專利名稱：一種重組蛋白質及其單克隆抗體的制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域。具體的說，本發(fā)明涉及ー種新的重組蛋白，編碼該重組 蛋白的核苷酸序列，以及含有上述核苷酸序列的質粒載體，轉化有上述質粒載體的菌株，還 涉及使用上述的重組蛋白制備心臟型脂肪酸結合蛋白單克隆抗體，并應用于急性心肌梗死 (AMI)早期診斷。
背景技術：
急性心肌梗死是指急性、持續(xù)性缺血、缺氧(冠狀動脈功能不全)所引起的心肌壞 死，是ー種嚴重影響人類健康的心血管疾病。近年來，該疾病的發(fā)病率逐年上升，患病人群 年輕化趨勢愈演愈烈，但治療效果卻不甚理想，其中的一個關鍵原因是無法實現急性心肌 梗死的早期快速診斷以爭取治療時間。從而導致患者病情惡化甚至死亡。因此，能夠在心 肌梗死的早期做出正確的診斷顯得尤為重要。研究表明，人心臟型脂肪酸結合蛋白(fabp3)是目前早期診斷AMI最具有特異性 和敏感性的生化指標。該蛋白等電點為5. 1，分子量為15KD左右，它可將脂肪酸從細胞質 膜向發(fā)生酯化和氧化的部位運輸，從而進入線粒體的能量代謝體系之中，是脂肪酸在此氧 化分解并最終生成三磷酸腺苷(ATP)，為心肌收縮提供能量。正常人的血液中不含有心臟 型脂肪酸結合蛋白，但在胸痛后0. 5-3小時后濃度開始上升，在4-8小時內達到最高值，在 12-24小時內恢復到正常水平；而且心臟型脂肪酸結合蛋白專ー于心肌的損傷，具有高度 特異性，基于心臟型脂肪酸結合蛋白的以上特點使得其成為理想的AMI早期診斷指標。因 此，特異性檢測識別人心臟型脂肪酸結合蛋白顯得尤為重要。目前，以免疫學為基礎的血 清學檢測，由于其操作簡便，結果易于判定，已成為主流方向。該方法主要是通過制備得到 的人心臟型脂肪酸結合蛋白單克隆抗體實現對人心臟型脂肪酸結合蛋白的特異性檢測。常 規(guī)的人心臟型脂肪酸結合蛋白單克隆抗體制備所使用的免疫原是基因工程技術表達的完 整蛋白，但由于堿基密碼子的緣故，該蛋白在大腸桿菌中表達困難，表達量極低，導致后續(xù) 的純化工作難以開展，嚴重阻礙其單克隆抗體的制備。另外，由于抗原表位氨基酸序列同源 性的緣故，使用心臟型脂肪酸結合蛋白全長序列作為免疫原制備得到的單克隆抗體特異性 差，可能識別其它蛋白，從而導致檢測結果失真。

發(fā)明內容
設計目的避免背景技術中的不足之處，通過設計一種重組蛋白并制備其單克隆 抗體，從而實現心臟型脂肪酸結合蛋白的特異性檢測識別，既增強了檢測靈敏度，又不會導 致檢測結果失真。設計方案為了實現上述設計目的。本申請(1)以心臟型脂肪酸結合蛋白為靶抗 原，分析并選擇該抗原兩個特異性優(yōu)勢抗原表位，序列比較結果顯示所選擇的兩個抗原表 位與其它蛋白序列無明顯同源性。(2)為了促進所選擇優(yōu)勢抗原表位對BALB/c小鼠免疫 系統(tǒng)的刺激，增強免疫效果，故分別將所選擇的兩個優(yōu)勢抗原表位序列重復后通過柔性片段(連續(xù)四個甘氨酸)連接，形成重組蛋白氨基酸序列。(3)采用大腸桿菌偏愛密碼子，將 重組蛋白氨基酸序列轉換為對應的核苷酸序列，以利于重組蛋白在大腸桿菌中的表達以提 高表達量。(4)化學合成上一步驟得到的核苷酸序列，并通過酶切連接，將合成得到的核苷 酸片段插入表達載體PET-28a(+)，構建重組蛋白表達載體。(5)重組蛋白表達載體轉化大 腸桿菌ER2566感受態(tài)細胞，篩選得到重組蛋白表達菌株。(6)重組蛋白表達菌株大規(guī)模培 養(yǎng)后，超聲破菌并低溫離心后，取溶液上清通過鎳瓊脂糖親和層析柱親和層析，洗脫得到純 化重組蛋白。