專利名稱：降解高分子量多環(huán)芳烴的海洋菌液及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于海洋環(huán)境生物修復技術領域，具體涉及基于降解高分子量多環(huán)芳烴細菌間協(xié)同效應的一種復合海洋菌液及其制備方法。
背景技術：
持久性有機污染物(Persistent Organic Pollutants，簡稱POPs)作為一種重要的海洋污染物，可在海洋環(huán)境中持久存在、并通過食物鏈累積、最終對海洋生物及人類健康造成有害影響。而高分子量多環(huán)芳烴(High Molecular Weight-Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,簡稱HMW-PAHs)是其中最常見、最重要的一類POPs，其高毒、持久、生物積累、親脂憎水、難降解的特點使其具有“三致”效應(致癌，致畸，致突變)和遺傳毒性，對海洋生態(tài)環(huán)境及人類健康的危害極大。研究表明，微生物降解是海洋環(huán)境中去除HM-PAHs的主要途徑之一。自20世紀90 年代在美國阿拉斯加溢油事故影響的岸灘成功應用生物修復以來，這種環(huán)境友好型的修復技術越來越引起科學家和各國政府的重視。海洋專性解烴菌(the Obligate Hydrocarbonoclastic Bacteria，簡稱 0HCB) 是海洋環(huán)境中一類非常特殊的微生物，它們具有以下特性一、高比表面積，可適應寡營養(yǎng)的海洋環(huán)境；二、偏好性降解烴類化合物，即以烴類為生長唯一碳源和能源，其中一些菌種甚至不能利用葡萄糖等簡單有機碳源；三、高效廣譜的催化活性，即對多種不同的烴類化合物具有較高的降解率，包括一些典型HM-PAHs。目前已經(jīng)報道的這類細菌包括 Alcanivorax (食燒菌屬)、Cycloclasticus (解環(huán)菌屬)、Marinobacter (海桿菌屬)、 Marinobacterium(海細菌屬)、Neptunomonas、Oleispira(油螺方寵菌屬)、Thalassolituus 等屬的細菌。其中，解環(huán)菌屬細菌是這類細菌中唯一可以降解HMW-PAHs的菌種，研究發(fā)現(xiàn)該細菌與其它菌種間可通過協(xié)同效應進一步提高對HMW-PAHs的降解率。因此，解環(huán)菌屬細菌及其菌群在包括HMW-PAHs在內的POPs污染海洋環(huán)境修復中具有良好的應用前景。但解環(huán)菌屬細菌具有迥異于陸源細菌的生長特性，很難分離到具有高活性的菌株。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種降解高分子量多環(huán)芳烴的海洋菌液及其制備方法，即能夠降解HM-PAHs等PCffs的復合海洋菌液及其制備方法，利用細菌間在降解多環(huán)芳烴過程中的協(xié)同效應，采用2種海洋細菌制備降解HMW-PAHs的復合海洋菌液，以應用于受損海洋環(huán)境的生物修復。本發(fā)明涉及的海洋菌液中的菌種為2株海洋專性解烴菌，其中1株是解環(huán)菌屬細菌 PY97M(Cycloclasticus sp. PY97M)，另外 1 株是海桿菌屬細菌 D15-8W(Marinobacter sp.)；上述2株細菌已分別于2010年11月30日、2011年12月四日保藏至中國普通微生物菌種保藏中心，保藏號分別為CGMCC No. 4339(菌株Cycloclasticus sp. PY97M)、 CGMCCNo. 5669 (菌株 Marinobactersp. D15-8W)。
