測(cè)灘涂貝類幼體攝食混合微藻前后貝類體內(nèi)各微藻組成的變化，來(lái)準(zhǔn)確分析貝類對(duì)微藻的攝食選擇性差異的方法。
背景技術(shù)：
目前我國(guó)“蛤、蚶、蟶”等灘涂貝類產(chǎn)量約為400萬(wàn)噸，占海水貝類養(yǎng)殖總產(chǎn)量近40%。而在灘涂貝類育苗和養(yǎng)殖過(guò)程中，微藻餌料的品種和質(zhì)量直接決定著育苗和養(yǎng)殖的成
敗。長(zhǎng)期實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，不同海區(qū)不同貝類生長(zhǎng)狀況明顯不同，育苗過(guò)程中投喂不同微藻時(shí)，貝類生長(zhǎng)速度差異很大，說(shuō)明灘涂貝類對(duì)微藻餌料有著明顯選擇性也許是研究方法限制，迄今還未見(jiàn)浮游和稚貝階段貝類對(duì)粒度適宜微藻攝食選擇性發(fā)明研究報(bào)道。由于貝類浮游或稚貝階段幼體太小，無(wú)法用傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡對(duì)胃含物進(jìn)行解剖觀察；顆粒計(jì)數(shù)儀可觀察水體中不同粒度微藻或細(xì)菌的適時(shí)變化，但實(shí)際渾濁水體中，該類儀器無(wú)法將各種無(wú)機(jī)、有機(jī)顆粒跟微藻顆粒區(qū)分開(kāi)，更無(wú)法區(qū)分開(kāi)粒度接近的微藻。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，在水產(chǎn)行業(yè)已逐漸應(yīng)用在養(yǎng)殖病害診斷[如中國(guó)專利文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)中“水產(chǎn)品中主要病原菌的多重?zé)晒舛?PCR 檢測(cè)方法(CN201010039615. 7)”]、水產(chǎn)品檢測(cè)[Campbell MS and WrightAC. 2003.Real-time PCR analysis of Vibrio vulnificus from oysters. Applied andEnvironmental Microbiology 62:7137-7144.]及養(yǎng)殖水環(huán)境實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域[Tom AMand Auslander Μ. 2005. Transcript and protein environmental biomarkers in fish-areview. Chemosphere 59:155-162·]。
艮道表明[Barofsky A, Simonelli P, VidoudezC, et al. , 2010. Growth phase of the diatom Skeletonema marinoi influences themetabolic profile of the cells and the selective feeding of the copepod Calanusspp. Journal of Plankton Research 32:263-272.],該技術(shù)在浮游動(dòng)物館料攝食的選擇性定性定量研究上有著其他技術(shù)無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)。對(duì)微藻而言，其rDNA基因具高保守性，據(jù)微藻的rDNA的部分區(qū)域設(shè)計(jì)引物與探針并結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，便可對(duì)各微藻進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析。本發(fā)明應(yīng)用該技術(shù)，可避免傳統(tǒng)技術(shù)的不足，通過(guò)對(duì)幼體攝食混合微藻前后貝類體內(nèi)微藻組成進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，就可準(zhǔn)確分析貝類對(duì)微藻的攝食選擇性差異。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)傳統(tǒng)技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種基于定量PCR技術(shù)，通過(guò)定量檢測(cè)灘涂貝類稚貝攝食混合微藻前后貝類體內(nèi)各微藻組成的變化，來(lái)準(zhǔn)確分析貝類對(duì)微藻的攝食選擇性差異的分析方法。