專利名稱：生態(tài)環(huán)境勘察中的微生物采集方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物采集方法，具體涉及一種生態(tài)環(huán)境勘察中的微生物采集方法。
背景技術(shù)：
叢枝菌根真菌(AMF)是一種普遍存在的內(nèi)共生真菌，它能夠與80%以上的陸生植物形成共生體。叢枝菌根真菌在維 持植物根際生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定、促進(jìn)植物的生長(zhǎng)、提高宿主植物的抗逆性和提高退化土壤質(zhì)量方面起著至關(guān)重要的作用。叢枝菌根真菌由菌根孢子(果)、叢枝體、泡囊、菌絲組成，它們都可以作為繁殖體。目前，菌根的分離純化主要采用孢子作為供體，土壤中小孢子果、孢子和土生輔助細(xì)胞通常利用濕篩法采集。利用單一孢子作為菌源有諸多不利因素，首先，孢子侵染速度中等，菌種繁殖體數(shù)量積累較慢；其次，濕篩過程中孢子量少的土壤中由于土粒和有機(jī)顆粒的干擾，不容易分離孢子；同時(shí)濕篩過程中體積較大或較小的顆粒可能丟失。雖然利用孢子作為繁殖體可得到純種，但是由單一菌源生產(chǎn)的菌劑在自然界中作用很難實(shí)現(xiàn)最大化，野外環(huán)境的改變、菌種之間的拮抗性和宿主植物對(duì)菌種的選擇性等都會(huì)對(duì)單一菌源造成影響，由此生產(chǎn)的菌劑野外難以推廣應(yīng)用。叢枝菌根真菌是專性活體營(yíng)養(yǎng)寄生菌，只有在活體植物根上形成菌根后才能繁殖成孢子和孢子果，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)很難復(fù)制菌根和宿主植物之間根際微環(huán)境，加之菌根繁殖體在土壤中的數(shù)量、存活時(shí)間、活性大小、侵染速率等方面差異性大，室內(nèi)難以篩選出適合野外生長(zhǎng)菌根菌群。因此，在隨著菌根在礦區(qū)生態(tài)重建、土壤修復(fù)以及農(nóng)業(yè)生物肥力等方面越來越廣的應(yīng)用情況下，野外原位采集叢枝菌根菌群和利用復(fù)合菌群生產(chǎn)菌劑就變的至關(guān)重要。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中叢枝菌根真菌采集方法的不足，本發(fā)明提供一種生態(tài)環(huán)境勘察中的微生物采集方法。本發(fā)明提供一種生態(tài)環(huán)境勘察中的微生物采集方法，所述微生物為叢枝菌根真菌，所述采集方法包括以下步驟(I)制作采集菌袋選取孔徑為30 μ m的布作為菌袋材料；用該菌袋材料制成菌袋；所述菌袋的一端設(shè)有開口 ；(2)制備供試基質(zhì)供試基質(zhì)為目標(biāo)采集區(qū)的土壤，將所述土壤過孔徑為1_的篩子，然后將過篩后的土壤滅菌并干燥備用；(3)將步驟(2)中得到的供試基質(zhì)裝入步驟(I)中制作的菌袋中，填裝完畢后，將所述菌袋的開口封閉；(4)將步驟(3)中得到的裝有供試基質(zhì)的菌袋緊靠宿主植物根部放置，放置完成
后，覆蓋土壤。優(yōu)選地，所述微生物采集方法具體包括以下步驟(I)制作采集菌袋選取孔徑為30 μ m的尼龍布作為菌袋材料；用該菌袋材料制成菌袋；所述菌袋的長(zhǎng)度為5 15cm、寬度為4 12cm、厚度為2 5cm ;菌袋的一端設(shè)有開Π ；(2)制備供試基質(zhì)供試基質(zhì)為目標(biāo)采集區(qū)的土壤，將所述土壤過孔徑為1_的篩子，然后將過篩后的土壤滅菌并干燥備用；(3)將步驟(2)中得到的供試基質(zhì)裝入步驟(I)中制作的菌袋中，每個(gè)菌袋的填裝量為50 150g，填裝完畢后，將所述菌袋的開口封閉；(4)將步驟(3)中得到的裝有供試基質(zhì)的菌袋緊靠宿主植物根部放置，所述菌袋的放置方式為垂直放置，放置完成后，覆蓋土壤。步驟(4)中，裝有供試基質(zhì)的菌袋緊靠宿主植物根部放置包括將貼近所述宿主植物根部的土壤挖去，然后將所述裝有供試基質(zhì)的菌袋緊靠宿主植物根部放置。