專利名稱：一種檢測洼地綿羊繁殖力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種檢測洼地綿羊繁殖力的方法。
背景技術(shù)：
FecB基因1985年在澳大利亞的Booroola Merino綿羊品種中發(fā)現(xiàn),是被形容為影響綿羊排卵率和繁殖力的第一個主效基因。Booroola突變，即BMPR-IB位點編碼區(qū)的點突變，已經(jīng)通過雜交進入其他的綿羊品種中，并且在自然狀態(tài)下也發(fā)現(xiàn)了除Booroola Merino 綿羊以外的其他的多產(chǎn)的綿羊品種。FecB基因定位在綿羊6號染色體6q23 q31的狹窄區(qū)域內(nèi)，位于骨橋蛋白和表皮生長因子之間。FecB位點的基因型分配，開始是基于檢測排卵率和產(chǎn)蓋記錄上，后來用于遺傳標記與Booroola基因的聯(lián)系,如今可以通過在BMPR-IB位點的個體的分子基因分型來得到。ー個FecB拷貝增加排卵數(shù)I. 3枚-I. 6枚，兩個FecB拷貝增加排卵數(shù)2. 7枚-3. 0枚，攜帶ー個FecB拷貝的母羊繁殖力增加0. 9只-I. 2只，攜帶兩個FecB拷貝的母羊繁殖力増加I. I只-I. 7只(儲明星，狄冉，葉素成，方麗，劉忠慧，彭志蘭，張跟喜，賈麗華，孫潔，馮濤.綿羊多胎主效基因FecB分子檢測方法的建立與應用[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2009，17 (I) :52-58)。洼地綿羊(簡稱洼羊)，是分布于魯北鹽堿洼地濱海地區(qū)的優(yōu)良地方綿羊品種。經(jīng)考證，洼地綿羊是從明朝時期經(jīng)400多年馴化、適應、選育，在濱海地區(qū)逐漸形成的獨具特色的優(yōu)良地方品種。洼地綿羊一年四季均可發(fā)情，春秋兩季尤為明顯。頭胎產(chǎn)羔率與小尾寒羊無明顯差異，屬于多胎綿羊品種。洼地綿羊具有耐粗飼，生長較快的特點。從體型看，洼地綿羊無角，四肢短而結(jié)實，方尾，而且性格溫順不好斗，使得洼地綿羊屠宰率高、生長發(fā)育快。經(jīng)過長期選育，洼地綿羊適應了當?shù)刎汃さ牟輬?，常年放牧鍛煉了羊群體質(zhì)。尤其當?shù)貫I海濕地鹽堿嚴重，對羊蹄的腐蝕性很強，其他品種羊很難適應。而洼地羊很好適應了當?shù)丨h(huán)境，具有抗腐蹄能力。Montgomery等(1993)首次發(fā)現(xiàn)FecB基因與微衛(wèi)星標記OarAElOl和0arHH55緊密連鎖，距離分別為13cM和20cM，而此兩個基因又與定位在人染色體HSA4qll ql2上的分泌型磷酸蛋白I基因(SSPl)的ー個RFLP標記連鎖。隨后該研究組采用連鎖分析法，對Booroola羊半同胞家系和17個全同胞家系進行了研究，發(fā)現(xiàn)血小板生長因子受體a基因(platelet-derived growth factor receptor-alpha gene, PDGFRA)與 a SI 酪蛋白基因(alpha sl-casein gene, CSN1S1)及微衛(wèi)星標記BM143和0arHH55連鎖，遺傳距離分別為12cM、29cM、33cM。Lord等用微衛(wèi)星OarAElOl和BM1329作標記來研究FecB基因時，發(fā)現(xiàn)FecB基因存在于OarAElOl位點的97bp等位基因以及BM1329位點的162bp等位基因上，因此FecB基因被進ー步定位于6號染色體的BM1329和OarAElOl之間IOcM連鎖群中(Montgomery G ff, et al. Nat Genet,1993,4(4) :410-414)。Montgomory進ー步的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ecB基因與EGF(表皮生長因子)基因連鎖，其距離為26cM,而EGF定位于人染色體的4q25上,這是邁向FecB突變位置克隆的重要ー步(Montgomery G W, et al. Genomics, 1994, 22 (I) :148-153)。Wilson 等(2001)在前人的研究基礎(chǔ)上，將FecB基因進ー步定位在羊6號染色體6q23 q31，與人染色體4q21 q25同線性。另有報道，將綿羊6號染色體上的基因定位在豬的8號染色體上，同時在8號染色體發(fā)現(xiàn)了一個提高排卵率的位點(Wilson T, et al. Biol Reprod, 2001,64 (4) :1225-1235)。Wilson等、Souza等、Mulsant等(2001)幾乎同時發(fā)現(xiàn)，與FecB基因所在的綿羊6號染色體區(qū)域同線性的人4號染色體q22 q23上的骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體IB基因(BMPR-IB)與Booroola Merino羊的排卵率相關(guān)聯(lián)。
