專利名稱：測(cè)定脫水蒜制品中致病微生物菌落總數(shù)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種采用高速離心法分離和測(cè)定脫水蒜制品中致病微生物菌落總數(shù)的方法。
背景技術(shù)：
食品衛(wèi)生與安全問題同每個(gè)人的身體健康息息相關(guān)，歷來被世界各國(guó)政府和主流傳媒所關(guān)注。近年來隨著人們對(duì)食品安全的關(guān)注度越來越高，特別是在近年來我國(guó)食品安全事故頻發(fā)，與中國(guó)出口產(chǎn)品有關(guān)的食品質(zhì)量安全事件時(shí)常見諸報(bào)端的大背景下，進(jìn)口國(guó)對(duì)來自中國(guó)的食品檢測(cè)越來越嚴(yán)格。我國(guó)是世界上最大的大蒜(Allium sativum L.)及其制品生產(chǎn)與出口國(guó)，已成為我國(guó)首位出口換匯蔬菜，其出口逐年增加。其中脫水蒜制品就是安徽省傳統(tǒng)大宗出口農(nóng)產(chǎn)品，產(chǎn)品主要出口日韓、歐美市場(chǎng)，出口量一直穩(wěn)居全國(guó)前列。加強(qiáng)出口脫水蒜制品衛(wèi)生檢驗(yàn)監(jiān)管不僅關(guān)系到單一產(chǎn)品出口，更是保護(hù)農(nóng)產(chǎn)品全行業(yè)貿(mào)易正常進(jìn)行。然而脫水蒜制品至今沒有相關(guān)微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)出臺(tái)，長(zhǎng)期借用食品微生物GB4789 系列標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，但因?yàn)槊撍庵破肪哂歇?dú)特的產(chǎn)品特性，實(shí)際檢測(cè)中暴露出大量問題，表現(xiàn)出明顯的不適宜。沒有合適檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)確保產(chǎn)品質(zhì)量，消費(fèi)者安全、保障農(nóng)產(chǎn)品出口貿(mào)易順暢構(gòu)成很大隱患。因此開展脫水蒜制品的安全衛(wèi)生檢測(cè)技術(shù)的研發(fā)對(duì)于確保農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易安全和消費(fèi)者食用安全都有著重要的意義。脫水蒜制品主要為蒜粉、蒜粒和蒜片，是上好的調(diào)味品和保健食品原料，該廣品選用優(yōu)質(zhì)大蒜，經(jīng)過去皮、清洗、烘干、精選、磨粉、包裝等多道工序加工而成。水分含量低于 6%，不添加任何食品添加劑，不添加防腐劑。研究表明作為保健食品，對(duì)于消化不良、感冒、 呼吸道感染、消化道潰瘍、血脂偏高、血管硬化、患癌癥的成年人和中老年人心臟病、心腦血管疾病者；免疫力低下者均有輔助治療的效果。蒜粉具有廣譜抗菌和抑菌、殺菌作用，可有效抑制大腸桿菌、沙門氏等有害菌類的生長(zhǎng)、繁殖，對(duì)畜禽因革蘭氏陰性及陽性菌感染引起的呼吸道、消化道疾病及其并發(fā)癥顯著療效。大蒜素可有效刺激動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生香味的氨基酸的形成，增加肉蛋中的香味成分，使肉蛋鮮味更美。加入飼料中可提高畜禽及魚蝦抗病能力，加快生長(zhǎng)速度。有清瘟、解毒、活血化瘀的功能，可顯著降低飼料中有效物質(zhì)的毒性。
脫水蒜制品蒜味濃烈、純正、不產(chǎn)生抗藥性、無毒無害、體內(nèi)無殘留。正是因?yàn)槊撍庵破返膬?yōu)良品性，被越來越廣泛的運(yùn)用和消費(fèi)，加強(qiáng)對(duì)其衛(wèi)生安全研究才顯得越發(fā)重要。脫水蒜制品的生產(chǎn)要經(jīng)過多個(gè)環(huán)節(jié)，其中很多環(huán)節(jié)都存在微生物污染與繁殖的可能。那么為什么現(xiàn)行GB4789系列標(biāo)準(zhǔn)不適合脫水蒜制品的安全衛(wèi)生檢測(cè)呢？因?yàn)榇笏庵泻幸环N天然植物抑菌劑大蒜素，大蒜素是大蒜瓣和蒜精油中含硫化合物的總稱，具有不同程度的殺(抑)菌作用，被譽(yù)為天然殺菌劑，有報(bào)道稱它殺菌的能力幾乎是青霉素的100倍。 1/80000的大蒜素能抑制或殺滅葡萄球菌、鏈球菌、傷寒、痢疾桿菌等。大蒜鱗莖提取液對(duì)青霉、根霉、曲霉、木霉有明顯的抑制作用
發(fā)明內(nèi)容
為了確保農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易安全和消費(fèi)者食用安全，本發(fā)明提供一種快速、有效地分離和測(cè)定脫水蒜制品中致病微生物菌落總數(shù)的方法。本發(fā)明的具體操作步驟如下
