專利名稱：多發(fā)性骨髓瘤易感基因無創(chuàng)檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體涉及一種多發(fā)性骨髓瘤易感基因檢測(cè)試劑盒，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果從基因?qū)用嬖u(píng)估多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，并作為預(yù)防和治療多發(fā)性骨髓瘤的方向指導(dǎo)。
背景技術(shù)：
多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是漿細(xì)胞異常增生的惡性腫瘤。一種進(jìn)行性的腫瘤性疾病。其特征為骨髓漿細(xì)胞瘤和一株完整性的單克隆免疫球蛋白(IgG，IgD或 IgE)或Bence Jones蛋白質(zhì)過度增生。多發(fā)性骨髓瘤常伴有多發(fā)性溶骨性損害，高鈣血癥， 貧血，腎臟損害，而且對(duì)細(xì)菌性感染的易感性增高，正常免疫球蛋白的生成收到阻抑。發(fā)病率估計(jì)為2-3/10萬，男女比例為1.6 1，大多患者年齡> 40歲。MTHFR全稱5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶編碼基因，主要作用是在葉酸代謝通路中將5，10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為具有生物學(xué)功能的5-甲基四氫葉酸。5-甲基四氫葉酸可以進(jìn)一步進(jìn)入甲基傳遞通路，通過同型半胱氨酸的重新甲基化過程間接為DNA甲基化和蛋白質(zhì)甲基化提供并且使血液中的同型半胱氨酸水平保持在一個(gè)較低的水平。此外葉酸的中間代謝產(chǎn)物在核苷酸合成過程中也有重要的作用，通過一碳單位代謝為嘌呤環(huán)的形成提供碳原子。MTHFR基因的缺陷將導(dǎo)致機(jī)體多個(gè)基礎(chǔ)生化過程的紊亂，包括細(xì)胞周期調(diào)控、DNA 復(fù)制、DNA以及蛋白質(zhì)甲基化修飾等，并進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)管缺陷、癌癥、心腦血管疾病等多種病癥。NQOl基因編碼還原型輔酶/醌氧化還原酶，又稱為DT-硫辛酰胺脫氫酶，是一種黃素酶，NQOl在器官中分布廣泛，但在肝臟、腎臟、胃腸道中水平最高。NQOl酶可受到各種化學(xué)物的誘導(dǎo)，如多環(huán)芳烴、氫醌、丙烯酸鹽、花莖甘藍(lán)等。NQOl酶屬于II相代謝酶，在體內(nèi)與其他I、II相代謝酶一起構(gòu)成了體內(nèi)對(duì)外源毒性物質(zhì)的代謝網(wǎng)絡(luò)，在機(jī)體的解毒代謝中發(fā)揮著重要作用。NQOl的多態(tài)性會(huì)降低NQOl酶對(duì)化學(xué)物質(zhì)的解毒能力，增加了患多發(fā)性骨髓瘤等疾病的風(fēng)險(xiǎn)。GSTTl即谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶Tl，是負(fù)責(zé)多種致癌物質(zhì)代謝的酶類家族GSTs中的一員。GSTTl的功能是使各類親電子化合物，如藥物、環(huán)境毒素、氧化鏈產(chǎn)物等與谷胱甘肽結(jié)合并進(jìn)入下一步的代謝步驟。GSTTl具有一種多態(tài)型一 null基因型，即缺失GSTTl基因。國內(nèi)外的眾多研究表明GSTTl基因的這種多態(tài)現(xiàn)象與很多類型的癌癥發(fā)病相關(guān)。這可能是因?yàn)镚STTl基因的缺失會(huì)使得機(jī)體解毒能力發(fā)生下降，致癌物質(zhì)在體內(nèi)積蓄，將大大提高罹患各種癌癥的風(fēng)險(xiǎn)度。綜上所述，鑒于MTHFR基因，NQOl基因，GSTTl基因在多發(fā)性骨髓瘤癌變過程中有著不可忽視的作用，可以將上述基因作為遺傳易感因素來檢測(cè)出受檢者在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生相關(guān)的基因單核苷酸位點(diǎn)基因型，及時(shí)篩查出易患多發(fā)性骨髓瘤的高危人群，從而有針對(duì)性的預(yù)防和治療多發(fā)性骨髓瘤，這對(duì)于降低多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病率有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
基于MTHFR基因上C677T位點(diǎn)及A1298C位點(diǎn)多態(tài)性，NQOl基因上C609T位點(diǎn)多態(tài)性，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)位點(diǎn)多態(tài)性的4個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型可作為評(píng)估多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病的危險(xiǎn)因子的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種多發(fā)性骨髓瘤易感基因檢測(cè)試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)MTHFR基因上C677T位點(diǎn)及A1298C位點(diǎn)多態(tài)性，NQOl基因上C609T位點(diǎn)多態(tài)性，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)位點(diǎn)多態(tài)性的4個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物對(duì)及DNA測(cè)序引物；PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、ddH20等)； PCR產(chǎn)物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等);DNA測(cè)序反應(yīng)組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括PCR 反應(yīng)體系10 X PCR 反應(yīng)緩沖液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 O. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶O. 125ul ;20uM特異性引物對(duì)(每條引物各O. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 產(chǎn)物純化體系lU/ul SAP 酶 O. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 O. 375ul ; ddH203. 875ul。