步驟(I)中，所述菌袋具有防腐功能，即在宿主植物的一個(gè)生長(zhǎng)季中，該菌袋在土壤中不會(huì)腐爛。 優(yōu)選地，步驟(I)中，所述菌袋的長(zhǎng)度為10cm、寬度為8cm、厚度為3cm ;且步驟(3)中，每個(gè)菌袋的填裝量為I00g。優(yōu)選地，步驟⑴中，所述菌袋的一端具有牽引繩。采集時(shí)，所述牽引繩系在宿主植物的莖干部，便于回收所述菌袋。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，為了方便，所述牽引繩優(yōu)選設(shè)置在所述菌袋具有開口
的一端。進(jìn)一步地，為了使得所述菌袋能夠垂直放置，所述牽引繩更優(yōu)選設(shè)置在開口的一端的中部。步驟(2)中，所述滅菌可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方式進(jìn)行；優(yōu)選地，所述滅菌采用高溫高壓蒸汽滅菌。步驟(3)中，所述開口的封閉可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方式進(jìn)行，例如采用縫合的方式將開口封閉。本發(fā)明提供的生態(tài)環(huán)境勘察中的微生物采集方法，進(jìn)一步包括以下步驟在所述宿主植物一個(gè)生長(zhǎng)季后，除去所述菌袋上部的土壤，取出所述菌袋，然后對(duì)所述菌袋內(nèi)的包括孢子密度、菌絲密度、菌絲長(zhǎng)度的指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。這些測(cè)定方法可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進(jìn)行，例如孢子密度采用濕篩傾注法、菌絲密度采用網(wǎng)格交叉法。本發(fā)明的生態(tài)環(huán)境勘察中的微生物采集方法，利用孔徑為30μπι的尼龍布制作菌袋采集菌絲體和孢子。菌絲體直徑為3 7μ ，這樣菌絲體可自由進(jìn)入菌袋，而宿主植物根系等很難進(jìn)入，此種情況下，宿主植物局部根系為獲得養(yǎng)分，就迫使其共生體菌根及其附屬物進(jìn)入菌袋。菌袋中的供試基質(zhì)經(jīng)過過篩和滅菌，一定程度改善了供試基質(zhì)的質(zhì)地，同時(shí)排除了其它微生物的干擾，更有利于菌根及其附屬物的生長(zhǎng)。現(xiàn)有技術(shù)中，叢枝菌根分離每樣需采集土樣I. 5 2kg，然后在從這些土樣中分離孢子，這樣工作量往往較大。利用本發(fā)明的生態(tài)環(huán)境勘察中的微生物采集方法采集叢枝菌根很大程度解決了野外叢枝菌根采集的難題，菌袋內(nèi)的供試基質(zhì)只有約100g，同時(shí)人為地改變了菌袋內(nèi)供試基質(zhì)的理化性狀及其質(zhì)地，更有利于孢子和菌絲體的富集，這樣很大程度上縮小了篩選范圍并減少了工作量。利用本發(fā)明的生態(tài)環(huán)境勘察中的微生物采集方法，其中所述菌袋可以富集孢子和菌絲體，并將其作為菌劑生產(chǎn)的菌源，這就為野外生產(chǎn)叢枝菌根菌劑提供技術(shù)支持，也為菌劑在不同區(qū)域內(nèi)推廣應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。尼龍布購(gòu)自北京市崇文振興金屬絲網(wǎng)商店，孔徑為30μπι。孢子密度采用濕篩傾注法進(jìn)行測(cè)定；菌絲密度采用網(wǎng)格交叉法進(jìn)行測(cè)定。實(shí)施例I :(陜西榆林活雞兔礦塌陷區(qū)叢枝菌根真菌的原位采集)選取孔徑為30 μ m的尼龍布作為菌袋材料。該菌袋具有防腐功能，在宿主植物的一個(gè)生長(zhǎng)季中，該菌袋在土壤中不會(huì)腐爛。菌袋的長(zhǎng)度為10cm、寬度為8cm，菌袋的厚度為3cm;菌袋的一端設(shè)有開口 ；開口端的中部設(shè)有牽引繩。