本發(fā)明另一個方面涉及一種能夠協(xié)同降解HM-PAHs的復合海洋菌液，包括有上述兩株菌的活菌。其中細菌的細胞濃度為IO7 109CFU/mL，制備復合菌液的培養(yǎng)基為乙酸鈉培養(yǎng)基或M8培養(yǎng)基。其中，乙酸鈉培養(yǎng)基每升含22. 79g NaCl, 11. 18g MgCl2 · 6H20，3. 98g Na2SO4,
1.46gCaCl2 ‘ 2H20, 1. 30g TAPS0,0. 72g KC1,0. 27g NH4Cl, 89. OOmg Na2HPO4 · 7H20， 83. OOmgNaBr, 31. OOmg NaHCO3, 27. OOmg H3BO3, 24. OOmg SrCl2 · 6H20，2. 60mg NaF,
2.OOmgFeCl2 · 4H20, 2g 乙酸鈉，ρΗ7· 6 ；用于菌株 ΡΥ97Μ 的培養(yǎng)。Μ8 培養(yǎng)基每升含 22.79g NaCl, 11. 18g MgCl2 · 6H20，3. 98g Na2SO4,
1.46gCaCl2 ‘ 2H20, 1. 30g TAPS0,0. 72g KC1,0. 27g NH4Cl, 89. OOmg Na2HPO4 · 7H20， 83. OOmgNaBr, 31. OOmg NaHCO3, 27. OOmg H3BO3, 24. OOmg SrCl2 · 6H20，2. 60mg NaF,
2.OOmgFeCl2 · 4H20, 2g乙酸鈉，0. 5g蛋白胨，0. 5g酵母提取物，0. 5g馬鈴薯浸出粉，0. 2g葡萄糖，0. 2g蔗糖，0. 05g蘋果酸鈉，0. 05g檸檬酸三鈉，0. 05g酒石酸鉀鈉，ρΗ7· 8 ；用于菌株 D15-8W的培養(yǎng)。本發(fā)明的復合菌液用于降解HM-PAHs。本發(fā)明的復合海洋菌液適合于較低環(huán)境溫度的HM-PAHs污染生物降解，并且其降解速率較快，在3周后即可降解83. 03%初始濃度為20mg/L的熒蒽或75. 50%初始濃度為 20mg/L的芘；該復合海洋菌液比單一降解菌菌液具有更高的HM-PAHs降解率。


圖1為本發(fā)明以GC-MS測定熒蒽降解率比較示意圖。圖2為本發(fā)明以GC-MS測定芘降解率比較示意圖。其中NC，不接種的陰性對照處理；PY97M、D15-8W，分別為單一菌株培養(yǎng)液。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明的方法進行詳細的描述。一、菌株的信息本發(fā)明涉及的海洋菌液中的菌種為2株海洋專性解烴菌，其中1株是解環(huán)菌屬細菌(Cycloclasticus sp. PY97M)，另外 1 株是海桿菌屬細菌(Marinobacter sp. D15-8W)；上述2株細菌已分別于2010年11月30日、2012年12月四日保藏至中國普通微生物菌種保藏中心，保藏號分別為 CGMCC No. 4339(菌株 Cycloclasticus sp. PY97M)、CGMCC No. 5669 (菌 ^ Marinobacter sp. D15-8W)。1、菌株分離的地理位置信息菌株PY97M分離自中國黃海沉積物(經(jīng)緯度為36.6661N 121. 9943E)；菌株 D15-8W分離自中國南海沉積物(經(jīng)緯度為19. 9770N 111.4210E)。2、菌株的分離過程在IOOmL含有菲的海水培養(yǎng)基(菲濃度為0. 