Eli sha Go otwine 等(2008)通過對 FecB 位點的++ 和 B+ 基因型繁殖力的調(diào)查，結(jié)果顯示，B位點在繁殖力上具有乘法效應，因為B+基因型的繁殖力顯著高于++基因型的繁通力(P < 0. O5) (Elisha Gootwine, Shay Reicher, Alexander Rozov.Proliiicacy and lamb survival at birtn in Awassi and Assaf sheep carrying theFecB (Booroola)mutation. [J]. Animal Reproduction Science,2008，108 (2) :402-411)。A. K. Mishra等(2009)通過對51只Garole和Malpura的雜交綿羊的繁埴カ分祈，結(jié)果顯示，累計一生的產(chǎn)仔數(shù)(CLS)，累計羔羊的斷奶數(shù)(CWL)和以及累計母羊的繁殖效率(CEPE)在雜交母羊上，B+基因型相対的比++基因型的母羊要高(A.K.Mishra，A. L. Arora, S. Kumar, L. l.L.Prince. Studies on effect of Booroola(FecB) genotype onlifetime ewes productivity efficiency, litter size and number of weaned lambsin Garole XMalpura sheep[J]. Animal Reproduction Science,2009,113(3) :293-298)；S. Kumar等(2008)通過PCR-RFLP的實驗方法，在Kendrapada綿羊中發(fā)現(xiàn)FecB突變,在46個Kendrapada綿羊個體中，26個BB基因型，15個B+基因型，5個++基因型，B的基因型頻率約為0. 73，結(jié)果表明，盡管FecB突變頻率很高，但該基因并不像在Garole綿羊中所報道的那樣，在群體中是不固定的(S. Kumar, A. K. Mishra, A. P. Kolte, S. K. Dash,S. A. Karim. Screening for Booroola(FecB) and Galway (FecXG) mutations in Indiansheep[J]. Small Ruminant Research,2008,80(4) :57-61)。王根林等(2003)年利用限制性酶切片段多態(tài)性PCR技術(shù)，檢測湖羊、小尾寒羊和新疆細毛羊的DNA樣本，發(fā)現(xiàn)湖羊和小尾寒羊中存在FecB多胎基因，而新疆細毛羊均不攜帶Booroola基因(王根林,毛鑫智,George H Davis,趙宗勝，張利軍，曾永慶 DNA分析發(fā)現(xiàn)我國湖羊和小尾寒羊存在B00r00la(FecB)多胎基因[J].南京農(nóng)業(yè)大學學報，2003，26 (I)104-106)。張利平(2004)對FecB基因的發(fā)現(xiàn)，定位，關(guān)聯(lián)和應用等做了較為全面的分析表明，BMPR-IB基因的突變與FecB基因的行為完全一致，證明BMPR-IB基因是控制BooroolaMerino羊高繁殖力特性的主效基因(張利平.Booroola羊多胎基因FecB的研究進展[A], 2003-2004年全國養(yǎng)羊生產(chǎn)與學術(shù)研討會議論文集，2004.)。柳楠等(2010)證明了在小尾寒羊與薩福克和杜泊綿羊的雜交群體中，多胎基因FecB檢測多態(tài)性效果顯著，可以作為培育肉用綿羊新品系的有效候選基因(柳楠，柳曉曉，劉猛，曲緒仙，王金文，李晶.FecB和BMP15基因作為肉用綿羊育種候選基因的研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010年I月(上)39-40)。崔緒奎等(2010)利用綿羊多胎基因FecB分子檢測技術(shù)，檢測分析了杜寒雜交肉羊基因型及對繁殖力和羔羊生長發(fā)育的影響。發(fā)現(xiàn)FecB基因不僅是影響杜寒雜交肉羊繁殖力的主效基因，而且在一定時期內(nèi)頁影響羔羊的生長發(fā)育(崔緒奎，王金文，王德芹，張果平，王可，黃慶華，孟憲鋒.FecB基因?qū)Χ臱寒雜交肉羊繁殖力及羔羊生長發(fā)育的影響[J].