供試基質(zhì)采集地點(diǎn)位于陜西榆林神木縣大柳塔鎮(zhèn)高家畔，屬于神東礦區(qū)活雞兔礦采空塌陷區(qū)，供試基質(zhì)為該塌陷區(qū)的退化土壤，并過孔徑為1_的篩子，過篩后的土壤在裝入上述菌袋前經(jīng)高溫高壓蒸汽滅菌(12rc，2h)，自然風(fēng)干。 將上述供試基質(zhì)裝入上述菌袋中，每個(gè)菌袋裝入供試基質(zhì)100g，填裝完畢后，將所述菌袋的開口縫合。宿主植物為紫穗槐，紫穗槐選自活雞兔礦塌陷區(qū)微生物復(fù)墾示范基地。供試紫穗槐的平均株高為43. 3cm，冠幅為26cm。試驗(yàn)于2011年4月17日進(jìn)行，此時(shí)神東礦區(qū)的土壤已融凍，宿主植物處于返青季節(jié)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)20個(gè)重復(fù)，即選擇20株紫穗槐作為宿主植物，按照S型曲線選取紫穗槐，所選擇的20株紫穗槐大小相近。將貼近紫穗槐根部的土壤挖去，然后將上述裝有供試基質(zhì)的菌袋緊靠紫穗槐根部垂直放置，放置深度為15cm，放置完成后覆蓋土壤，并將菌袋的牽引繩系在紫穗槐的莖干部，以便回收菌袋。10月初取回所述菌袋并采集宿主植物根際土壤。10月正是研究區(qū)冰凍季節(jié)，該區(qū)的植物已停止生長(zhǎng)，本試驗(yàn)是宿主植物的一個(gè)生長(zhǎng)季。對(duì)采集的根際土壤和回收的菌袋內(nèi)供試基質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。宿主植物根際土壤中孢子密度、菌絲密度和IOOg土壤菌絲長(zhǎng)度分別為15個(gè)/g、3. 19m g—1和319m。對(duì)回收的菌袋內(nèi)的孢子密度、菌絲密度和菌絲長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)定，菌袋內(nèi)的孢子密度高達(dá)33個(gè)/g、菌絲密度為6. 04m · g'菌袋內(nèi)總菌絲長(zhǎng)度為604m。所述菌袋內(nèi)的孢子密度和菌絲密度要比紫穗槐根際土壤分別高出18個(gè)/g和2. 85m · g'說明本發(fā)明的微生物采集方法可以大大提高野外叢枝菌根真菌的采集量和采集速度。實(shí)施例2 (神東礦區(qū)補(bǔ)連塔礦塌陷區(qū)叢枝菌根真菌的原位采集)選取孔徑為30 μ m的尼龍布作為菌袋材料。該菌袋具有防腐功能，在宿主植物的一個(gè)生長(zhǎng)季中，該菌袋在土壤中不會(huì)腐爛。菌袋的長(zhǎng)度為10cm、寬度為8cm，菌袋的厚度為3cm;菌袋的一端設(shè)有開口 ；開口端的中部設(shè)有牽引繩。試驗(yàn)地選在神東礦區(qū)補(bǔ)連塔礦，供試基質(zhì)為該礦塌陷區(qū)退化土壤，并過孔徑為1_的篩子，過篩后的土壤經(jīng)高溫高壓蒸汽滅菌(121°C，2h)，自然風(fēng)干。將上述供試基質(zhì)裝入上述菌袋中，每個(gè)菌袋裝入供試基質(zhì)100g，填裝完畢后，將所述菌袋的開口縫合。宿主植物為沙柳。沙柳的平均株高為136. 5cm，冠幅為96. 2cm。
試驗(yàn)于2011年4月18日進(jìn)行，此時(shí)神東礦區(qū)的土壤已融凍，宿主植物處于返青季節(jié)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)20個(gè)重復(fù)，即選擇20株沙柳作為宿主植物，按照S型曲線選取紫穗槐，所選擇的20株紫穗槐大小相近。將貼近沙柳根部的土壤挖去，然后將上述裝有供試基質(zhì)的菌袋緊靠沙柳根部垂直放置，放置深度為15cm，放置完成后覆蓋土壤，并將菌袋的牽引繩系在沙柳的莖干部，以便回收菌袋。10月初取回所述菌袋并采集宿主植物根際土壤，對(duì)回收的菌袋內(nèi)的供試基質(zhì)和沙柳根際土壤中孢子密度、菌絲密度和IOOg土壤中菌絲長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果，菌袋內(nèi)的孢子密度、菌絲密度和菌絲長(zhǎng)度分別達(dá)到21個(gè)/g、4. 