專利名稱：利用海洋紅樹林內(nèi)生真菌生產(chǎn)抗癌蒽醌類化合物的培養(yǎng)基及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物學(xué)領(lǐng)域；更具體地，涉及利用海洋紅樹林內(nèi)生真菌生產(chǎn)抗癌蒽醌類化合物的培養(yǎng)基及制備方法。
背景技術(shù)：
21世紀(jì)是一個海洋大開發(fā)的時代，越來越多的沿海國家把開發(fā)海洋資源的能力作為當(dāng)前評估國家綜合實力的砝碼。獨特的海洋環(huán)境造就了各種各樣的生態(tài)系統(tǒng)，被譽(yù)為“海上森林”的紅樹林就是其中之一。紅樹林生長在熱帶、亞熱帶海岸的潮間帶，其生活環(huán)境具有強(qiáng)還原性、強(qiáng)酸性、高含鹽量和營養(yǎng)豐富等特點。紅樹林具有豐富的真菌資源，目前已分離鑒定的紅樹林真菌超過200種，海洋真菌可以產(chǎn)生眾多種類的天然活性化合物。海洋紅樹林內(nèi)生真菌No. 1403屬于層出鐮刀菌(Fusarium proliferatum),鹽生堅座殼種(Halorosellinia sp.),由香港城市大學(xué)L. L. P. Vrijmoed教授從紅樹林樹葉內(nèi)部分離得到。紅樹林內(nèi)生真菌No. 1403經(jīng)液體或固體發(fā)酵可產(chǎn)生20多種代謝物，包括蒽醌類(Anthraquinone)、萘醌類(Naphthoquinone)和咕噸酮類(Xanthone)等天然物質(zhì)。1403C 是其產(chǎn)生的一種蒽醌類次級代謝物，1403C也叫做SZ-685C，1403C純品為紅色顆粒狀結(jié)晶， 1403C及其乙酰化產(chǎn)物具有顯著的抗腫瘤活性，通過Akt/FOXO途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，是一種具有較好前景的抗癌候選藥物。然而，1403C在初始環(huán)境下的得率相當(dāng)?shù)?，目前已?jīng)成為制約1403C用于臨床前研究的瓶頸。因此通過優(yōu)化其培養(yǎng)環(huán)境、改善其發(fā)酵工藝已成為當(dāng)務(wù)之急。培養(yǎng)基是微生物生長的基質(zhì)，本領(lǐng)域迫切需要借助各種優(yōu)化手段，尋求利用海洋紅樹林內(nèi)生真菌No. 1403高效生產(chǎn)抗癌蒽醌類化合物1403C的培養(yǎng)基
發(fā)明內(nèi)容
甘本發(fā)明的目的在于提供利用海洋紅樹林內(nèi)生真菌生產(chǎn)抗癌蒽醌類化合物的培養(yǎng)O
本發(fā)明的另一目的在于提供利用海洋紅樹林內(nèi)生真菌生產(chǎn)抗癌蒽醌類化合物的方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種發(fā)酵培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有
(I)葡萄糖7-20g/L ；
⑵蛋白胨0.5-2g/L ；
⑶牛肉浸膏2-8g/L ；
(4) 一水硫酸錳0. 1-0. 5g/L ；
(1)-(4)的組分溶于10-60% (v/v)濃度的人工海水中。
在一個優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基含有
(I)葡萄糖9-15g/L ；
⑵蛋白胨O. 9-1. 6g/L ；
⑶牛肉浸膏3-7g/L ；
(4) 一水硫酸錳O. 2-0. 4g/L。
在另一優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)基含有
(I)葡萄糖ll-13g/L ；
⑵蛋白胨0. 95-1. 2g/L ；
⑶牛肉浸膏5. 5-6. 5g/L ；
(4) 一水硫酸錳0. 2~0. 3g/L。
在另一優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)基含有
(I)葡萄糖12. 36g/L ；
⑵蛋白胨I. 05g/L ；
⑶牛肉浸膏6.08g/L ；
(4) 一水硫酸錳0.246g/L。
在另一優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)基中，(1)-(4)的組分溶于30-50%工海水中；更佳地，(1)-(4)的組分溶于40% (v/v)濃度的人工海水中。
在另一優(yōu)選例中，所述的人工海水含有
(a)氯化鈉15-25g/L ；
(b)無水硫酸鈉3-7g/L ；
(C)無水氯化鈣l-2g/L ；
(d)六水氯化鎂4-8g/L ；
(e)硼酸0. 02-0. 04g/L ；
(f)溴化鉀0. 06-0. lg/L ；