山東農(nóng)業(yè)科學，2010，8 =98-100)。王金文等(2010)證明了 FecB基因可能是控制魯西肉羊多高性狀的主效基因，該記過為培育魯西肉羊多胎品系奠定了理論基礎(chǔ)(王金文，崔緒奎，張果平，王德芹，王可，黃慶華，孟憲鋒.利用FecB基因選育魯西肉羊多胎品系研究[J].家畜生態(tài)學報，2010，31 (5)23-25)。李鳳娥(2010)對FecB基因的提出、基因型判定、生理效應以及分離克隆等方面做了全面的綜述(李鳳娥，熊遠著.綿羊FecB基因分離克隆的研究進展[J]. Animal ScienceAbroad,2010,28(6) :42-44)。任艷玲等(2011)從分子水平上研究洼地綿羊的多羔機制，采 用PCR-RFLP方法分析了洼地綿羊中FecB基因多態(tài)性及其繁殖力的關(guān)系，經(jīng)統(tǒng)計分析，BB和B+基因型洼地綿羊的繁殖力顯著高干++基因型，顯示FecB基因可能是洼地綿羊多羔性能主效基因之一(任艷玲，沈志強，李敏等.洼地綿羊FecB基因多態(tài)性與繁殖力關(guān)系的研究.中國畜牧獸醫(yī)，2011，38(7) :159-162)。很多的科學家還對綿羊微衛(wèi)星基因與FeCB基因的多態(tài)及連鎖進行了大量的分析。張寶云等(2009)的研究結(jié)果表明微衛(wèi)星座位300U只能在一定程度上反映FecB座位信息(張寶云，儲明星，王憑青，方麗，狄冉.綿羊微衛(wèi)星300U和FecB基因的多態(tài)及連鎖分析[J].中國農(nóng)業(yè)大學學報，2009，14(5) :86-92)。李延璐等(2009)的研究表明，連鎖不平衡分析顯示小尾寒羊FecB基因B等位基因與BMS2508微衛(wèi)星座位IOObp等位基因之間存在一定的連鎖不平衡，而+等位基因與BMS2508微衛(wèi)星座位IlObp和114bp等位基因均存在一定的連鎖不平衡(李延璐，儲明星，陳宏權(quán)，方麗，狄冉，馬月輝，李奎.綿羊微衛(wèi)星BMS2508和FecB基因的多態(tài)及連鎖分析[J],遺傳，2009,31(5) :500-507)。儲明星等(2009)的研究結(jié)果表明，0arJL36微衛(wèi)星座位182bp等位基因與小尾寒羊FecB基因B等位基因之間存在較強的連鎖關(guān)系，是與小尾寒羊多羔主效基因緊密連鎖的ー個遺傳標記(儲明星，張寶云，王憑青，方麗，狄冉，馬月輝，李奎.綿羊微衛(wèi)星Oar幾36和FecB基因的多態(tài)及連鎖分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2009，42 (6) :2133-2141)。張林等(2009)等的研究表明，LSCV043微衛(wèi)星座位98bp等位基因與小尾寒羊FecB基因B等位基因之間存在一定的連鎖不平衡關(guān)系，是與小尾寒羊多羔主效基因緊密連鎖的ー個遺傳標記(張林，李春苗，儲明星，陳宏權(quán)，李學偉，方麗，狄冉，馬月輝，李奎.小尾寒羊微衛(wèi)星座位LSCV043和FecB基因的連鎖分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2009，17 (4) :621-628)。據(jù)《中國羊品種志》記載(《中國羊品種志》編寫組，1989)，洼地綿羊平均產(chǎn)活羔數(shù)為2. 80，為我國的多胎綿羊品種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測洼地綿羊繁殖力的方法。本發(fā)明所提供的檢測洼地綿羊繁殖力的方法，是檢測待測洼地綿羊基因組中的FecB基因的第746位核苷酸為A還是突變?yōu)镚，從而確定洼地綿羊的基因型，然后通過基因型確定洼地綿羊繁殖力；所述FecB基因的核苷酸序列GENBANK ACCESS 10NNUMBER為AF357007的第156bp至3255bp位核苷酸；