2g/L)中加入2g沉積物樣品，在25°C、 150r/min、避光的條件下?lián)u床培養(yǎng)1個月；然后將該培養(yǎng)物在相同培養(yǎng)基中連續(xù)轉接2次， 各培養(yǎng)2周。將第2次轉接的培養(yǎng)物按照10倍系列用無菌海水進行梯度稀釋，并且將合適的連續(xù)3個梯度涂布于M8培養(yǎng)基平板，于25°C倒置培養(yǎng)。將所有不同形態(tài)特征的單菌落用無菌牙簽挑取并劃線到新鮮的M8平板。重復劃線1 2次以獲得細菌純培養(yǎng)。用牙簽挑取純培養(yǎng)單菌落接種到M8液體培養(yǎng)基于25°C過夜培養(yǎng)，獲得菌株PY97M及D15-8W的對數(shù)生長后期培養(yǎng)物。3、菌株的生理生化性質菌株D15-8W為革蘭氏陰性細菌，接觸酶陽性，氧化酶陽性。其溫度生長范圍為 20°C 35°C (最適為20°C )，NaCl濃度生長范圍是0% 15% (最適為0. 5% )，pH生長范圍為PH5.5 pH9. 5(最適為pH5.5)。該菌株可以利用正構烷烴(Ei烷、正十四烷、 正十六烷、正十七烷、正十八烷、正十九烷、正二十烷、正二十二烷、正二十四烷)作為生長碳源；還可以降解多環(huán)芳烴(萘、聯(lián)苯、苊、芴、氧芴、菲、蒽、二苯并噻吩)，但不能利用2-甲基萘、芘、熒蒽作為生長碳源。菌株PY97M為革蘭氏陰性細菌。能夠降解包括萘、2-甲基萘、2，6_ 二甲基萘、聯(lián)苯、菲、芘、熒蒽在內的至少 種PAHs。采用GC-MS測定了對典型PAHs菲的降解率，發(fā)現(xiàn)它對初始濃度為0. 2g/L的菲在IOd后的降解率可達到99%。二、上述的兩株菌用于制備復合海洋菌液實施例1 協(xié)同降解HMW-PAHs的復合海洋菌液的制備步驟(1)制備種子液配制乙酸鈉培養(yǎng)基200mL用于菌株PY97M的培養(yǎng)，配制M8培養(yǎng)基200mL用于菌株D15-8W的培養(yǎng)。將超低溫保藏的凍存菌種取200 μ L分別接入上述兩種培養(yǎng)基，即菌株 ΡΥ97Μ接種到200mL乙酸鈉培養(yǎng)基，菌株D15-8W接種到200mL M8培養(yǎng)基，在25°C、150rpm、 避光的條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長后期，首先活化菌種。配制乙酸鈉培養(yǎng)基IOL用于菌株PY97M的培養(yǎng)，配制M8培養(yǎng)基IOL用于菌株 D15-8W的培養(yǎng)。將活化菌種按照2%的接種量分別接入上述兩種培養(yǎng)基，即菌株PY97M接種到IOL乙酸鈉培養(yǎng)基，菌株D15-8W接種到IOL M8培養(yǎng)基，在25°C、150rpm、避光的條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長后期，制備種子液。(2)菌液發(fā)酵培養(yǎng)配制乙酸鈉培養(yǎng)基200L用于菌株PY97M的發(fā)酵罐培養(yǎng)，配制M8培養(yǎng)基200L用于菌株D15-8W的發(fā)酵罐培養(yǎng)；將種子液按照5%的接種量分別接入乙酸鈉培養(yǎng)基或M8培養(yǎng)基，即菌株PY97M的種子液接種到200L乙酸鈉培養(yǎng)基，菌株D15-8W的種子液接種到200L M8培養(yǎng)基。其發(fā)酵條件為通氣量0.30m3/h，槳葉攪拌速度150rpm，發(fā)酵溫度25°C。在消泡電極的控制下采取流加豆油的方式消泡，提高菌體發(fā)酵產(chǎn)率，停止發(fā)酵時細胞密度為IO8 109CFU/mLo(3)將下罐后的2株海洋細菌的培養(yǎng)液均勻混合，以制備約400L降解HMW-PAHs 復合海洋菌液；復合海洋菌液中解環(huán)菌PY97M，海桿菌D15-8W的細胞密度各自為IO7 109CFU/mL。