74m -g^1和4. 74m,而根際土壤中孢子密度、菌絲密度和菌絲長(zhǎng)度分別為11個(gè)/g、l. 91m · g—1和I. 91m。所 述菌袋內(nèi)的孢子密度和菌絲密度要比沙柳根際土壤高出10個(gè)/g和2. 83m · g'說明本發(fā)明的微生物采集方法可以顯著提高野外叢枝菌根真菌的采集率，縮短叢枝菌根真菌的采集時(shí)間。實(shí)施例3 (寧夏煤矸石山復(fù)墾區(qū)叢枝菌根真菌的原位采集)選取孔徑為30 μ m的尼龍布作為菌袋材料。該菌袋具有防腐功能，在宿主植物的一個(gè)生長(zhǎng)季中，該菌袋在土壤中不會(huì)腐爛。菌袋的長(zhǎng)度為10cm、寬度為8cm，菌袋的厚度為3cm;菌袋的一端設(shè)有開口 ；開口端的中部設(shè)有牽引繩。試驗(yàn)地點(diǎn)在寧夏大武口洗煤廠煤矸石山，該地位于寧夏回族自治區(qū)石嘴山市，屬于中溫帶干旱氣候區(qū)，降水稀少而集中，光照充足，蒸發(fā)強(qiáng)烈，空氣干燥，極不利于植物的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)地點(diǎn)選擇煤矸石山上，煤矸石山上鋪了 O. 8 Im厚的河沙作為生長(zhǎng)基質(zhì)，試驗(yàn)區(qū)為中國(guó)礦業(yè)大學(xué)(北京)礦區(qū)微生物復(fù)墾示范基地。供試基質(zhì)為矸石山上廢棄砂質(zhì)，并過孔徑為Imm的篩子，過篩后經(jīng)高溫高壓蒸汽滅菌(12rC，2h)，自然風(fēng)干。將上述供試基質(zhì)裝入上述菌袋中，每個(gè)菌袋裝入供試基質(zhì)100g，填裝完畢后，將所述菌袋的開口縫合。宿主植物是當(dāng)?shù)叵蠕h植株白蠟，白蠟的平均株高為217cm，冠幅為151cm。試驗(yàn)于2011年4月25日進(jìn)行，此時(shí)寧夏地區(qū)的土壤已融凍，宿主植物處于返青季節(jié)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)20個(gè)重復(fù)，即選擇20株白蠟作為宿主植物，按照S型曲線選取白蠟，所選擇的20株白蠟大小相近。將貼近白蠟根部的土壤挖去，然后將上述裝有供試基質(zhì)的菌袋緊靠白蠟根部垂直放置，放置深度為15cm，放置完成后覆蓋土壤，并將菌袋的牽引繩系在白蠟的莖干部，以便回收菌袋。10月初取回菌袋并采集宿主植物根際土壤，對(duì)回收菌袋內(nèi)的供試基質(zhì)和白蠟根際土壤孢子密度、菌絲密度和IOOg土壤中菌絲長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果，菌袋內(nèi)孢子密度、菌絲密度和菌絲長(zhǎng)度分別為28個(gè)/g、5. 66m · g—1和566m，而白蠟根際土壤中孢子密度、菌絲密度和菌絲長(zhǎng)度分別為13個(gè)/g、2. 81m · g—1和281m。所述菌袋內(nèi)的孢子密度和菌絲密度要比白蠟根際土壤高出15個(gè)/g和2. 85m · g'說明本發(fā)明的微生物采集方法可以顯著提高野外叢枝菌根真菌的采集率，縮短叢枝菌根真菌的采集時(shí)間。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，在本說明書的教導(dǎo)之下，可以對(duì)本發(fā)明做出一些修改或變化。這些修改和變化也應(yīng)當(dāng)在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種生態(tài)環(huán)境勘察中的微生物采集方法，所述微生物為叢枝菌根真菌，所述采集方法包括以下步驟 (1)制作采集菌袋選取孔徑為30u m的布作為菌袋材料；用該菌袋材料制成菌袋；所述菌袋的一端設(shè)有開口； (2)制備供試基質(zhì)供試基質(zhì)為目標(biāo)采集區(qū)的土壤，將所述土壤過孔徑為Imm的篩子，然后將過篩后的土壤滅菌并干燥備用； (3)將步驟(2)中得到的供試基質(zhì)裝入步驟(I)中制作的菌袋中，填裝完畢后，將所述菌袋的開口封閉； (4)將步驟(3)中得到的裝有供試基質(zhì)的菌袋緊靠宿主植物根部放置，放置完成后，覆蓋土壤。