(7)純化后的重組蛋白多次免疫BALB/c小鼠后，取其脾臟細胞與sp2/0骨髄 瘤細胞融合，經過多輪篩選并最終得到雜交瘤細胞株。(8)將雜交瘤細胞株分別制備BALB/ c小鼠腹水，使用辛酸-硫酸銨法及Protein G分兩步純化單克隆抗體,并分別標記辣根過 氧化物酶(HRP)。(9) ELISA正交實驗篩選顯示7C3單抗包被與5F6-HRP配對檢測心肌梗死 為最佳組合。技術方案I :一種重組蛋白質，該重組蛋白質具有如序列表SEQ ID No :1所示的氨 基酸序列。技術方案2 :—種重組蛋白質，該重組蛋白質包含如序列表SEQ ID No :2和SEQ ID No: 3所示的氨基酸序列。技術方案3 : —種核苷酸序列，該核苷酸序列如序列表SEQ ID No :4所示，可編碼 權利要求1-2所述的重組蛋白質。技術方案4 :ー種質粒載體，該質粒載體含有權利要求3所述的核苷酸序列。技術方案5 :—種菌株，該菌株包含采用權利要求4所述的質粒載體。本申請與背景技術相比，一是通過分子生物學技術，實現了心臟型脂肪酸結合蛋 白兩個優(yōu)勢抗原表位的重復及串聯表達，增強了目的抗原表位對小鼠免疫系統(tǒng)的刺激，排 除了無關序列可能帶來的干擾；ニ是作為免疫原的重組蛋白僅含有人心臟型脂肪酸結合 蛋白特有的優(yōu)勢抗原表位，保證了最終得到的單克隆抗體僅特異性識別人心臟型脂肪酸結 合蛋白，并篩選得到了最優(yōu)單抗配對組合，提高了檢測的靈敏度；三是采用大腸桿菌偏愛 密碼子優(yōu)化重組蛋白對應的核苷酸序列，從而大大提高了重組蛋白在大腸桿菌中的表達水 平。
具體實施例方式以下實施例雖然對本發(fā)明的設計思路作了比較詳細的文字描述，但是這些文字描 述，只是對本發(fā)明設計思路的簡單文字描述，而不是對本發(fā)明設計思路的限制，任何不超出 本發(fā)明設計思路的組合、増加或修改，均落入到本發(fā)明的保護范圍內。實施例I :心臟型脂肪酸結合蛋白優(yōu)勢抗原表位選擇以人心臟型脂肪酸結合蛋白為靶抗原，利用生物軟件DNAssist2. 0分析其抗原表 位序列的親水性及抗原性，選擇A優(yōu)勢抗原表位(SEQ ID No 2)和B優(yōu)勢抗原表位(SEQ ID No :3)。同時，序列比較結果表明所選擇的A、B兩個優(yōu)勢抗原表位序列特異性高，與其它蛋 白序列無明顯同源性。實施例2 :心臟型脂肪酸結合蛋白優(yōu)勢抗原表位的串聯為增強所選擇抗原表位對小鼠免疫系統(tǒng)的刺激以利于后續(xù)實驗的進行，將心臟型 脂肪酸結合蛋白A、B兩個優(yōu)勢抗原表位序列分別重復后再通過柔性片段(連續(xù)四個甘氨酸)連接，得到重組蛋白氨基酸序列，其具體序列如序列表SEQ ID No:l所示。實施例3 :優(yōu)化編碼重組蛋白的核苷酸序列為了提高重組蛋白在大腸桿菌中的表達量，在重組蛋白氨基酸序列不變的前提 下，根據大腸桿菌偏愛密碼子將編碼重組蛋白的氨基酸序列轉化為對應的核苷酸序列，具 體序列如序列表SEQ ID No 4所示，并在其上下游分別添加酶切位點BamHI和EcoRI對應 的核苷酸序列后，由杭州賢至生物科技有限公司合成。合成后的目的基因克隆于PMD19-T 載體(寶生物工程大連有限公司)中。實施例4 :構建重組蛋白表達載體用限制性內切酶BamHI和EcoRI (寶生物工程大連有限公司)于37°C分別雙酶切 含目的基因的PMD19-T載體和PET-28a(+)載體(德國Novagen公司)12小時，酶切產物分 別行1%瓊脂糖凝膠電泳，并分別切膠回收目的基因和PET-28a(+)載體(本發(fā)明所使用的 膠回收試劑盒均來自寧波中鼎生物技術有限公司)。