為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案一種基于定量PCR技術(shù)確定灘涂貝類攝食選擇性差異的分析方法，其特征在于對(duì)某種灘涂貝類投喂一定數(shù)量的混合微藻，攝食一段時(shí)間后對(duì)攝食前后灘涂貝類體內(nèi)的各微藻進(jìn)行定量PCR分析，根據(jù)各微藻在貝類體內(nèi)的比例確定該灘涂貝類對(duì)不同微藻選擇性攝食的差異。本發(fā)明所述的灘涂貝類涉及泥蚶、毛蚶、青蛤、縊蟶、彩虹明櫻蛤、文蛤等所有灘涂貝類品種。本發(fā)明所述的混合微藻品種可以是目前灘涂貝類苗種培育過(guò)程中常用的金藻、角毛藻、扁藻、微綠球藻、骨條藻、小硅藻、三角褐脂藻等，也可以是從天然水域分離出的任何單細(xì)胞藻。本發(fā)明所用的餌料微藻均于指數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行投喂，即在接種后經(jīng)過(guò)適宜條件培養(yǎng)Γιο天內(nèi)用于投喂?；旌衔⒃逶谕段骨?，于20±2°C，光照強(qiáng)度為18 27 μ mo I · m_2 · s—1的條件下，在 錐形瓶中采用“NML3號(hào)”培養(yǎng)液，其配方為100±10mg · L—1 KNO3,10 ± Img · L—1 KH2PO4,20±2mg · L_1 Na2Si03，0. 25±0· 025mg · Γ1 MnSO4 · H2O, 2· 50 ±0. 25mg · Γ1 FeSO4 · 7H20，10 ± Img .171 EDTA-Na2,6± 0. 6μ g ·Ι^ VB1,0· 05 ±0. 005 μ g .171 VB12，進(jìn)行人工擴(kuò)大培養(yǎng)，每天搖瓶1-2次，靜置培養(yǎng)一周時(shí)間，通過(guò)顯微觀察和顆粒計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，待微藻細(xì)胞濃度達(dá)到80 120沈11 · μ Γ1，青島大扁藻細(xì)胞密度控制在15 20cell · μ L-1時(shí)，微藻處于指數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)方可投喂稚貝。本發(fā)明所述的灘涂貝類投喂混合微藻前，需要在經(jīng)過(guò)沙濾基本不含任何微藻的潔凈天然海水中不投餌饑餓8-lOh以盡量排空腸胃內(nèi)殘餌，后取lg±0. Ig濕重的稚貝樣品并于_20°C以下冷凍保存以進(jìn)行后續(xù)定量PCR分析。本發(fā)明所述的餌料投喂過(guò)程中，取一定數(shù)量某種灘涂貝類稚貝于一定體積的塑料容器內(nèi)，投喂一定量的混合微藻，投喂后取20 ± O. 2mL左右的培養(yǎng)海水用O. 45 ±O. 045 μ m醋酸纖維濾膜過(guò)濾收集混合微藻樣品并于_20°C以下冷凍保存以進(jìn)行后期混合微藻的定量PCR分析；攝食O. 5-lh后取I. 0±0. 2g左右濕重的貝類樣品并于-20°C以下冷凍保存以進(jìn)行定量PCR分析。本發(fā)明所述的混合微藻，需要分別對(duì)其18S rDNA進(jìn)行克隆、測(cè)序及序列分析，并獲得能夠通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)來(lái)區(qū)分此5種微藻的特異性引物(探針)。它們?yōu)镃haF/ChaR、IsoF/IsoR、PlaF/PlaR、PavF/PavR 及 NanF/NanR。本發(fā)明中對(duì)灘涂貝類幼體體內(nèi)和水體中的混合微藻進(jìn)行定量PCR分析時(shí)，須根據(jù)各餌料微藻的特異性引物分別對(duì)其基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并獲得目標(biāo)片段，以10倍拷貝數(shù)為濃度梯度的目標(biāo)片段構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品系列，通過(guò)優(yōu)化定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，建立熒光信號(hào)(正比于目標(biāo)片段的拷貝數(shù))相對(duì)Ct值的定量工作曲線(標(biāo)準(zhǔn)曲線)。后通過(guò)檢測(cè)混合微藻中及攝食前后稚貝體內(nèi)各微藻的Ct值，依據(jù)各自的工作曲線分別計(jì)算出各樣品中各微藻的含量(以目標(biāo)片段拷貝數(shù)表示)，從而確定各微藻在樣品的相對(duì)比例，最終根據(jù)比較水體中初始混合微藻的比例和貝類體內(nèi)攝食前后各微藻在混合微藻中的比例，確定出該灘涂貝類稚貝的對(duì)混合微藻中各微藻的攝食選擇性差異。