專利名稱：腺病毒/日本腦炎病毒復(fù)制子嵌合載體豬瘟疫苗及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種攜帶有抗原基因的嵌合載體疫苗及其應(yīng)用，尤其涉及腺病毒/日本腦炎病毒復(fù)制子嵌合載體豬瘟疫苗及其應(yīng)用，屬于嵌合載體豬瘟疫苗領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腺病毒載體因其具有宿主范圍廣泛、安全性高、病毒粒子穩(wěn)定、基因組較少發(fā)生重排、易于DNA重組技術(shù)操作、具有高效遞送和表達(dá)外源基因等優(yōu)點(diǎn)，成為最常用的病毒載體之一。復(fù)制缺陷性人5型腺病毒載體因缺失了病毒非必需基因區(qū)(E1/E3)，使其能夠攜帶大片段的外源基因，又由于它是復(fù)制缺陷性的，對人及動物產(chǎn)生一過性感染，安全性高。RNA復(fù)制子，即自主復(fù)制病毒RNA，是在RNA病毒感染性克隆的基礎(chǔ)上用其它外源基因替換病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因、保留其非結(jié)構(gòu)蛋白基因和非編碼區(qū)而發(fā)展的表達(dá) 系統(tǒng)， 它利用正鏈RNA病毒的自主復(fù)制特性，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能夠在表達(dá)病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的同時高效表達(dá)外源蛋白(余云舟，俞煒源.黃病毒屬病毒復(fù)制子載體研究進(jìn)展.生物技術(shù)通訊，2006，17 (2) :228-231)。RNA復(fù)制子疫苗具有很強(qiáng)的優(yōu)勢，如有自主復(fù)制能力，病毒自身調(diào)節(jié)功能蛋白的表達(dá)不受細(xì)胞影響，病毒蛋白表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)(Polo JM, Dubensky TW. Virus-based vectors for human vaccine applications. Drug Discovery Today, 2002,7(13) :719-727.)。不足之處是，RNA復(fù)制子載體不能有效地進(jìn)入體內(nèi)。另外，黃病毒復(fù)制子載體蛋白對宿主菌具有一定的毒副作用，這可能是造成黃病毒復(fù)制子載體不穩(wěn)定的主要因素(Rice CM, Grakoui A, Galler R, et al. Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation. New Biol,1989,1 (3) :285-96.)。黃病毒eDNA在細(xì)菌中存在不穩(wěn)定性，日本腦炎病毒(JEV)復(fù)制子載體也存在這種情況(Lai CJ, Zhao BT, Hori H, et al. Infectious RNA transcribed from stably cloned full-length cDNA of dengue type 4 virus. Proc Natl Acad Sci USA,1991,88 (12) 5139-5143 ；Sumiyoshi H, Hoke CH,Trent DW,et al. Infectious Japanese encephalitis virus RNA can be synthesized from in vitro-ligated cDNA templates. J Virol,1992, 66(9) :5423-5431.)。目前國內(nèi)外關(guān)于以腺病毒遞送JEV復(fù)制子表達(dá)載體的研究尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種攜帶抗原基因的腺病毒/日本腦炎病毒復(fù)制子嵌合載體疫苗；本發(fā)明的目的之二是提供一種構(gòu)建所述攜帶抗原基因的腺病毒/日本腦炎病毒復(fù)制子嵌合載體疫苗的方法；本發(fā)明的目的之三是提供一種腺病毒/日本腦炎病毒復(fù)制子嵌合載體豬瘟疫苗；本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的
