專利名稱：高產(chǎn)木質(zhì)纖維素降解酶菌株的復(fù)篩方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及菌株的篩選方法，具體涉及一種高產(chǎn)木質(zhì)纖維素降解酶菌株的復(fù)篩方法。
背景技術(shù)：
木質(zhì)纖維素是世界上儲量大并具備可再生能力的天然環(huán)保型資源，每年全世界木質(zhì)纖維素的產(chǎn)量每年約有750億噸。在環(huán)境污染和化石能源日漸枯竭的現(xiàn)代社會，利用木質(zhì)纖維素資源替代化石能源成為目前亟待解決的問題。木質(zhì)纖維素的降解是木質(zhì)纖維素資源利用的最大困難。世界各國已投入巨大的人力財力進行木質(zhì)纖維素降解的研究，通過微生物篩選，誘變，酶的純化，基因克隆及表達，宏基因組學(xué)，宏蛋白質(zhì)組學(xué)等方法，從理論研究到實際應(yīng)用希望能找出解決木質(zhì)纖維素降解這一難題的突破口。為了有效的利用這樣大量廉價環(huán)保的資源，我們首先要了解天然的木質(zhì)纖維素的組成和結(jié)構(gòu)。除棉花外，絕大多數(shù)天然的木質(zhì)纖維素的實質(zhì)就是大量的植物纖維細(xì)胞壁的集合，主要是由纖維素(cellulose),半纖維素(hemicellulose),木質(zhì)素(Iignin)三類物質(zhì)組成的，這三類物質(zhì)在天然木質(zhì)纖維素中的含量為纖維素40%-50%，半纖維素20-35%，木質(zhì)素20%-30%。其中以纖維素為骨架物質(zhì)，半纖維素和木質(zhì)素為包裹組分和包埋組分，它們之間通過共價鍵和化學(xué)鍵緊密連結(jié)在一起。天然木質(zhì)纖維素的組成復(fù)雜，因此微生物降解天然木質(zhì)纖維素也是分泌一系列針對不同組分的酶協(xié)同作用，共同降解木質(zhì)纖維素，這些酶主要分為纖維素降解酶， 半纖維素降解酶和木質(zhì)素降解酶類。纖維素酶是一類能夠作用于纖維素最終生成葡萄糖的酶的總稱，一般纖維素酶有十幾個到幾十個組分，這些組分可分為三大類葡聚糖內(nèi)切酶(endo-glucanases, EG ),葡聚糖外切酶或纖維二糖水解酶(exo-glucanases or cellobiohydralases, CBH)和 ￠-葡萄糖苷酶(3-glucosidases)。半纖維素中最具代表性的一種就是木聚糖，在植物細(xì)胞壁中的含量僅次于纖維素，因此對于木聚糖酶系的組成研究的比較清楚。木聚糖酶系包括￠ -內(nèi)切木聚糖酶(endo-beta-xylanase),
木糖苷酶(beta-xylosidase), 葡萄糖醒酸酶(alpha-glucuronidase),乙酸木聚糖酯酶(Acetylxylan esterase),阿魏酸酯酶(feruloyl esterase), a-阿拉伯呋喃糖酶(alpha-N-arabinofuranosidase)，葡聚糖 l，4_a -葡糖苷酶(glucan 1，4-alpha-glucosidase)。木質(zhì)素降解酶類主要有三種木質(zhì)素過氧化物酶(Lignin peroxidase,簡稱 Lip)、猛過氧化物酶(Mn-dependent peroxidase,簡稱 MnP)和漆酶，此外還有HRP、CDH等酶類。自然界中能夠降解木質(zhì)纖維素的菌種類很多，目前已經(jīng)分離篩選出的能夠產(chǎn)生木質(zhì)纖維素降解酶的細(xì)菌有梭菌屬(Clostridium)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、桿菌屬(Bacillus)、擬桿菌 (Bacteroides)、高溫單胞菌屬(Thermomonospora)、歐文氏菌屬(Erwinia)、醋弧菌屬 (Acetovibrio)等。