使用T4連接酶(寶生物工程大連有 限公司)將回收的目的基因和PET-28a(+)載體按一定的比例于4°C連接12小時后，連接 產物轉化DH5ci感受態(tài)細胞(杭州賢至生物科技有限公司)，并涂布于含卡那青霉素抗性 (50 u g/mL)的LB平板，于37°C恒溫培養(yǎng)12小時之后，于平板上挑取單克隆菌株至含卡那 青霉素抗性(50 y g/mL)的LB液體培養(yǎng)基，37°C恒溫搖床培養(yǎng)12小時后，采用質粒純化試 劑盒(本發(fā)明所使用的質粒純化試劑盒均來自于寧波中鼎生物技術有限公司)提取質粒， 經BamHI和EcoRI雙酶切鑒定后得到正確的重組表達載體。實施例5 :構建重組蛋白表達菌株將構建好的重組表達載體轉化E. coli ER2566感受態(tài)細胞，并涂布于含卡那青霉 素抗性(50 y g/mL)的LB平板，于37°C過夜培養(yǎng)。第二日，挑取平板上單克隆菌株至含卡 那青霉素抗性(50 u g/mL)的LB液體培養(yǎng)基，37°C恒溫搖床培養(yǎng)8小時后，加誘導劑異丙 基硫代-D-半乳糖苷(終濃度為1. 0mmol/L)誘導表達4個小時后制備蛋白電泳樣品。 13. 5%聚丙烯酰胺凝膠電泳結果表明重組蛋白成功表達，得到重組蛋白表達菌株。實施例6 純化重組蛋白接種重組蛋白表達菌株至LB液體培養(yǎng)基，加卡那青霉素至終濃度為50ii g/mL， 37°C恒溫搖床培養(yǎng)8小時后，用含50 y g/mL卡那青霉素的LB液體培養(yǎng)基將該菌按1 : 100 比例稀釋后，分裝至細菌培養(yǎng)瓶中，置37°C恒溫搖床培養(yǎng)至0D600 = 0.8，加誘導劑異丙基 硫代_ P -D-半乳糖苷至終濃度為1. 0mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)誘導4小時。離心收集菌體后，低溫 超聲破菌，低溫離心后取上清通過鎳瓊脂糖親和層析柱，經洗滌、洗脫最終得到純化重組蛋 白。實施例7 :雜交瘤細胞株的獲得取5-7周齡雌性BALB/c小鼠，基礎免疫每只小鼠皮下多點注射福氏完全佐劑乳化 的50y g重組蛋白。15天后進行加強免疫，方法為取相同量的重組蛋白用福氏不完全佐劑 乳化后，皮下多點注射。30天后，取15 yg重組蛋白尾靜脈加強注射，并于尾靜脈加強注射 后72小時后，眼眶取血，并處死小鼠，取其脾臟制備細胞懸液，細胞計數，按1/5于脾細胞的 數量取生長狀態(tài)良好的sp2/0小鼠骨髓瘤細胞，混和離心后，加入聚乙二醇(PEG-4000)使 二者融合。另外，再加入等體積的飼養(yǎng)細胞，混勻后分置于96孔細胞板(200UL/孔)，于 5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。5天后，半保留換液，10天后采用間接酶聯免疫吸附法檢測96孔細胞培養(yǎng)板中的雜交瘤細胞培養(yǎng)上清。具體方法如下重組蛋白經包被液稀釋后(終濃度為I U g/mL)，以100 ii L/孔加入酶標板(深圳 金燦華實業(yè)有限公司)，4°C包被12小時后用洗滌液洗滌五次并拍干；加入封閉液，150 u L/ 孔，37°C封閉2小吋，棄孔內液體，拍干；加待檢細胞培養(yǎng)上清及對照血清，100 u L/孔，370C 孵育I小時后，洗滌液洗滌五次并拍干；加HRP(辣根過氧化物酶)標記的羊抗鼠IgG， 100 u L/孔，37°C孵育30分鐘后，洗滌液洗滌五次并拍干；每孔加顯色液A和顯色液B各 50 u L，37で避光顯色10分鐘后，加終止液終止反應，50 u L/孔，酶標儀450nm波長空白孔 校零后讀取OD值。以免疫小鼠的血清作為陽性對照，相關溶液配方如下包被液=Na2CO3I. 5g，NaHCO3 2. 