—種腺病毒/日本腦炎病毒復(fù)制子嵌合載體疫苗，包括復(fù)制缺陷性人5型腺病毒、日本腦炎病毒復(fù)制子和待表達(dá)的抗原基因；其中，在日本腦炎病毒復(fù)制子SpeI位點(diǎn)前 (即位于JEV SA14-14-2株基因組第164-165位核苷酸)插入質(zhì)粒pCI的內(nèi)含子序列；待表達(dá)的抗原基因位于JEV復(fù)制子載體的SpeI和SalI位點(diǎn)之間。其中，所述質(zhì)粒PCI的內(nèi)含子序列的核苷酸序列為SEQ ID No. I所示。本發(fā)明所述的“待表達(dá)的抗原基因”可以是豬瘟病毒E2基因、豬藍(lán)耳病病毒GP5基因、豬圓環(huán)病毒2型Cap基因或豬流感病毒HA基因等抗原基因；優(yōu)選為豬瘟病毒E2基因。本發(fā)明的另外一種目的是提供一種構(gòu)建所述腺病毒/日本腦炎病毒復(fù)制子嵌合載體的方法，包括以下步驟(I)將日本腦炎病毒(JEV)復(fù)制子插入到腺病毒穿梭載體中；(2)將來自pCI載體的嵌合內(nèi)含子序列以及待表達(dá)的抗原基因插入到JEV復(fù)制子中，得到轉(zhuǎn)移載體；(3)將轉(zhuǎn)移載體線性化后轉(zhuǎn)化含有腺病毒骨架載體的感受態(tài)細(xì)胞，得到重組腺粒；(4)將所得重組腺粒線性化后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，傳代直至出現(xiàn)細(xì)胞病變，得到含有表達(dá)抗原基因的腺病毒/日本腦炎病毒復(fù)制子嵌合載體疫苗。其中，步驟(I)中所述的腺病毒穿梭載體包括pShuttle、pShuttle_CMV、pAdTrack 或 pAdTrack-CMV 等；優(yōu)選為 pShuttle-CMV ；步驟(2)中在日本腦炎病毒復(fù)制子SpeI位點(diǎn)前插入質(zhì)粒pCI的內(nèi)含子序列(SEQ ID No. I);此外，將待表達(dá)的抗原基因插入到JEV復(fù)制子載體的SpeI和SalI位點(diǎn)之間。步驟⑷中所述的細(xì)胞優(yōu)選為HEK293細(xì)胞。本發(fā)明中所使用的JEV復(fù)制子保留了 JEV所有非結(jié)構(gòu)蛋白，能在抵抗外源病毒的同時對JEV也有一定的保護(hù)作用。采用腺病毒遞送JEV復(fù)制子表達(dá)系統(tǒng)，充分利用了復(fù)制子能高效表達(dá)外源基因的優(yōu)點(diǎn)，又解決了核酸疫苗不容易進(jìn)入動物體內(nèi)的問題。在本發(fā)明人的前期工作中，獲得了表達(dá)EGFP蛋白的腺病毒/日本腦炎病毒復(fù)制子載體嵌合病毒，但用其它基因(如豬瘟病毒E2基因或豬流感病毒HA基因)替換EGFP基因后，盡管采用不同改進(jìn)措施，比如轉(zhuǎn)化過程中使用能容納大片段且生長較慢的DHlOB菌株，并且使用低溫、低轉(zhuǎn)速、低濃度抗生素篩選，卻始終無法得到插入外源基因的嵌合載體克隆，無法獲得嵌合病毒，這可能是由于黃病毒cDNA在大腸桿菌中的不穩(wěn)定性造成的。為了解決這個問題，本發(fā)明嘗試了往JEV復(fù)制子序列中引入內(nèi)含子的方法，避免JEV蛋白翻譯所產(chǎn)生對宿主菌有毒害作用的蛋白，也嘗試了引入突變來消除JEV序列中隱含的大腸桿菌啟動子等方法，最終發(fā)現(xiàn)引入內(nèi)含子序列能使JEV復(fù)制子載體變得穩(wěn)定，用豬瘟病毒E2基因替換EGFP基因后， 很容易挑到陽性克隆，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后E2蛋白也能正確穩(wěn)定表達(dá)(表I)。表I引入來自pCI載體的嵌合內(nèi)含子對JEV復(fù)制子的影響
權(quán)利要求
1.一種腺病毒/日本腦炎病毒復(fù)制子嵌合載體疫苗，其特征在于，包括復(fù)制缺陷性人5型腺病毒、日本腦炎病毒復(fù)制子和待表達(dá)的抗原基因。