真菌主要有木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬 (Penicillium)、白腐真菌(P chrysosporium)、白絹菌(Sclerotium rolfsii)以及裂殖菌屬(Schizophyllum)等。放線菌主要有鏈霉屬、高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)等。對這些微生物進行傳統(tǒng)的育種改造，能夠有效提高酶活，改善酶的特性，用于工業(yè)生產(chǎn)。微生物降解纖維素的酶類基本都屬于誘導(dǎo)型酶，根據(jù)目前的研究，不同的誘導(dǎo)物誘導(dǎo)產(chǎn)生的木質(zhì)纖維素降解酶系種類及比例是不同的。目前的報道中，用可溶性的山梨糖 (Sorbose),乳糖(Lactose)和槐糖(Sophorose),以及一些不溶性碳源如純的微晶纖維素、 木聚糖、預(yù)處理的木質(zhì)纖維素、牛糞、玉米纖維，誘導(dǎo)促使微生物產(chǎn)酶，但在工業(yè)生產(chǎn)中，這些原料價格昂貴，并不經(jīng)濟實用，因此只有使用工業(yè)原料的誘導(dǎo)物來誘導(dǎo)產(chǎn)酶，才能在生產(chǎn)中更具有針對性。一般篩選是通過微生物在以纖維素作為碳源的平板培養(yǎng)基形成的透明圈大小來判定其纖維素酶活或該微生物對纖維素的降解能力，該方法需要預(yù)先將色素與纖維素結(jié)合，或在微生物培養(yǎng)后進行染色脫色步驟，如果是在微生物培養(yǎng)后進行染色還需要將菌種備份，這樣操作步驟非常繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高產(chǎn)木質(zhì)纖維素降解酶菌株的復(fù)篩方法，針對傳統(tǒng)纖維素酶菌株篩選培養(yǎng)基在對工業(yè)化篩選中針對性不足等弊端，采用粉碎后預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素和粉碎處理的濾紙作為主要的碳源和誘導(dǎo)因子前體進行篩選，同時在結(jié)合真菌纖維素酶分泌和水解的特點的基礎(chǔ)上，通過對高產(chǎn)纖維素酶微生物的生長形態(tài)以及對濾紙的利用情況進行評判，篩選出高產(chǎn)的纖維素酶菌株。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是該復(fù)篩方法包括以下步驟
(1)制備基層培養(yǎng)基依金屬離子溶液的質(zhì)量計，將含有其質(zhì)量的0.1-5%的粉碎后的濾紙、0. 5-3% 瓊脂、0. I- 1% 硫酸銨(NH4) 2S04、0. 05-0. 5% 磷酸二氫鉀 KH2P04、0. 01-0. 2% 玉米漿置于容器中，在121 °C -128 °C消毒滅菌20-30分鐘后取出搖勻，待溫度冷卻到 60-90°C時，加入金屬離子溶液，得基層培養(yǎng)基液；然后將基層培養(yǎng)基液用移液槍分裝至滅過菌的試管內(nèi)20-60_，置于冷水中快速凝固，濾紙不發(fā)生沉降，表面無氣泡，凝固后備用；
(2)制備表層培養(yǎng)基依金屬離子溶液的質(zhì)量計，將含有其質(zhì)量的0.1-5%的粉碎后干的50目以上的預(yù)處理木質(zhì)纖維素、0-3%瓊脂、0. I- 1%硫酸銨(NH4) 2S04、0. 05-0. 5%磷酸二氫鉀KH2P04、0. 01-0. 2%玉米漿置于容器中，在121 °C _128°C消毒滅菌20-30分鐘后取出搖勻，待溫度冷卻到60-90°C時，加入金屬離子溶液，得表層培養(yǎng)基液；然后將表層培養(yǎng)基液用移液槍加入步驟(I)的凝固的基層培養(yǎng)基的表面0. l-20mm高度，待凝固；
(3)接種將被篩選的菌株接種在步驟(2)的試管里的表層培養(yǎng)基的表面上，置于培養(yǎng)箱中，30°C培養(yǎng)3-20天，定期觀察記錄生長狀況及培養(yǎng)基的降解狀況；