(1)取蒜粉25g，加入225mL滅菌稀釋液混合均勻，得混合液；
所述滅菌稀釋液的配置稱取34. Og的磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中，用濃度Imol/ L的175mL氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為7. 2，用蒸餾水稀釋至IOOOmL定容，得母液；取I. 25mL 母液，用蒸餾水稀釋至IOOOmL,溫度121°C高壓滅菌15分鐘，得滅菌稀釋液；
(2)將混合液經(jīng)帶濾膜的均質(zhì)袋過濾，所述濾膜孔徑為330μ m、直徑50mm，吸取清液， 將I. 5mL清液分裝于2只2mL離心管中，每只離心管中裝有O. 75mL清液；
(3)在裝有清液的每只離心管中加入聚丙烯酰胺陽離子樹脂的助凝劑，清液中助凝劑的濃度為O. Ippm ;溫度4°C、轉(zhuǎn)速20000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心40分鐘，除去上清液，在沉淀物中加入I. 5mL無菌蒸餾水混勻，得到被測(cè)液，按國(guó)標(biāo)GB 4789. 2-2010對(duì)被測(cè)液進(jìn)行細(xì)菌量計(jì)數(shù)。本發(fā)明的有益技術(shù)效果離心分離法很好地解決了脫水蒜制品中大蒜素抑菌作用對(duì)菌落總數(shù)計(jì)數(shù)的影響，計(jì)數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)方法相比更準(zhǔn)確、有效。本發(fā)明檢測(cè)快速、步驟簡(jiǎn)單，能在3個(gè)小時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)出脫水大蒜一類含抑菌物質(zhì)樣品中的菌落總數(shù)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地說明。實(shí)施例I I材料與儀器 I. I材料
沙門氏菌菌種(5^7^9/76^773)由北京蘭波瑞公司提供,各種培養(yǎng)基由北京路橋公司提供，Ciba系列食用級(jí)聚丙烯酰胺陽離子樹脂，樣品來自安徽東乾食品有限公司送檢樣品留樣；
I.2儀器
臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(BECKMAN 64R)，立式高速冷凍離心機(jī)(BECKMAN J30I )，微量加樣器0. 5 ul IOul, 10 ul IOOul,高壓滅菌鍋。2除菌率實(shí)驗(yàn)
稱取25g脫水蒜制品樣品(輻照滅菌)，人工定量添加一個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?3. 5 X IO8個(gè)/g) 沙門氏菌菌種，加入225mL滅菌稀釋液均質(zhì)，帶濾膜的均質(zhì)袋過濾，濾膜孔徑為330 μ m、直徑50mm ;吸取清液，將I. 5mL清液分裝于2只2mL離心管中，每只離心管中裝有O. 75mL清液；在裝有清液的每只離心管中加入少量聚丙烯酰胺陽離子樹脂作助凝劑，清液中助凝劑的濃度為O. Ippm ;溫度4°C、轉(zhuǎn)速20000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心分離，吸取上清液，按國(guó)標(biāo)GB 4789. 2-2010測(cè)定上清液中殘留細(xì)菌數(shù)。滅菌稀釋液的配置稱取34. Og的磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中，用濃度Imol/ L的175mL氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為7. 2，用蒸餾水稀釋至IOOOmL定容，得母液；取I. 25mL 母液，用蒸餾水稀釋至IOOOmL,溫度121°C高壓滅菌15分鐘，得滅菌稀釋液。表I高速離心法除菌率實(shí)驗(yàn)結(jié)果離心時(shí)間(min.)清液細(xì)菌量除菌率O3. 5X107/204. 3X10598. 77403. 6X10598. 97602. IXlO599. 4808. 9X10499. 751003. 8X10499. 89
由上表I中高速離心分離細(xì)菌效果實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，樣液中菌體經(jīng)過20000轉(zhuǎn)/分鐘、40分鐘以上高速離心后，99%以上的菌體可以從樣液分離?？捎糜诰淇倲?shù)的測(cè)定，完全可以滿足食品衛(wèi)生檢測(cè)的需求。