2.按照權(quán)利要求I所述的腺病毒/日本腦炎病毒復(fù)制子嵌合載體疫苗，其特征在于 在日本腦炎病毒復(fù)制子5^1位點(diǎn)前插入質(zhì)粒pCI的內(nèi)含子序列；所述質(zhì)粒pCI的內(nèi)含子序列的核苷酸序列為SEQ ID No. I所示。
3.按照權(quán)利要求I所述的腺病毒/日本腦炎病毒復(fù)制子嵌合載體疫苗，其特征在于 待表達(dá)的抗原基因位于JEV復(fù)制子載體的分el和Sall位點(diǎn)之間。
4.按照權(quán)利要求1-3任何一項(xiàng)所述的腺病毒/日本腦炎病毒復(fù)制子嵌合載體疫苗，其特征在于所述的待表達(dá)的抗原基因是豬瘟病毒E2基因、豬藍(lán)耳病病毒GP5基因、豬圓環(huán)病毒2型Cap基因或豬流感病毒HA基因。
5.權(quán)利要求1-3任何一項(xiàng)所述的腺病毒/日本腦炎病毒復(fù)制子嵌合載體疫苗在制備動物疫苗中的用途。
6.—種構(gòu)建1-3任何一項(xiàng)所述腺病毒/日本腦炎病毒復(fù)制子嵌合載體疫苗的方法,包括以下步驟(I)將日本腦炎病毒復(fù)制子插入到腺病毒穿梭載體中；(2)將來自pCI載體的嵌合內(nèi)含子以及待表達(dá)的抗原基因插入到日本腦炎病毒復(fù)制子中，得到重組轉(zhuǎn)移載體；(3)將轉(zhuǎn)移載體線性化后轉(zhuǎn)化含有腺病毒骨架載體的感受態(tài)細(xì)胞，得到重組腺粒；(4)將重組腺粒線性化后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，傳代直至出現(xiàn)細(xì)胞病變，得到含有表達(dá)抗原基因的腺病毒/日本腦炎病毒復(fù)制子嵌合載體疫苗。
7.按照權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于步驟(I)中所述的腺病毒穿梭載體包括 pShuttle、pShuttle-CMV、pAdTrack 或 pAdTrack-CMV ;優(yōu)選為 pShuttle-CMV。
8.按照權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于步驟(2)中在日本腦炎病毒復(fù)制子分el 位點(diǎn)前插入質(zhì)粒PCI的內(nèi)含子序列；待表達(dá)的抗原基因插入到JEV復(fù)制子載體的分el和 Sall位點(diǎn)之間。
9.腺病毒/日本腦炎病毒復(fù)制子嵌合載體豬瘟疫苗，其微生物保藏號是CGMCC.5825。
10.權(quán)利要求9所述的腺病毒/日本腦炎病毒復(fù)制子嵌合載體豬瘟疫苗在制備預(yù)防日本腦炎病毒或/和豬瘟病毒的疫苗中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了腺病毒/日本腦炎病毒復(fù)制子嵌合載體豬瘟疫苗及其應(yīng)用。本發(fā)明首先構(gòu)建了攜帶日本腦炎病毒復(fù)制子、穩(wěn)定表達(dá)EGFP基因的重組嵌合腺病毒，在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步用豬瘟病毒E2基因替換嵌合載體中的EGFP基因，構(gòu)建了含有豬瘟病毒E2基因的重組嵌合腺病毒rAdV-JEV-E2。間接免疫熒光試驗(yàn)證明，豬瘟病毒E2蛋白在重組嵌合腺病毒rAdV-JEV-E2感染后的HEK293細(xì)胞中得到穩(wěn)定、高效的表達(dá)；免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明所構(gòu)建的重組嵌合腺病毒rAdV-JEV-E2具有良好的免疫保護(hù)作用。
文檔編號C12N7/01GK102600481SQ201210073529
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月20日
發(fā)明者仇華吉, 孫元 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所