(4)篩選以培養(yǎng)試管中形成的透明層長短作為判定高產(chǎn)的菌株的標(biāo)準(zhǔn)，挑選那些生長旺盛，形成或不形成孢子，在黑色或其他背景下觀察透明層相對較長的作為相對高產(chǎn)菌株。其中，金屬離子液的制備方法如下首先，制備高濃度金屬離子液，高濃度金屬離子液的濃度為金屬離子液濃度的10-200倍，其中含硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸鋅、硫酸錳和氯化鈷；其次，稀釋高濃度金屬離子液得金屬離子液，并用質(zhì)量濃度36%的HCl將金屬離子液的pH調(diào)至1-3，金屬離子液的添加量確保金屬離子在培養(yǎng)基中濃度為硫酸鎂MgS04*7H20
0.05-lg/L、硫酸亞鐵 FeS04*7H20 0. l_20mg/L、硫酸鋅 ZnS04*7H20 0. l_5mg/L、硫酸猛MnS04*7H20 0. l-10mg/L、氯化鈷 CoC12*6H20 0. l_20mg/L。其中，預(yù)處理的木質(zhì)纖維素的處理方法是如下一種或者幾種方法的組合一是利用蒸汽或者超臨界過熱水在含有質(zhì)量百分比0-2%的稀酸環(huán)境下進行蒸煮1-30分鐘，酸是指鹽酸、硫酸、亞硫酸、硝酸、磷酸、碳酸中的一種或其組合；二是使用質(zhì)量濃度0. 2- 20%的堿液在溫度60-160°C蒸煮1-600分鐘，堿是指氫氧化鉀、氫氧化鈉、碳酸鈉、氨水、生石灰、 氫氧化鈣中的一種或其組合。其中，木質(zhì)纖維素為農(nóng)作物秸桿、草類、林木生物質(zhì)中的一項或幾項的組合；所述的農(nóng)作物秸桿為稻草、麥草、棉花桿、油菜桿、玉米桿、玉米芯、大豆桿莖、花生桿莖、葵花桿、 甘蔗渣中的一種或幾種的組合；所述的草類為芒草、柳枝稷、蘆葦中的一種或幾種的組合; 所述的林木生物質(zhì)為軟木、硬木、鋸木屑中的一種或幾種的組合。其中，所述的粉碎處理的濾紙指各種不同品牌的定性濾紙、定量濾紙、定性層析濾紙、定量層析濾紙、濾速快、中、慢以及各種不同直徑濾紙。本發(fā)明的篩選方法是基于微生物產(chǎn)酶的特點菌株產(chǎn)纖維素酶是在整體生長后期分泌出來的，分泌出來的纖維素酶能夠在培養(yǎng)基中滲透，作用于預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素及濾紙，將其降解為葡萄糖等較小分子，菌體利用葡萄糖生長，分泌出的酶繼續(xù)向下滲透，進一步降解更深層的培養(yǎng)基，形成較長的透明段；對于酶分泌能力差的菌株，由于無法分泌纖維素酶或者分泌纖維素酶較少，對于培養(yǎng)基中的纖維素降解能力差，無法更加深入的降解更深層的培養(yǎng)基，形成的透明段就相對較短。本發(fā)明具有以下優(yōu)點1、提供了一種廉價、高效的對高產(chǎn)纖維素酶菌株進行復(fù)篩的固體培養(yǎng)基和篩選評判標(biāo)準(zhǔn)，這種復(fù)篩方法比傳統(tǒng)的篩選方法簡便易行，并且具有更強的工業(yè)化針對性，能更有效的篩選出適應(yīng)于工業(yè)化培養(yǎng)基的高產(chǎn)菌株；2、在實驗室及工廠產(chǎn)品的纖維素酶活評價系統(tǒng)中，以及對高產(chǎn)纖維素酶菌株篩選過程中，濾紙酶活是公認(rèn)的具有權(quán)威性的對于纖維素酶系統(tǒng)的綜合評價指標(biāo)，因此使用濾紙作為復(fù)篩培養(yǎng)基的主要碳源，能夠更加有針對性的篩選出纖維素酶高產(chǎn)菌株；3、將粉碎后預(yù)處理的天然木質(zhì)纖維素及濾紙相結(jié)合是一種更能真實反映菌株在工業(yè)化培養(yǎng)基里面的酶分泌情況，并且基于整體酶活的篩選鑒別方法，該方法具有針對性更強，效率更高等特點；4、本發(fā)明的方法操作簡便，易于觀察記錄，同時能夠能獲得純的種系進行短期保藏。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例進一步說明本發(fā)明的技術(shù)解決方案，這些實施例不能理解為是對技術(shù)解決方案的限制。