所述確定洼地綿羊的基因型的方法為如果洼地綿羊基因組中的FecB基因的第746位核苷酸為A時，其純合體的基因型為++ ;洼地綿羊基因組中的FecB基因的第746位核苷酸為G時，其純合體的基因型為BB ;它們的雜合體基因型為B+ ；通過基因型確定洼地綿羊繁殖力的方法為所述BB基因型洼地綿羊的繁殖力高于B+基因型洼地綿羊，B+基因型洼地綿羊的繁殖力高于++型洼地綿羊。所述檢測洼地 綿羊基因組中的FecB基因的第746位核苷酸為A還是突變G的方法有兩種，第一種為利用PCR方法擴增洼地綿羊基因組中的核苷酸序列GENBANK ACCESSIONNUMBER為AF357007的第626bp至813位核苷酸的片段，并將該擴增產(chǎn)物進行SSCP檢測，均得到兩條電泳條帶，兩條帶距離最遠，條帶且較細的為++基因型，兩條帶距離最近，條帶也較細的為BB基因型，兩條帶較粗，且相距距離為前兩者之間的為B+基因型(如圖2);第ニ種為利用PCR方法擴增洼地綿羊基因組中的核苷酸序列GENBANK ACCESSION NUMBER為AF357007的第638bp至778位核苷酸的片段，并將擴增產(chǎn)物進行RFLP檢測，若能出現(xiàn)兩個條帶，且分別位于140bp和IlObp,為B+基因型,若能出現(xiàn)一個條帶,且位于140bp,為++基因型，若能出現(xiàn)ー個條帶，且位于llObp，為BB基因型(如圖3)。所述方法中，所述PCR方法的擴增弓丨物對為具有序列表中序列I、2、3、4所述的核苷酸。所述方法中，所述繁殖力為每胎產(chǎn)羔數(shù)。本發(fā)明方法，采用單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single strand conformationpolymorphism, SSCP)和限制性內(nèi)切酶片段多態(tài)性(restriction fragment lengthpolymorphism, RFLP)方法對在FecB基因進行單核昔酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphism, SNP)檢測，以比較FecB基因在洼地綿羊品種中的多態(tài)性，并對具有SSCP和RFLP多態(tài)性的DNA片段進行測序比較分析，尋找到與繁殖力(繁殖力)相關(guān)的遺傳標記，數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果表明，該遺傳標記多態(tài)性可確定洼地綿羊繁殖力。本發(fā)明的方法即利用該遺傳標記，建立SSCP和RFLP檢測洼地綿羊的基因型，并利用該基因型確定其繁殖力的有效方法，實驗證明，該方法可以迅速、簡便的檢測洼地綿羊的繁殖力。本發(fā)明的方法為綿羊的分子育種提供了一個準確簡便的檢測其繁殖力的方法。


圖I為FecB基因的兩對引物(P1、P2)的PCR產(chǎn)物。圖2為引物Pl對洼地綿羊擴增片斷的SSCP分析。圖3為引物P2對洼地綿羊擴增片段的RFLP分析。
具體實施例方式下述實施例中提到的實驗方法，如無特別說明均為常規(guī)方法。下述實施例中所用主要試劑10PCR Buffer, dNTP, Taq DNA聚合酶，DNA MakerpBR322/Hae III，Avail限制性內(nèi)切酶PCR引物等均購自上海生物工程公司。實施例I、檢測洼地綿羊繁殖力的方法的建立及其效果驗證I、檢測洼地綿羊繁殖力的方法的建立I)模板材料準備
采集洼地綿羊的耳組織樣并記錄繁殖力和胎次，所采集洼地綿羊98只采自山東濱州地區(qū)。采用酚-氯仿法抽提綿羊的基因組DNA，滅菌TE溶解稀釋后_20°C保存?zhèn)溆谩?)引物設計根據(jù)GenBank報道的綿羊FecB基因完全的編碼序列(AF357007)，用Oligo 7. 0軟件在編碼區(qū)序列(GENBANK ACCESSION NUMBER為AF357007的第156bp至3255bp位核苷酸)處設計兩對引物，引物由上海生エ生物技術(shù)有限公司合成。引物序列和擴增片段大小如下引物I 用于 PCR-SSCP 檢測，F(xiàn) :5' -AGATTGGAAAAGGTCGCTATG-3' (SEQ ID No. I)；R 5 ' -ACCCTGAACATCGCTAATACA-3 ' (SEQ ID No. 2)，擴增 187bp 的片段(自 GENBANKaccession number 為 AF357007 的第 626bp 至 812 位核昔酸序列，見 SEQ ID No. 5)。引物2 用于 PCR-RFLP 檢測，F(xiàn) :5 ' -GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3 ' (SEQ IDNo. 3) ；R :5' -CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC-3' (SEQ ID No. 4)，擴增 140bp 的片段(自 GENBANK accession number 為 AF357007 的第 638bp 至 777 位核苷酸序列，見 SEQ IDNo. 6)。以步驟I得到的從洼地綿羊?qū)嶒灢牧咸崛〉幕蚪M基因為模板，分別用上述引物進行PCR擴增。 PCR擴增體系如下引物I和引物2的PCR擴增體系相同。