用大容量4°C低溫離心機在SOOOrpm、15min的條件下離心以制備5倍濃縮的降解HM-PAHs的復合海洋菌液濃縮液，便于運輸和使用。(4)將上述復合海洋菌液濃縮液置于4°C保藏。本發(fā)明涉及的HM-PAHs降解效果的檢驗方法為(1)配制 HM-PAHs 降解效果檢驗培養(yǎng)基每升含 22. 79g NaCl，11. 18gMgCl2 ·6Η20，3. 98g Na2SO4, 1. 46g CaCl2 ‘ 2H20, 1. 30g TAPS0,0. 72gKCl,0. 27gNH4Cl,89. OOmg Na2HPO4 · 7H20，83. OOmg NaBr, 31. OOmg NaHCO3, 27. OOmg H3BO3, 24. OOmgSrCl2 · 6H20, 2. 60mg NaF，2. OOmg FeCl2 · 4H20, 20mg 熒蒽或芘，ρΗ7· 6。(2) HM-PAHs降解實驗將單一降解菌PY97M、D15_8W的菌液及海洋菌液均按照2% 的比例分別接到IOOmL含有熒蒽或芘的培養(yǎng)基中；不接種微生物的處理作為陰性對照；上述每種處理設3個重復。在150rpm、20°C、避光的條件下培養(yǎng)3周。采用GC-MS分析比較單一降解菌培養(yǎng)液和海洋菌液對HM-PAHs的降解率。(3)樣品前處理將降解后的樣品及陰性對照在IOOOOrpm的條件下離心IOmin去除細菌細胞，準確量取50mL正己烷萃取其中的殘余HM-PAHs。從正己烷相準確量取2mL溶液，先用無水Na2SO4脫水，再用0. 22 μ m耐有機溶劑濾膜過濾，最后移入GC樣品瓶中并定容，用于GC-MS對降解后殘留的HMW-PAHs進行分析測定。(4)氣相色譜(Agilent HP7890Plus)；質譜檢測器(Agilent HP5975)；色譜柱為 HP-5MS(30mX0. 25mmX0. 25 μ m)毛細管柱；進樣口溫度280°C ；離子源溫度230°C。載氣為氦氣(99. 999% )，流速lmL/min。程序升溫70°C保持Omin，以20°C /min升至150°C， 150°C保持2min，以7°C /min升至300°C，300°C保持anin。掃描模式SIM模式；選擇離子 m/z 202。進樣HP7683自動進樣器，不分流進樣1 μ L。數(shù)據(jù)采集和處理ΗΡ3365化學工作站。本發(fā)明的實驗結果如下采用GC-MS法測定了生物降解后培養(yǎng)基中熒蒽或芘的殘留量，并分別計算其降解率。如圖1所示，復合海洋菌液的處理相對于降解菌ΡΥ97Μ菌液、D15-8W菌液的處理具有更高的熒蒽降解率，它們對熒蒽的降解率分別為83. 03%,65. 21%和3. 09%。如圖2所示， 復合海洋菌液的處理相對于降解菌ΡΥ97Μ菌液、D15-8W菌液的處理具有更高的芘降解率， 它們對芘的降解率分別為75. 50%,63. 43%和6. 50%。綜上所述，本發(fā)明的協(xié)同降解HM-PAHs的復合海洋菌液特別用于對包括HM-PAHs 在內的POPs污染的海岸線或灘涂地帶進行生物修復。實施例2 2010年7月16日，大連新港碼頭油庫發(fā)生爆炸事故，從油罐中泄露的大量原油造成了至少50平方公里海域的污染。事故發(fā)生后，盡管海上清污工作已在兩個星期內基本完成，但部分岸灘油污仍無法徹底清除，給當?shù)睾Ｑ笊鷳B(tài)環(huán)境造成嚴重危害。