實施例中的木質(zhì)纖維素是采用稻草，濕度為20%左右，平均長度為2厘米左右；預(yù)處理條件是直接將2公斤稻草置于在50升的預(yù)處理壓力容器中，在200攝氏度的濕熱蒸汽下預(yù)處理10分鐘；預(yù)處理后的秸桿烘干后進行粉碎，在通過200目的篩子獲得粉碎后的預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素。實施例中的濾紙采用18_直徑、雙圈牌定性濾紙，用剪刀剪碎，在粉碎機中粉碎3 次，每次2min，粉碎機功功率為1500W，轉(zhuǎn)速為25000rpm，頻率50_60Hz。實施例中的菌種是采用里氏木霉的變體，通過紫外(UV)光照射和亞硝基胍(NTG) 進行變異。
實施例I :依發(fā)下步驟復(fù)篩木質(zhì)纖維素降解酶菌株
(I)基層培養(yǎng)基依金屬離子溶液的質(zhì)量計，將含有其質(zhì)量的0. 1%的粉碎后的濾紙、
0.5%瓊脂、0. 1%硫酸銨(NH4)2S04、0. 05%磷酸二氫鉀KH2P04、0. 01%玉米漿置于容器中，在 121°C消毒滅菌30分鐘后取出搖勻，待溫度冷卻到60°C時，加入金屬離子溶液，得基層培養(yǎng)基液；然后將基層培養(yǎng)基液用移液槍分裝至滅過菌的試管內(nèi)20mm，置于冷水中快速凝固， 濾紙不發(fā)生沉降，表面無氣泡，凝固后備用；其中，金屬離子液的制備方法如下首先，制備高濃度金屬離子液，高濃度金屬離子液的濃度為金屬離子液濃度的10倍，其中含硫酸鎂、 硫酸亞鐵、硫酸鋅、硫酸錳和氯化鈷；其次，稀釋高濃度金屬離子液得金屬離子液，并用質(zhì)量濃度36%的HCl將金屬離子液的pH調(diào)至1，金屬離子液的添加量確保金屬離子在培養(yǎng)基中濃度為硫酸鎂 MgS04*7H20 0. 05g/L、硫酸亞鐵 FeS04*7H20 0. lmg/L、硫酸鋅 ZnS04*7H20
0.lmg/L、硫酸錳 MnS04*7H20 0. lmg/L、氯化鈷 CoC12*6H20 0. lmg/L ；
(2)表層培養(yǎng)基依金屬離子溶液的質(zhì)量計，將含有其質(zhì)量的0.1%的粉碎后干的50目以上的預(yù)處理木質(zhì)纖維素、0. 1%硫酸銨(NH4)2S04、0. 05%磷酸二氫鉀KH2P04、0. 01%玉米漿置于容器中，在121°C°C消毒滅菌30分鐘后取出搖勻，待溫度冷卻到60°C時，加入金屬離子溶液，得表層培養(yǎng)基液；然后將表層培養(yǎng)基液用移液槍加入步驟(I)的凝固的基層培養(yǎng)基的表面0. Imm高度，待凝固；其中，金屬離子液的制備方法如下首先，制備高濃度金屬離子液，高濃度金屬離子液的濃度為金屬離子液濃度的200倍,其中含硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸鋅、硫酸錳和氯化鈷；其次，稀釋高濃度金屬離子液得金屬離子液，并用質(zhì)量濃度36%的 HCl將金屬離子液的pH調(diào)至1，金屬離子液的添加量確保金屬離子在培養(yǎng)基中濃度為硫酸鎂 MgS04*7H20 lg/L、硫酸亞鐵 FeS04*7H20 20mg/L、硫酸鋅 ZnS04*7H20 5mg/L、硫酸錳 MnS04*7H20 10mg/L、氯化鈷 CoC12*6H20 20mg/L ；
(3)接種將被篩選的誘變菌種的孢子懸液20u I接種在步驟(2)的試管里的表層培養(yǎng)基的表面上，置于培養(yǎng)箱中，30°C培養(yǎng)3-20天，定期觀察記錄生長狀況及培養(yǎng)基的降解狀況；
(4)篩選7天時菌已產(chǎn)生孢子，培養(yǎng)基表層呈綠色，表面均勻細(xì)膩，孢子量大，形成透明段5 mm, 10天時形成透明段7mm，該菌種發(fā)酵濾紙酶活可達0. 48U/ml。實施例2 :依發(fā)下步驟復(fù)篩木質(zhì)纖維素降解酶菌株