測(cè)序反應(yīng)體系25%BigDye mix lul ；3. 2uM DNA 測(cè)序引物 lul ;125mMEDTA 溶液 lul ; 100% 乙醇溶液 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例I.檢測(cè)試劑盒的使用I、抽提DNA模板刮取受檢者口腔黏膜上皮細(xì)胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。2、PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用檢測(cè)試劑盒中的PCR反應(yīng)組件，其中，含有下列引物對(duì)(1)MTHFR(C677T)正向引物5' AGGGAGGCTTCAACTACGC3'MTHFR(C677T)反向引物5' GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3'(2)MTHFR(A1298C)正向引物5' GCCTCCAGACCAAAGAGTTACAT3'MTHFR(A1298C)反向引物5' CCACTCCAGCATCACTCACTTT3'(3)NQ01(C609T)正向引物5' TGGCACAGTTTCAAGGTTTATG3'
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NQ01(C609T)反向引物5' TATTCTCCAGGCGTTTCTTCC3'(4)GSTT1 (Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'GSTTl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3;PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為10 X PCR反應(yīng)緩沖液2. 5μ I ;25mM的dNTP混合液O. 2 μ I、 5U/ul Taq酶O. 125 μ 1、DNA模板 I μ I (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各 O. 25 μ I、 ddH20 19. 175μ I ；反應(yīng)條件為94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 30秒變性，55°C 30秒退火，72°C I 分鐘延長，循環(huán)28次，最后72°C延長5分鐘以上。3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化使用檢測(cè)試劑盒中的PCR產(chǎn)物純化組件，反應(yīng)體系為總體積25ul，包含PCR產(chǎn)物 20ul, lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 O. 375ul，去離子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為37°C、15min，72°C、20min。4、DNA測(cè)序反應(yīng)使用檢測(cè)試劑盒中的測(cè)序反應(yīng)組件，其中，含有下列DNA測(cè)序引物(1)MTHFR(C677T)測(cè)序引物5' AGGGAGGCTTCAACTACGC3'(2)MTHFR(A1298C)測(cè)序引物5' GCCTCCAGACCAAAGAGTTACAT3'(3) NQOl (C6OOT)測(cè)序引物5' TGGCACAGTTTCAAGGTTTATG3;(4)GSTTl (Null/Present)測(cè)序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'反應(yīng)的體系為總體積5ul，包含PCR純化產(chǎn)物lul，25% Bigdye mixlul，3. 2uMDNA 測(cè)序引物Iul，去離子水2ul。在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為98 °C 2min,進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反應(yīng)結(jié)束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀 15min ;在4°C, 3600rpm/min的轉(zhuǎn)速離心30min,輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul, 3600rpm/min離心15min,輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入測(cè)
序儀中。5、基因型分析熟悉DNA測(cè)序技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識(shí)DNA測(cè)序圖譜確定所檢測(cè)的 SNP位點(diǎn)的基因型。實(shí)施例2.對(duì)人們進(jìn)行預(yù)防多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病的基因無創(chuàng)檢測(cè)的服務(wù)I.采樣及抽提DNA由醫(yī)院檢驗(yàn)科醫(yī)師指導(dǎo)受檢者使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用酚氯仿法進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞的DNA抽提。2.基因型檢測(cè)使用本發(fā)明提供的試劑盒，對(duì)受檢者基因組DNA的MTHFR基因上C677T位點(diǎn)及 A1298C位點(diǎn)多態(tài)性，NQOl基因上C609T位點(diǎn)多態(tài)性，GSTTl基因缺失與否(Present/Null) 位點(diǎn)多態(tài)性的4個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)分別進(jìn)行DNA測(cè)序，確定這4個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型。3.多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病高危人群風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估通過對(duì)受檢者SNPs基因型的分析，出具多發(fā)性骨髓瘤易感基因風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估分析報(bào)告單。報(bào)告中詳細(xì)說明了受檢者M(jìn)THFR基因上C677T位點(diǎn)及A1298C位點(diǎn)多態(tài)性，NQOI基因上C609T位點(diǎn)多態(tài)性，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)位點(diǎn)多態(tài)性的4個(gè)基因上SNP 位點(diǎn)基因檢測(cè)信息以及遺傳風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果。