本發(fā)明建立的微藻或貝類中混合微藻的定量PCR方法，由于儀器本身檢測(cè)系統(tǒng)存在的誤差，每次樣品的檢測(cè)結(jié)果均須配以標(biāo)準(zhǔn)品及陰性對(duì)照加以校正，消除本底信號(hào)的干擾，其方法靈敏度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于普通PCR的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確，對(duì)個(gè)體微小的灘涂貝類品種的攝食選擇性分析研究，具有其他技術(shù)無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)。避免了由于貝類浮游或稚貝階段幼體太小，無(wú)法用傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡對(duì)胃含物進(jìn)行解剖觀察的缺陷；也彌補(bǔ)了顆粒計(jì)數(shù)儀在渾濁水體中，無(wú)法將各種無(wú)機(jī)、有機(jī)顆粒跟微藻顆粒區(qū)分開(kāi)，更無(wú)法區(qū)分開(kāi)粒度接近的微藻的不足。


圖Ia. 5種懼料微藻中角毛藻(Chaetoceros calcitrans)的FQ-PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖Ib. 5種懼料微藻中球等鞭金藻(Isochrysis galbana)的FQ-PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖Ic. 5種懼料微藻中青島大扁藻(Platymonas helgolandica)的FQ-PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線； 圖Id. 5種懼料微藻中綠色巴夫藻(Pavlova viridis)的FQ-PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線.圖Ie. 5種傅料微藻中微綠球藻(Nannochloropsis oculata)的FQ-PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。選擇灘涂貝類常用5種海洋微藻，分別是硅藻門的角毛藻(ChaetoceiOscalcitrans)、金藻門的球等鞭金藻(Isochrysis galbana)和綠色巴夫藻(Pavlova viridis)、綠藻門的青島大扁藻(Platymonas helgolandica)和微綠球藻(Nannochloropsis oculata),根據(jù)各微藻18S rDNA的序列可以設(shè)計(jì)出5對(duì)特異性引物(ChaF/ChaR、IsoF/IsoR、PlaF/PlaR、PavF/PavR 及 NanF/NanR)用于這 5 種微藻的區(qū)分(表
O表I五對(duì)餌料微藻的特異性引物序列
權(quán)利要求
1.一種基于定量PCR技術(shù)確定灘涂貝類攝食選擇性差異的分析方法，其特征在于對(duì)某種灘涂貝類投喂一定數(shù)量的混合微藻，攝食一段時(shí)間后對(duì)攝食前后灘涂貝類體內(nèi)的各微藻進(jìn)行定量PCR分析，根據(jù)各微藻在貝類體內(nèi)的比例確定該灘涂貝類對(duì)不同微藻選擇性攝食的差異。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分析方法，其特征在于灘涂貝類其品種為包括泥蚶、毛蚶、青蛤、縊蟶、彩虹明櫻蛤或者文蛤的所有灘涂貝類品種。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分析方法，其特征在于混合微藻其微藻品種采用目前灘涂貝類苗種培育過(guò)程中常用的金藻、角毛藻、扁藻、微綠球藻、骨條藻、小硅藻、三角褐脂藻，或者是從天然水域分離出的任何單細(xì)胞藻。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述的分析方法，其特征在于混合微藻在投喂前，于20±2°C，光照強(qiáng)度為18 27μπι01 ·πΓ2 · s—1的條件下，在錐形瓶中采用“NML3號(hào)”培養(yǎng)液，其配方為 IOOilOmg · !/1KNO3iIOilmg · L-1KH2PO4JOiSmg · L-1Na2SiO3,O.25 ± O. 025mg · IZ1MnSO4 · H2O, 2. 50 ±O. 25mg · IZ1FeSO4 · 7H20,10 ± Img · L^1EDTA-Na2,6±0· 6μ g .L-1VBpO. 05 + 0. 005 μ g .I^1VB12，進(jìn)行人工擴(kuò)大培養(yǎng)，每天搖瓶1-2次，靜置培養(yǎng)一周時(shí)間，通過(guò)顯微觀察和顆粒計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，待微藻細(xì)胞濃度達(dá)到80 120cell · μ Γ1,青島大扁藻細(xì)胞密度控制在15 20cell · μ Γ1時(shí)，微藻處于指數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)方可投喂稚貝。