PCR擴增體系的總體積為 20iiL，其中 IOXBuffer 2. 5 y L (含 Mg2+)，I Ommo I/LdNTP 2 y L，10 y mol/L 上下游引物各 I. 0 ii L，IOOng/ u LDNA 模版 I u L, rTaq 酶 0. 3 y L，去離子水 12. 2u L0PCR擴增條件如下引物I為94°C預變性5min，94°C變性30s, 55. 2°C退火30s，72°C延伸30s，32個循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保存。引物2為94°C預變性5min，94°C變性30s, 64. 6°C退火 30s，72°C延伸 30s, 31 個循環(huán)，72°C延伸 10min，4°C保存。將所設計的兩對引物對洼地綿羊的基因組進行擴增得到的PCR產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物檢測5iiL擴增產(chǎn)物加2iiL緩沖液(0. 05%ニ甲苯蘭；0. 05%溴酚蘭；0. 02mol/L EDTA，加甲酰胺至10ml)，DNA Marker用量為3 yし室溫下120V電壓
2.5h，銀染顯色。結(jié)果表明擴增片段與目的片段大小一致且特異性好(圖I)，可直接進行SSCP和RFLP分析。圖I中泳道1-6為引物2擴增得到的片段的電泳圖，7-11為引物I擴增得到的片段的電泳圖；圖I中泳道M為pBR322marker。3) SSCP 分析和 RFLP 分析SSCP 分析分別對步驟I)得到的兩對引物在洼地綿羊中擴增的PCR產(chǎn)物分別進行SSCP分祈，具體方法如下所述吸取10 y L PCR擴增產(chǎn)物與10 y L變性緩沖液混合；置于基因擴增儀中，98°C變性lOmin，取出后置于冰盒放置_25°C冰箱5min完成變性；切斷電源，將已變性的混合液用IOy L的移液器點入每個膠孔中，接通電源，220V電壓15min，觀察到溴酚蘭和ニ甲苯氰兩條帶分開后，120V恒壓電泳IOh,銀染顯色。用Alphalmager 2200 and 1220Documentation and Analysis Systems(Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA,USA)拍照和分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)引物I擴增片段有3種基因型，命名為BB、B+、++(圖2)，即擴增產(chǎn)物非變性聚丙烯酰胺電泳均得到兩條帯。兩條帶距離最遠，條帶且較細的為++基因型(圖2中泳道1，2，3)，兩條帶距離最近，條帶也較細的為BB基因型(圖2中泳道7，8，9)，兩條帶較粗，且相距距離為前兩者之間的為B+基因型(圖2中泳道4，5，6)。圖2中，泳道I，2，3為++基因型；泳道4，5，6為B+基因型；泳道7，8，9為BB基因型。RFLP 分析分別對步驟I)得到的兩對引物在洼地綿羊中擴增的PCR產(chǎn)物分別進行RFLP分析，具體方法如下所述PCR-RFLP酶切體系引物2的PCR擴增產(chǎn)物用Aval I限制性內(nèi)切酶進行酶切。酶切反應的總體積為15Uし其中PCR產(chǎn)物5iiL，Avail限制性內(nèi)切酶I.Oii L，10 XBufferl. 5 u L,去離子水7. 5 yし振蕩離心7500r/min 30s,酶切反應條件為37°C水浴4h0PCR-RFLP產(chǎn)物檢測511し酶切產(chǎn)物加211し上樣緩沖液(0.05%ニ甲苯蘭；0. 05%溴酚蘭；0.02mol/L EDTA，加甲酰胺至10ml)，DNA Marker用量為3yL。室溫下120V電壓 3. 5h,銀染顯色。用 Alphalmager 2200 and 1220 Documentation and AnalysisSystems (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA, USA)拍照和分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)引物2擴增片段有3種基因型，命名為BB、B+、++(圖3)，若能出現(xiàn)兩個條帶，且分別位于140bp和llObp，為B+基因型(圖3中泳道1、2、5、10、12-16、18-19)，若能出現(xiàn)ー個條帶，且位于140bp，為++基因型(圖3中泳道6、8、9)，若能出現(xiàn)ー個條帶，且位于llObp，為BB基因型(圖3中泳道3、4、7、17)。圖3中，泳道6、8、9為++基因型；泳道