(g)碳酸氫鈉0. 1-0. 2g/L ；
(a)-(g)的組分溶于水(較佳地為去離子水)中。
在另一優(yōu)選例中，所述的人工海水含有
(a)氯化鈉18-22g/L ；
(b)無水硫酸鈉4-6g/L ；
(C)無水氯化鈣I. 2-1. 5g/L ；
(d)六水氯化鎂5. 5-6. 8g/L ；
(e)硼酸0.025-0. 035g/L ；
(f)溴化鉀0. 07-0. 09g/L ；
(g)碳酸氫鈉0.14-0. 18g/L。
在另一優(yōu)選例中，所述的人工海水含有
(a)氯化鈉19.624g/L ；
(b)無水硫酸鈉4. 908g/L ；
(C)無水氯化鈣I. 392g/L ；
(d)六水氯化鎂6.240g/L ；
(e)硼酸0.032g/L ；
(f)溴化鉀0.08lg/L ；
(g)碳酸氫鈉O. 161g/L。在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的方法，包括分別稱取葡萄糖、蛋白胨、牛肉浸膏、一水硫酸錳，溶于所述10-60% (v/v)濃度的人工海水中，使得它們在培養(yǎng)基中的終濃度分別為7-20g/L、0. 5-2g/L、2-8g/L、0. 1-0. 5g/L。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的用途，用于培養(yǎng)海洋紅樹林內(nèi)生真菌No. 1403，生產(chǎn)蒽醌類化合物1403C。在本發(fā)明的另一方面，提供一種培養(yǎng)海洋紅樹林內(nèi)生真菌No. 1403、生產(chǎn)蒽醌類化合物1403C的方法，包括利用前面任一所述的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)。在另一優(yōu)選例中，所述的方法包括按3-10% (v/v)的接種量將海洋紅樹林內(nèi)生真菌No. 1403的新鮮種子液接入前面任一所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，28±2°C、170±20r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)4_7天(如5天，6天)，獲得發(fā)酵液。在另一優(yōu)選例中，海洋紅樹林內(nèi)生真菌No. 1403的新鮮種子液通過如下方式獲得用接種鏟從新鮮的海洋紅樹林內(nèi)生真菌No. 1403的固體平板中挖取4塊3X3mm瓊脂塊，接種至裝有IOOml種子培養(yǎng)基的500ml擋板瓶中，28 ± 2°C、170 ± 20r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)
2-3天，獲得種子液。在另一優(yōu)選例中，還包括從發(fā)酵液中分離獲得蒽醌類化合物1403C。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖I顯示了各實施例中，海洋紅樹林內(nèi)生真菌No. 1403在不同配方的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，得到的1403C產(chǎn)量。
具體實施例方式針對現(xiàn)有技術(shù)中難以利用海洋紅樹林內(nèi)生真菌No. 1403高效生產(chǎn)抗癌蒽醌類化合物1403C(亦稱SZ-685C)的現(xiàn)狀，本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，揭示了一種新型培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基成分簡單，制備操作方便，成本低廉，不需特殊設(shè)備，能顯著提高海洋紅樹林內(nèi)生真菌No. 1403發(fā)酵生產(chǎn)1403C的產(chǎn)量，從原來的600_800mg/L提高到2000mg/L以上。如本文所用，術(shù)語“含有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……構(gòu)成(制成)” “基本上由......構(gòu)成”、和“由......構(gòu)成”。培養(yǎng)基本發(fā)明人優(yōu)化了用于海洋紅樹林內(nèi)生真菌No. 1403發(fā)酵的培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基中包含葡萄糖、蛋白胨、牛肉浸膏和一水硫酸錳。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，用于配制本發(fā)明的培養(yǎng)基的各組分的用量如表I所示。表I