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述的分析方法，其特征在于灘涂貝類投喂混合微藻前，需要在經(jīng)過(guò)沙濾基本不含任何微藻的潔凈天然海水中不投餌饑餓8-lOh以盡量排空腸胃內(nèi)殘餌，后取I ±0. Ig濕重的貝類樣品并于_20°C以下冷凍保存以進(jìn)行定量PCR分析。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述的分析方法，其特征在于投喂時(shí)取一定數(shù)量某種灘涂貝類稚貝于一定體積的塑料容器內(nèi)，投喂一定量的混合微藻，投喂后取20±2mL的培養(yǎng)海水用O. 45±0. 045 μ m醋酸纖維濾膜過(guò)濾收集混合微藻樣品并于_20°C以下冷凍保存以進(jìn)行后期混合微藻的定量PCR分析；攝食O. 5-lh后取1±0. Ig濕重的貝類樣品并于_20°C以下冷凍保存以進(jìn)行定量PCR分析。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述的分析方法，其特征在于需要分別對(duì)投喂餌料的所述微藻18S rDNA進(jìn)行克隆、測(cè)序及序列分析，并獲得能夠通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)來(lái)區(qū)分此5種微藻的特異性引物(探針)，它們?yōu)?ChaF/ChaR、IsoF/IsoR、PlaF/PlaR、PavF/PavR 及 NanF/NanR0
8.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述的分析方法，其特征在于定量PCR分析須根據(jù)各餌料微藻的特異性引物分別對(duì)其基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并獲得目標(biāo)片段，以10倍拷貝數(shù)為濃度梯度的目標(biāo)片段構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品系列，通過(guò)優(yōu)化定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，建立正比于目標(biāo)片段的拷貝數(shù)的熒光信號(hào)相對(duì)Ct值的定量工作曲線作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，后通過(guò)檢測(cè)混合微藻中及攝食前后稚貝體內(nèi)各微藻的Ct值，依據(jù)各自的工作曲線分別計(jì)算出各樣品中各微藻的含量，以目標(biāo)片段拷貝數(shù)表示，從而確定各微藻在樣品的比例，最終根據(jù)比較水體中初始混合微藻的比例和貝類體內(nèi)攝食前后各微藻在混合微藻中的比例，確定出該灘涂貝類稚貝的對(duì)混合微藻中各微藻的攝食選擇性差異。
9.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述的分析方法，其特征在于定量PCR分析每次樣品的檢測(cè)結(jié)果均須配以標(biāo)準(zhǔn)品及陰性對(duì)照加以校正，消除本底信號(hào)的干擾。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于定量PCR技術(shù)確定灘涂貝類幼體攝食選擇性差異的分析方法，通過(guò)對(duì)某種灘涂貝類投喂一定數(shù)量的混合微藻，攝食一段時(shí)間后對(duì)攝食前后灘涂貝類體內(nèi)的各微藻進(jìn)行定量PCR分析，根據(jù)各微藻在貝類體內(nèi)的比例變化確定該灘涂貝類對(duì)不同微藻選擇性攝食的差異。本發(fā)明特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確，避免了由于貝類浮游或稚貝階段幼體太小，無(wú)法用傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡對(duì)胃含物進(jìn)行解剖觀察的缺陷；也彌補(bǔ)了顆粒計(jì)數(shù)儀在渾濁水體中，無(wú)法將各種無(wú)機(jī)、有機(jī)顆粒跟微藻顆粒區(qū)分開(kāi)，更無(wú)法區(qū)分開(kāi)粒度接近的微藻的不足。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102876771SQ20121014147
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月8日
發(fā)明者蘆文奇, 徐繼林, 周海波, 朱鵬, 徐正貴, 嚴(yán)小軍 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)