9g，加雙蒸水定容至 IOOOmL (pH9. 6)。封閉液=Na2HPO4.12H20 2. 68g, NaH2P04. 2H20 0. 39g, NaCl 8. 5g，20g 牛血清白蛋 白，加雙蒸水定容至IOOOmL (pH7. 4)。洗滌液=Na2HPO4.12H20 2. 68g, NaH2PO4. 2H20 0. 39g, NaCl 8. 5g, Tween-20 0. 5mL, 加雙蒸水定容至IOOOmL (pH7. 4)。顯色液A 200mg TMB溶于IOOmL無水こ醇,加雙蒸水定容至1000mL。顯色液B :梓檬酸2. lg, Na2HPO4. 12H20 71g，加雙蒸水定容至1000mL。使用時ImL顯色液 A+lmL 顯色液 B+0. 4 U L 30% H2O2終止液2M H2SO4, 21. 7mL濃H2SO4加雙蒸水定容至1000mL。對于檢測陽性的雜交瘤細胞克隆，再使用有限稀釋法進行亞克隆。經過三次亞克 隆，共篩選得到7株雜交瘤細胞株(1F4、2B6、3D7、5F6、7C3、7E5、8A1)。實施例8 :單克隆抗體的大量制備及純化取8-9周齡的健康BALB/c小鼠，腹腔注射降植烷，每只200 U L，7天后腹腔注射雜 交瘤細胞(約I X IO6個/只)，15天后，小鼠腹部鼓起，收集腹水，3000rpm離心10分鐘，收 集上清，按I 4的比例加入60mmol/L pH4. 0醋酸緩沖液，用100mmol/L NaOH調pH4. 5。以 每毫升腹水上清加入25 y L正辛酸的比例，在磁力攪拌條件下緩慢加入正辛酸，在室溫條 件下繼續(xù)攪拌30min后，4°C 5000rpm離心30分鐘，棄沉淀。將上清液在4°C條件下預冷，以 ImL體積上清液加入0. 227g硫酸銨的比例,緩慢加入硫酸銨粉末,邊加邊攪拌,室溫條件下 繼續(xù)攪拌30min之后，5000rpm離心15分鐘,沉淀溶于1/10體積的10mmol/L PBS (pH7. 4) 緩沖液中，透析至無硫酸銨。將透析后的單抗用Protein G吸附純化，洗滌后收集洗脫峰， 即得到純化后的單抗。實施例9 =HRP標記單抗的制備取IOmg HRP加0. lmol/L醋酸鈉2mL,充分混勻，約5分鐘后加0. 08mol/L NaIO4 溶液lmL，混勻后，室溫反應20分鐘。加0. 4mol/Lこニ醇溶液0. 5mL,室溫靜置30分鐘后， 加21 % NaCl溶液0. 3mL,再加I. 2mL冰冷的無水こ醇沉淀醛化酶，離心去上清，沉淀酶再用 6mL 80%冰冷的こ醇溶液浸泡洗滌一次后，離心傾去除こ醇)。沉淀用0. 05mol/L碳酸鹽 緩沖液(PH9. 6)2mL溶解，然后單抗20mg，攪拌均勻，于4°C過夜。次日加IOmg NaBH4-勻， 反應3小時后加等量飽和硫酸銨沉淀酶結合物，4°C攪拌反應30分鐘，4°C 5000rpm離心分 鐘，棄上清，沉淀用0.01mol/L PBS 3mL溶解，置透析袋中用0.01mol/L PBS于4°C過夜透 析，加3mL無菌甘油，混勻后于_20°C保存。以上述方法分別對1F4、2B6、3D7、5F6、7C3、7E5、8A1單抗進行HRP標記。