(I)基層培養(yǎng)基依金屬離子溶液的質(zhì)量計，將含有其質(zhì)量的2. 55%的粉碎后的濾紙、
1.75%瓊脂、0. 55%硫酸銨(NH4) 2S04、0. 275%磷酸二氫鉀KH2P04、0. 105%玉米漿置于容器中，在125°C消毒滅菌25分鐘后取出搖勻，待溫度冷卻到75°C時，加入金屬離子溶液，得基層培養(yǎng)基液；然后將基層培養(yǎng)基液用移液槍分裝至滅過菌的試管內(nèi)40_，置于冷水中快速凝固，濾紙不發(fā)生沉降，表面無氣泡，凝固后備用；其中，金屬離子液的制備方法如下首先，制備高濃度金屬離子液，高濃度金屬離子液的濃度為金屬離子液濃度的105倍，其中含硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸鋅、硫酸錳和氯化鈷；其次，稀釋高濃度金屬離子液得金屬離子液， 并用質(zhì)量濃度36%的HCl將金屬離子液的pH調(diào)至2，金屬離子液的添加量確保金屬離子在培養(yǎng)基中濃度為硫酸鎂MgS04*7H20 0. 525g/L、硫酸亞鐵FeS04*7H20 10. 05mg/L、硫酸鋅 ZnS04*7H20 2. 55mg/L、硫酸錳 MnS04*7H20 5. 05mg/L、氯化鈷 CoC12*6H20 10. 05mg/L ；
(2)表層培養(yǎng)基依金屬離子溶液的質(zhì)量計，將含有其質(zhì)量的2. 55%的粉碎后干的50目以上的預(yù)處理木質(zhì)纖維素、I. 5%瓊脂、0. 55%硫酸銨(NH4)2S04、0. 275%磷酸二氫鉀KH2P04、0.105%玉米漿置于容器中，在125°C消毒滅菌25分鐘后取出搖勻，待溫度冷卻到75°C時， 加入金屬離子溶液，得表層培養(yǎng)基液；然后將表層培養(yǎng)基液用移液槍加入步驟(I)的凝固的基層培養(yǎng)基的表面IOmm高度，待凝固；其中，金屬離子液的制備方法如下首先，制備高濃度金屬離子液，高濃度金屬離子液的濃度為金屬離子液濃度的105倍,其中含硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸鋅、硫酸錳和氯化鈷；其次，稀釋高濃度金屬離子液得金屬離子液，并用質(zhì)量濃度36%的HCl將金屬離子液的pH調(diào)至2，金屬離子液的添加量確保金屬離子在培養(yǎng)基中濃度為硫酸鎂 MgS04*7H20 0. 525g/L、硫酸亞鐵 FeS04*7H20 10. 05mg/L、硫酸鋅 ZnS04*7H20
2.55mg/L、硫酸錳 MnS04*7H20 5. 05mg/L、氯化鈷 CoC12*6H20 10. 05mg/L ；
(3)接種將被篩選的誘變菌種的孢子懸液20u I接種在步驟(2)的試管里的表層培養(yǎng)基的表面上，置于培養(yǎng)箱中，30°C培養(yǎng)3-20天，定期觀察記錄生長狀況及培養(yǎng)基的降解狀況；
(4)篩選7天時菌已產(chǎn)生孢子，培養(yǎng)基表層呈綠色，表面均勻細(xì)膩，孢子量大，形成透明段6 mm, 10天時形成透明段8mm，該菌種發(fā)酵濾紙酶活可達0. 55U/ml。實施例3 :依發(fā)下步驟復(fù)篩木質(zhì)纖維素降解酶菌株
(I)基層培養(yǎng)基依金屬離子溶液的質(zhì)量計，將含有其質(zhì)量的5%的粉碎后的濾紙、3% 瓊脂、1%硫酸銨(NH4) 2S04、0. 5%磷酸二氫鉀KH2P04、0. 2%玉米漿置于容器中，在128°C消毒滅菌20分鐘后取出搖勻，待溫度冷卻到90°C時，加入金屬離子溶液，得基層培養(yǎng)基液； 然后將基層培養(yǎng)基液用移液槍分裝至滅過菌的試管內(nèi)60_，置于冷水中快速凝固，濾紙不發(fā)生沉降，表面無氣泡，凝固后備用；其中，金屬離子液的制備方法如下首先，制備高濃度金屬離子液，高濃度金屬離子液的濃度為金屬離子液濃度的200倍,其中含硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸鋅、硫酸錳和氯化鈷；其次，稀釋高濃度金屬離子液得金屬離子液，并用質(zhì)量濃度 36%的HCl將金屬離子液的pH調(diào)至3，金屬離子液的添加量確保金屬離子在培養(yǎng)基中濃度為硫酸鎂 MgS04*7H20 lg/L、硫酸亞鐵 FeS04*7H20 20mg/L、硫酸鋅 ZnS04*7H20 5mg/L、硫酸錳 MnS04*7H20 10mg/L、氯化鈷 CoC12*6H20 20mg/L ；