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微生物采集方法，其特征在于，所述采集方法具體包括以下步驟 (1)制作采集菌袋選取孔徑為30的尼龍布作為菌袋材料；用該菌袋材料制成菌袋；所述菌袋的長(zhǎng)度為5 15cm、寬度為4 12cm、厚度為2 5cm ;菌袋的一端設(shè)有開口 ； (2)制備供試基質(zhì)供試基質(zhì)為目標(biāo)采集區(qū)的土壤，將所述土壤過孔徑為1_的篩子，然后將過篩后的土壤滅菌并干燥備用； (3)將步驟⑵中得到的供試基質(zhì)裝入步驟⑴中制作的菌袋中，每個(gè)菌袋的填裝量為50 150g，填裝完畢后，將所述菌袋的開口封閉； (4)將步驟(3)中得到的裝有供試基質(zhì)的菌袋緊靠宿主植物根部放置，所述菌袋的放置方式為垂直放置，放置完成后，覆蓋土壤。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物采集方法，其特征在于，步驟(4)中，裝有供試基質(zhì)的菌袋緊靠宿主植物根部放置包括將貼近所述宿主植物根部的土壤挖去，然后將所述裝有供試基質(zhì)的菌袋緊靠宿主植物根部放置。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微生物采集方法，其特征在于，步驟(I)中，所述菌袋的長(zhǎng)度為10cm、寬度為8cm、厚度為3cm ;且步驟(3)中，每個(gè)菌袋的填裝量為100g。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微生物采集方法，其特征在于，步驟(I)中，所述菌袋的一端具有牽引繩。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的微生物采集方法，其特征在于，所述牽引繩設(shè)置在所述菌袋具有開口的一端，并設(shè)置在所述具有開口的一端的中部。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微生物采集方法，其特征在于，步驟(2)中，所述滅菌是采用高溫高壓蒸汽滅菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求I 7任一項(xiàng)所述的微生物采集方法，其特征在于，所述微生物采集方法進(jìn)一步包括以下步驟 在所述宿主植物一個(gè)生長(zhǎng)季后，除去所述菌袋上部的土壤，取出所述菌袋，然后對(duì)所述菌袋內(nèi)的包括孢子密度、菌絲密度、菌絲長(zhǎng)度的指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生態(tài)環(huán)境勘察中的微生物采集方法。所述微生物采集方法中的微生物為叢枝菌根真菌，所述采集方法包括步驟制作采集菌袋、制備供試基質(zhì)、將所述供試基質(zhì)裝入所述菌袋并封閉以及投放所述菌袋。利用本發(fā)明的生態(tài)環(huán)境勘察中的微生物采集方法，其中所述菌袋可以富集孢子和菌絲體，在很大程度上縮小了篩選范圍并減少了工作量。
文檔編號(hào)C12N1/14GK102757901SQ20121013510
公開日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2012年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月28日
發(fā)明者張凱, 畢銀麗 申請(qǐng)人:中國(guó)礦業(yè)大學(xué)(北京), 中國(guó)神華能源股份有限公司