實施例10 :配對單抗的篩選七種單克隆抗體(1F4、2B6、3D7、5F6、7C3、7E5、8A1)分別經包被液稀釋后(終濃度 為I U g/mL)，以100 y L/孔加入酶標板(深圳金燦華實業(yè)有限公司)，4°C包被12小時后用 洗滌液洗滌五次并拍干；加入封閉液，150 UL/孔，37°C封閉2小時，棄孔內液體，拍干；加心 肌梗死患者臨床血清標本及正常人血清標本，100 u L/孔，37°C孵育I小時后，洗滌液洗滌 五次并拍干；加入100 u L實施例9制備得到的HRP標記單抗，100 u L/孔，37°C孵育30分 鐘后，洗滌液洗滌五次并拍干；每孔加顯色液A和顯色液B各50 y L，37°C避光顯色10分鐘 后，加終止液終止反應，50 ii L/孔，酶標儀450nm波長空白孔校零后讀取OD值。相關溶液 配方如下包被液=Na2CO3I. 5g，NaHCO3 2. 9g，加雙蒸水定容至 IOOOmL (pH9. 6)。封閉液=Na2HPO4.12H20 2. 68g, NaH2P04. 2H20 0. 39g, NaCl 8. 5g，20g 牛血清白蛋 白，加雙蒸水定容至IOOOmL (pH7. 4)。洗滌液=Na2HPO4.Iffi2O 2. 68g, NaH2PO4. 2H20 0. 39g, NaCl 8. 5g, Tween-20 0. 5mL, 加雙蒸水定容至IOOOmL (pH7. 4)。顯色液A 200mg TMB溶于IOOmL無水こ醇,加雙蒸水定容至1000mL。顯色液B :梓檬酸2. lg, Na2HPO4. 12H20 71g，加雙蒸水定容至1000mL。使用時ImL顯色液 A+lmL 顯色液 B+0. 4 U L 30% H2O2終止液2M H2SO4, 21. 7mL濃H2SO4加雙蒸水定容至1000mL。以上述方法正交檢測各包被單抗與酶標單抗配對，求P/N值(陽性標本檢測均值 與陰性標本檢測均值比值)值，見表I。表I各單抗與酶標單抗P/N值統(tǒng)計
權利要求
1.一種重組蛋白質，其特征在于該重組蛋白質具有如序列表SEQ ID No :1所不的氣基酸序列。
2.—種重組蛋白質，其特征在于該重組蛋白質包含如序列表SEQ ID No :2和SEQ IDNo :3所示的氨基酸序列。
3.一種核苷酸序列，其特征在于該核苷酸序列如序列表SEQ ID No :4所示，可編碼權利要求1-2所述的重組蛋白質。
4.一種質粒載體,其特征在于該質粒載體含有權利要求3所述的核苷酸序列。
5.一種菌株，其特征在于該菌株包含采用權利要求4所述的質粒載體。
6.根據權利要求1-2所述的重組蛋白質，其特征在于可用于心臟型脂肪酸結合蛋白單克隆抗體的制備，包括 (a)合成權利要求3所述的核苷酸序列，并連接質粒載體，構建重組蛋白表達載體； (b)將步驟(a)中的重組蛋白表達載體轉化大腸桿菌，篩選得到重組蛋白表達菌株； (c)大規(guī)模培養(yǎng)重組蛋白表達菌株后，經純化獲取重組蛋白； (d)重組蛋白多次免疫Balb/c小鼠后,取其脾臟細胞與sp2/0骨髓瘤細胞融合,經過多輪篩選得到雜交瘤細胞株； (e)純化單抗并分別標記辣根過氧化物酶(HRP)，ELISA正交實驗確定最佳單抗配對組入口 ο
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術領域。本發(fā)明涉及一種重組蛋白，該重組包含人心臟型脂肪酸結合蛋白兩個優(yōu)勢抗原表位，并采用大腸桿菌偏愛密碼子將該重組蛋白氨基酸序列轉換為對應的核苷酸序列，化學合成該核苷酸序列并構建重組表達載體，從而提高該重組蛋白在大腸桿菌中的表達量。本發(fā)明還涉及該重組蛋白單克隆抗體的制備，經過免疫、細胞融合及多輪篩選后得到雜交瘤細胞株，純化單克隆抗體并分別標記辣根過氧化物酶(HRP)，ELISA正交實驗確定最佳單抗配對組合，可用于心肌梗死早期診斷。
文檔編號C12R1/19GK102659937SQ20121007068
公開日2012年9月12日 申請日期2012年3月16日 優(yōu)先權日2012年3月16日
發(fā)明者余銘恩, 馮俊濤, 吳瓊杉, 李會強, 李曉照, 汪俊 申請人:杭州賢至生物科技有限公司