(2)表層培養(yǎng)基依金屬離子溶液的質(zhì)量計，將含有其質(zhì)量的5%的粉碎后干的50目以上的預(yù)處理木質(zhì)纖維素、3%瓊脂、1%硫酸銨(NH4)2S04、0. 5%磷酸二氫鉀KH2P04、0. 2%玉米漿置于容器中，在128°C消毒滅菌20分鐘后取出搖勻，待溫度冷卻到90°C時，加入金屬離子溶液，得表層培養(yǎng)基液；然后將表層培養(yǎng)基液用移液槍加入步驟(I)的凝固的基層培養(yǎng)基的表面20mm高度，待凝固；其中，金屬離子液的制備方法如下首先，制備高濃度金屬離子液，高濃度金屬離子液的濃度為金屬離子液濃度的200倍,其中含硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸鋅、硫酸錳和氯化鈷；其次，稀釋高濃度金屬離子液得金屬離子液，并用質(zhì)量濃度36%的HCl 將金屬離子液的PH調(diào)至3，金屬離子液的添加量確保金屬離子在培養(yǎng)基中濃度為硫酸鎂 MgS04*7H20 0. 05g/L、硫酸亞鐵 FeS04*7H20 0. lmg/L、硫酸鋅 ZnS04*7H20 0. lmg/L、硫酸錳 MnS04*7H20 0. lmg/L、氯化鈷 CoC12*6H20 0. lmg/L ；
(3)接種將被篩選的誘變菌種的孢子懸液20u I接種在步驟(2)的試管里的表層培養(yǎng)基的表面上，置于培養(yǎng)箱中，30°C培養(yǎng)3-20天，定期觀察記錄生長狀況及培養(yǎng)基的降解狀況；
(4)篩選7天時菌已產(chǎn)生孢子，培養(yǎng)基表層呈綠色，表面均勻細(xì)膩，孢子量大，形成透明段7 mm, 10天時形成透明段9_，該菌種發(fā)酵濾紙酶活可達0. 63U/ml。
權(quán)利要求
1.高產(chǎn)木質(zhì)纖維素降解酶菌株的復(fù)篩方法，其特征在于該復(fù)篩方法包括以下步驟(O制備基層培養(yǎng)基依金屬離子溶液的質(zhì)量計，將含有其質(zhì)量的O. 1-5%的粉碎后的濾紙、O. 5-3% 瓊脂、O. I- 1% 硫酸銨(NH4)2S04、0. 05-0. 5% 磷酸二氫鉀 ΚΗ2Ρ04、0· 01-0. 2% 玉米漿置于容器中，在121 °C _128°C消毒滅菌20-30分鐘后取出搖勻，待溫度冷卻到60_90°C 時，加入金屬離子溶液，得基層培養(yǎng)基液；然后將基層培養(yǎng)基液用移液槍分裝至滅過菌的試管內(nèi)20-60_，置于冷水中快速凝固，濾紙不發(fā)生沉降，表面無氣泡，凝固后備用；(2)制備表層培養(yǎng)基依金屬離子溶液的質(zhì)量計，將含有其質(zhì)量的O.1-5%的粉碎后干的50目以上的預(yù)處理木質(zhì)纖維素、0-3%瓊脂、O. I- 1%硫酸銨(NH4) 2S04、0. 05-0. 5%磷酸二氫鉀ΚΗ2Ρ04、0. 01-0. 2%玉米漿置于容器中，在121°C _128°C消毒滅菌20-30分鐘后取出搖勻，待溫度冷卻到60-90°C時，加入金屬離子溶液，得表層培養(yǎng)基液；然后將表層培養(yǎng)基液用移液槍加入步驟(I)的凝固的基層培養(yǎng)基的表面O. l_20mm高度，待凝固；(3)接種將被篩選的菌株接種在步驟(2)的試管里的表層培養(yǎng)基的表面上，置于培養(yǎng)箱中，30°C培養(yǎng)3-20天，定期觀察記錄生長狀況及培養(yǎng)基的降解狀況；(4)篩選以培養(yǎng)試管中形成的透明層長短作為判定高產(chǎn)的菌株的標(biāo)準(zhǔn)，挑選那些生長旺盛，形成或不形成孢子，在黑色或其他背景下觀察透明層相對較長的作為相對高產(chǎn)菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高產(chǎn)木質(zhì)纖維素降解酶菌株的復(fù)篩方法，其特征在于金屬離子液的制備方法如下首先，制備高濃度金屬離子液，高濃度金屬離子液的濃度為金屬離子液濃度的10-200倍，其中含硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸鋅、硫酸錳和氯化鈷；其次，稀釋高濃度金屬離子液得金屬離子液，并用質(zhì)量濃度36%的HCl將金屬離子液的pH調(diào)至1-3，金屬離子液的添加量確保金屬離子在培養(yǎng)基中濃度為硫酸鎂MgSO4 · 7H20 O. 05-lg/L、硫酸亞鐵 FeSO4 ·7Η20 O. l_20mg/L、硫酸鋅 ZnSO4 · 7Η20 O. l_5mg/L、硫酸錳 MnSO4 · 7H20 O. 1-lOmg/L、 氯化鈷 CoCl2 · 6H20 0. l-20mg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高產(chǎn)木質(zhì)纖維素降解酶菌株的復(fù)篩方法，其特征在于預(yù)處理的木質(zhì)纖維素的處理方法是如下一種或者幾種方法的組合一是利用蒸汽或者超臨界過熱水在含有質(zhì)量百分比0-2%的稀酸環(huán)境下進行蒸煮1-30分鐘，酸是指鹽酸、硫酸、亞硫酸、硝酸、磷酸、碳酸中的一種或其組合；二是使用質(zhì)量濃度O. 2- 20%的堿液在溫度60-160°C蒸煮1-600分鐘，堿是指氫氧化鉀、氫氧化鈉、碳酸鈉、氨水、生石灰、氫氧化鈣中的一種或其組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高產(chǎn)木質(zhì)纖維素降解酶菌株的復(fù)篩方法，其特征在于木質(zhì)纖維素為農(nóng)作物秸桿、草類、林木生物質(zhì)中的一項或幾項的組合；所述的農(nóng)作物秸桿為稻草、麥草、棉花桿、油菜桿、玉米桿、玉米芯、大豆桿莖、花生桿莖、葵花桿、甘蔗渣中的一種或幾種的組合；所述的草類為芒草、柳枝稷、蘆葦中的一種或幾種的組合；所述的林木生物質(zhì)為軟木、硬木、鋸木屑中的一種或幾種的組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高產(chǎn)木質(zhì)纖維素降解酶菌株的復(fù)篩方法，其特征在于所述的粉碎處理的濾紙指各種不同品牌的定性濾紙、定量濾紙、定性層析濾紙、定量層析濾紙、 濾速快、中、慢以及各種不同直徑濾紙。
全文摘要
本發(fā)明公開了高產(chǎn)木質(zhì)纖維素降解酶菌株的復(fù)篩方法，該復(fù)篩方法包括以下步驟(1)基層培養(yǎng)基的制備；(2)在基層培養(yǎng)基上方的表層培養(yǎng)基的制備；(3)接種將被篩選的菌株接種在步驟(2)的試管里的表層培養(yǎng)基的表面上，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(4)篩選以培養(yǎng)試管中形成的透明層長短作為判定高產(chǎn)的菌株的標(biāo)準(zhǔn)，挑選那些生長旺盛，形成或不形成孢子，在黑色或其他背景下觀察透明層相對較長的作為相對高產(chǎn)菌株。本發(fā)明的復(fù)篩方法比傳統(tǒng)的篩選方法簡便易行，并且具有更強的工業(yè)化針對性，能更有效的篩選出適應(yīng)于工業(yè)化培養(yǎng)基的高產(chǎn)菌株。
文檔編號C12N1/14GK102586123SQ20121004349
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月24日
發(fā)明者呂睿瑞, 周玉珍, 熊濤, 熊鵬 申請人:熊鵬