含量優(yōu)選量更優(yōu)選量最優(yōu)選量葡萄糖7-20g/L9-15g/L11-13g/L12.36g/L蛋白胨O.5-2g/LO. 9-1. 6g/LO. 95-1. 2g/LI.05g/L
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基含有)葡萄糖7-20g/L ；)蛋白胨O.5-2g/L ；)牛肉浸膏2-8g/L ；)一水硫酸錳O. 1-0. 5g/L ；)-(4)的組分溶于10.-60% (v/v)濃度的人工海水中。
2.如權(quán)利要求I所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基含有)葡萄糖9-15g/L ；)蛋白胨O. 9-1. 6g/L ；)牛肉浸膏3-7g/L ；)一水硫酸錳O. 2-0. 4g/L。
3.如權(quán)利要求I所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述的人工海水含有)氯化鈉15-25g/L ；)無水硫酸鈉3-7g/L ；)無水氯化鈣l-2g/L ；)六水氯化鎂4-8g/L ；)硼酸0.02-0. 04g/L ；)溴化鉀0. 06-0. I g/L ；)碳酸氫鈉0. 1-0. 2g/L ；-(g)的組分溶于水中。
4.如權(quán)利要求3所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述的人工海水含有氯化鈉18-22g/L ；無水硫酸鈉 4-6 g/L ；無水氯化鈣 I. 2-1. 5g/L ；六水氯化鎂 5. 5-6. 8g/L ；硼酸O. 025-0. 035g/L ；溴化鉀O. 07-0. 09g/L ；碳酸氫鈉O. 14-0. 18g/L。
5.一種制備權(quán)利要求I任一所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的方法，其特征在于，包括分別稱取葡萄糖、蛋白胨、牛肉浸膏、一水硫酸錳，溶于所述10-60% (v/v)濃度的人工海水中，使得它們在培養(yǎng)基中的終濃度分別為7-20g/L、0. 5-2g/L、2-8g/L、0. 1-0. 5g/L。
6.權(quán)利要求1-4任一所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的用途，用于培養(yǎng)海洋紅樹林內(nèi)生真菌 No. 1403，生產(chǎn)蒽醌類化合物1403C。
7.—種培養(yǎng)海洋紅樹林內(nèi)生真菌No. 1403、生產(chǎn)蒽醌類化合物1403C的方法，包括利用權(quán)利要求1-4任一所述的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，包括按3-10% (v/v)的接種量將海洋紅樹林內(nèi)生真菌No. 1403的新鮮種子液接入權(quán)利要求 1-4任一所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，28±2°〇、170±201·/!^!!搖床發(fā)酵培養(yǎng).4_7天(如5天，6天)，獲得發(fā)酵液。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，海洋紅樹林內(nèi)生真菌No.1403的新鮮種子液通過如下方式獲得用接種鏟從新鮮的海洋紅樹林內(nèi)生真菌No .1403的固體平板中挖取 4塊3X 3mm瓊脂塊，接種至裝有IOOml種子培養(yǎng)基的500ml擋板瓶中，28±2°C、170±20r/ min搖床發(fā)酵培養(yǎng)2-3天，獲得種子液。
10.如權(quán)利要求7-9任一所述的方法，其特征在于，還包括從發(fā)酵液中分離獲得蒽醌類化合物1403C。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用海洋紅樹林內(nèi)生真菌生產(chǎn)抗癌蒽醌類化合物的培養(yǎng)基及制備方法。揭示了一種新型培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基成分簡單，制備操作方便，成本低廉，不需特殊設(shè)備，能顯著提高海洋紅樹林內(nèi)生真菌No.1403發(fā)酵生產(chǎn)1403C的產(chǎn)量。
文檔編號C12P15/00GK102586355SQ20121006701
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月14日
發(fā)明者周衛(wèi)強(qiáng), 周祥山, 張元興, 蔡孟浩 申請人:華東理工大學(xué)