除此之外，根據(jù)受檢者的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，并由醫(yī)師向受檢者詳細(xì)說明和解讀多發(fā)性骨髓瘤易感基因無創(chuàng)檢測(cè)報(bào)告單。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤易感基因無創(chuàng)檢測(cè)試劑盒，其特征在于檢測(cè)MTHFR基因上 C677T位點(diǎn)及A1298C位點(diǎn)多態(tài)性，NQOl基因上C609T位點(diǎn)多態(tài)性，GSTTl基因缺失與否 (Present/Nu11)位點(diǎn)多態(tài)性的4個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物與DNA測(cè)序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)MTHFR 基因上C677T位點(diǎn)及A1298C位點(diǎn)多態(tài)性，NQOl基因上C609T位點(diǎn)多態(tài)性，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)位點(diǎn)多態(tài)性的4個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，能特異性擴(kuò)增出包含這4個(gè) SNPs位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的DNA測(cè)序引物是針對(duì)MTHFR基因上C677T位點(diǎn)及A1298C位點(diǎn)多態(tài)性，NQOl基因上C609T位點(diǎn)多態(tài)性，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)位點(diǎn)多態(tài)性的4個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過DNA測(cè)序技術(shù)特異性檢測(cè)出上述4個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型的DNA測(cè)序引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所示的試劑盒，其特征在于，所含的4對(duì)特異性引物序列如下(1)MTHFR(C677T)正向引物5'AGGGAGGCTTCAACTACGC3'MTHFR (C677T)反向引物5' GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3'(2)MTHFR(A1298C)正向引物5'GCCTCCAGACCAAAGAGTTACAT3'MTHFR(A1298C)反向引物5' CCACTCCAGCATCACTCACTTT3'(3)NQ01(C609T)正向引物5'TGGCACAGTTTCAAGGTTTATG3'NQOl (C609T)反向引物5' TATTCTCCAGGCGTTTCTTCC3'(4)GSTTl(Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'GSTTl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3;。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所含的4條DNA測(cè)序引物序列如下(1)MTHFR(C677T)測(cè)序引物5'AGGGAGGCTTCAACTACGC3'(2)MTHFR(A1298C)測(cè)序引物5'GCCTCCAGACCAAAGAGTTACAT3'(3)NQ01(C609T)測(cè)序引物5'TGGCACAGTTTCAAGGTTTATG3'(4)GSTTl(Null/Present)測(cè)序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括(I)PCR反應(yīng)體系10XPCR 反應(yīng)緩沖液 2. 5ul，25mM dNTP 混合液 O. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶 O. 125ul， 20uM特異性引物對(duì)，每條引物各O. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 產(chǎn)物純化體系川/111SAP 酶 O. 75ul，10U/ul ExoI 酶 O. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)測(cè)序反應(yīng)體系25%BigDye mixlul，3. 2uM DNA測(cè)序引物 lul，125mMEDTA溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤易感基因無創(chuàng)檢測(cè)試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)MTHFR基因上C677T位點(diǎn)及A1298C位點(diǎn)多態(tài)性，NQO1基因上C609T位點(diǎn)多態(tài)性，GSTT1基因缺失與否(Present/Null)位點(diǎn)多態(tài)性的4個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物與DNA測(cè)序引物、PCR反應(yīng)組件、PCR產(chǎn)物純化組件、DNA測(cè)序反應(yīng)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過檢測(cè)與多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生密切相關(guān)的4個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型來評(píng)估受檢者多發(fā)性骨髓瘤患病的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，并最終根據(jù)每一位受檢者的基因檢測(cè)結(jié)果從基因?qū)用嬷笇?dǎo)受檢者有針對(duì)性的預(yù)防多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生，降低多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病幾率。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102605080SQ20121008669
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月28日
發(fā)明者姜麗, 潘加奎 申請(qǐng)人:解碼(上海)生物醫(yī)藥科技有限公司