1、2、5、10、12-16、18-19 為 B+基因型；泳道 3、4、7、17 為 BB 基因型。實驗結(jié)果表明上述兩種方法均能準確判型，穩(wěn)定可靠性良好，并且判斷的結(jié)果ー致。根據(jù)PCR-SSCP和PCR-RFLP的分析結(jié)果，選取不同的基因型的樣品進行序列測定。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后，交由上海生物工程技術(shù)服務有限公司AB I PRISM 377 DNA自動測序儀完成序列測定。2、Fece基因型檢測及其與繁殖力關(guān)系的統(tǒng)計分析按照步驟2)方法用引物I和引物2對洼地綿羊進行了 FecB基因型檢測，并計算了洼地綿羊的基因型頻率和等位基因頻率，統(tǒng)計結(jié)果如表I所示。表IFecB位點在洼地綿羊中的等位基因頻率和基因型頻率
群體樣本數(shù)等位基因頻率基因型頻率
權(quán)利要求
1.一種檢測洼地綿羊繁殖力的方法,是檢測待測洼地綿羊基因組中的FecB基因編碼區(qū)的746bp處是否存在ー個A — G的突變，以確定洼地綿羊的基因型，然后通過基因型確定洼地綿羊繁殖力；所述FecB基因的核苷酸序列GENBANK ACCESSION NUMBER為AF357007的第156bp至3255bp位核苷酸； 所述確定洼地綿羊的基因型的方法為如果洼地綿羊基因組中的FecB基因的第746位核苷酸為A時，其純合體的基因型為++ ;洼地綿羊基因組中的FecB基因的第746位核苷酸為G時，其純合體的基因型為BB ;它們的雜合體基因型為B+ ； 通過基因型確定洼地綿羊繁殖力的方法為所述BB基因型洼地綿羊的繁殖力高于B+基因型洼地綿羊，B+基因型洼地綿羊的繁殖力高于++型洼地綿羊。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述檢測洼地綿羊基因組中的FecB基因的第746位核苷酸為A還是突變G的方法是利用PCR方法擴增洼地綿羊基因組中的核苷酸序列GENBANK ACCESSION NUMBER為AF357007的第626bp至812位核苷酸的片段，并將該擴增產(chǎn)物進行SSCP檢測，均得到兩條電泳條帶，兩條帶距離最遠，條帶且較細的為++基因型，兩條帶距離最近，條帶也較細的為BB基因型，兩條帶較粗，且相距距離為前兩者之間的為B+基因型.。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR方法的擴增引物對為具有序列表中序列I和2所述的核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述檢測洼地綿羊基因組中的FecB基因的第746位核苷酸為A還是突變G的方法是利用PCR方法擴增洼地綿羊基因組中的核苷酸序列GENBANK ACCESSION NUMBER為AF357007的第638bp至777位核苷酸的片段，并將擴增產(chǎn)物進行RFLP檢測，若能出現(xiàn)兩個條帶，且分別位于140bp和llObp，為B+基因型，若能出現(xiàn)ー個條帶，且位于140bp，為++基因型，若能出現(xiàn)ー個條帶，且位于llObp，為BB基因型(如圖3)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR方法的擴增引物對為具有序列表中序列3和4所述的核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項所述的方法，其特征在于所述繁殖力為每胎產(chǎn)羔數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明公開了利用FecB基因預測洼地綿羊繁殖力的方法，是檢測待測洼地綿羊基因組中的FecB基因的第746位核苷酸，從而確定洼地綿羊的基因型，然后通過基因型確定洼地綿羊繁殖力；如果洼地綿羊基因組中的FecB基因的第746位核苷酸為A時，其純合體的基因型為++，洼地綿羊基因組中的FecB基因的第746位核苷酸為G時，其純合體的基因型為BB；雜合體基因型為B+；BB基因型的繁殖力高于B+基因型，B+基因型的繁殖力高于++型。本發(fā)明利用PCR-SSCP和PCR-RFLP遺傳標記多態(tài)性確定洼地綿羊的繁殖力，可以迅速、簡便的檢測洼地綿羊的繁殖力，為洼地綿羊的育種提供了一個準確簡便的檢測其繁殖力的方法。
文檔編號C12Q1/68GK102643914SQ20121011185
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月17日
發(fā)明者周洪, 孫偉, 孫煒, 李達, 郭玉泉, 陳玲 申請人:揚州大學