實(shí)施例2
I材料與儀器與實(shí)施例I相同 2高速離心法用于菌落總數(shù)測(cè)定與傳統(tǒng)方法對(duì)比
取蒜粉樣品25g，加入225mL滅菌稀釋液，均質(zhì)后經(jīng)帶濾膜的均質(zhì)袋過濾，吸取清液，分裝I. 5mL于2只2mL離心管中；在裝有清液的每只離心管中加入少量聚丙烯酰胺陽離子樹脂作為助凝劑，清液中助凝劑的濃度為O. Ippm ;溫度4°C、轉(zhuǎn)速20000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心 40分鐘，除去上清液，在沉淀物中加I. 5mL無菌蒸餾水混勻，按國(guó)標(biāo)GB 4789. 2-2010測(cè)定沉淀物中的細(xì)菌量，同時(shí)使用標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)照；其它條件同實(shí)施例I。表2高速離心法用于菌落總數(shù)測(cè)定與傳統(tǒng)方法結(jié)果比對(duì)
隱度高逢離心法(cfu/g)稱訪法(cfu/g)IO'5多不可計(jì)多不可It1315多不可計(jì)多不可it354110—5137142ioe99I cr14121513
由上表2中可見，從實(shí)際運(yùn)用該方法與標(biāo)準(zhǔn)方法比對(duì)，同時(shí)測(cè)定實(shí)際脫水蒜制品中菌落總數(shù)的結(jié)果可以看出，在1000倍稀釋以下，蒜粉樣液中的抑菌成分的明顯干擾了標(biāo)準(zhǔn)方法的可靠使用，國(guó)標(biāo)方法受到嚴(yán)重干擾，難以準(zhǔn)確判斷。只有稀釋至1000倍以上時(shí)，結(jié)果才可信，而高速離心法很好地解決了這一問題。
權(quán)利要求
1.測(cè)定脫水蒜制品中致病微生物菌落總數(shù)的方法，其特征在于操作步驟如下(1)取蒜粉25g，加入225mL滅菌稀釋液混合均勻，得混合液；(2)將混合液經(jīng)帶濾膜的均質(zhì)袋過濾，所述濾膜孔徑為330μ m、直徑50mm，吸取清液， 將I. 5mL清液分裝于2只2mL離心管中，每只離心管中裝有O. 75mL清液；(3)在裝有清液的每只離心管中加入聚丙烯酰胺陽離子樹脂的助凝劑，清液中助凝劑的濃度為O. Ippm ;溫度4°C、轉(zhuǎn)速20000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心40分鐘，除去上清液，在每只離心管的沉淀物中加入I. 5mL無菌蒸餾水混勻，得到被測(cè)液，按國(guó)標(biāo)GB 4789. 2-2010對(duì)兩只離心管的被測(cè)液分別進(jìn)行細(xì)菌量計(jì)數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的測(cè)定脫水蒜制品中致病微生物菌落總數(shù)的方法，其特征在于所述滅菌稀釋液的配置稱取34. Og的磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中，用濃度lmol/L 的175mL氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為7. 2，用蒸餾水稀釋至IOOOmL定容，得母液；取I. 25mL 母液，用蒸餾水稀釋至IOOOmL,溫度121°C高壓滅菌15分鐘，得滅菌稀釋液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種測(cè)定脫水蒜制品中致病微生物菌落總數(shù)的方法。該方法包括如下操作步驟取蒜粉樣品加入滅菌稀釋液均質(zhì)，經(jīng)帶濾膜的均質(zhì)袋過濾；吸取清液，分裝于2只離心管中；加入聚丙烯酰胺陽離子樹脂作助凝劑，離心分離，除去上清液，在沉淀物中加無菌蒸餾水混勻，按國(guó)標(biāo)GB4789.2-2010對(duì)沉淀物中的細(xì)菌量進(jìn)行計(jì)數(shù)。本發(fā)明檢測(cè)快速、步驟簡(jiǎn)單，能在3個(gè)小時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)出脫水大蒜一類含抑菌物質(zhì)樣品中的菌落總數(shù)。
文檔編號(hào)C12Q1/06GK102586391SQ20121004320
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月29日
發(fā)明者嚴(yán)軼, 余曉峰, 姚劍, 孫娟娟, 宗凱, 李云飛, 鄭海松, 陳雪嬌 申請(qǐng)人:安徽出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心