對溢油樣品的氣相色譜分析也發(fā)現(xiàn)岸灘上的原油雖然已開始風化，但分子量較大組分的風化程度較低，特別是其中有致癌作用的HM-PAHs仍未明顯降解。對于一些HM-PAHs含量較高的原油，需要添加本發(fā)明專利中所描述的具有高效 HM-PAHs降解能力的復合降解菌液才能夠加快其生物降解過程，減少生態(tài)毒性。具體實施流程如下(1)制備種子液配制乙酸鈉培養(yǎng)基200mL用于菌株PY97M的培養(yǎng)，配制M8培養(yǎng)基200mL用于菌株D15-8W的培養(yǎng)。將超低溫保藏的凍存菌種取200 μ L分別接入上述兩種培養(yǎng)基，即菌株 ΡΥ97Μ接種到200mL乙酸鈉培養(yǎng)基，菌株D15-8W接種到200mL M8培養(yǎng)基，在25°C、150rpm、 避光的條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長后期，首先活化菌種。
配制乙酸鈉培養(yǎng)基IOL用于菌株PY97M的培養(yǎng)，配制M8培養(yǎng)基IOL用于菌株 D15-8W的培養(yǎng)。將活化菌種按照2%的接種量分別接入上述兩種培養(yǎng)基，即菌株PY97M接種到IOL乙酸鈉培養(yǎng)基，菌株D15-8W接種到IOL M8培養(yǎng)基，在25°C、150rpm、避光的條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長后期，制備種子液。(2)菌液發(fā)酵培養(yǎng)配制乙酸鈉培養(yǎng)基200L用于菌株PY97M的發(fā)酵罐培養(yǎng)，配制M8培養(yǎng)基200L用于菌株D15-8W的發(fā)酵罐培養(yǎng)；將種子液按照5%的接種量分別接入乙酸鈉培養(yǎng)基或M8培養(yǎng)基，即菌株PY97M的種子液接種到200L乙酸鈉培養(yǎng)基，菌株D15-8W的種子液接種到200L M8培養(yǎng)基。其發(fā)酵條件為通氣量0.30m3/h，槳葉攪拌速度150rpm，發(fā)酵溫度25°C。在消泡電極的控制下采取流加豆油的方式消泡，提高菌體發(fā)酵產(chǎn)率，停止發(fā)酵時細胞密度為IO8 109CFU/mLo(3)將下罐后的2株海洋細菌的培養(yǎng)液均勻混合，以制備約400L降解HMW-PAHs 復合海洋菌液；復合海洋菌液中解環(huán)菌PY97M，海桿菌D15-8W的細胞密度各自為IO7 109CFU/mL。用大容量4°C低溫離心機在SOOOrpm、15min的條件下離心以制備5倍濃縮的降解HMW-PAHs的復合海洋菌液濃縮液80L，便于運輸和使用。(4)將上述復合海洋菌液濃縮液置于4°C保藏。(5)噴灑復蘇菌粉溶液及營養(yǎng)鹽在大連灣內一處溢油污染礫石質岸灘(其周邊海域為養(yǎng)殖區(qū)，禁止使用化學消油劑)開展生物修復工作，現(xiàn)場實驗區(qū)域約為IOOm2 (平均每m2溢油污染岸灘噴灑2L IOL 復合海洋菌液)。每天退潮后，將復合海洋菌液用噴霧器噴灑到岸灘潮間帶及潮上帶的油污礫石表面，然后用噴壺將含有氮、磷的營養(yǎng)鹽溶液噴灑到相同區(qū)域，并施用一定劑量的緩釋肥。生物修復處理的周期為2個月，頻率為第一個月每周一次，第二個月每兩周一次，每次連續(xù)噴灑2天。(6)采樣及生物修復效果評價需采集岸灘礫石樣品進行GC-MS分析以判定生物修復效果。采樣在每次生物修復處理后進行。取岸灘礫石樣品，使用錫箔紙包裹，低溫保存。樣品經(jīng)前處理后，萃取礫石樣品中的殘留油污，用GC-MS測定生物修復過程中HMW-PAHs等石油烴組分隨時間的變化情況，對復合海洋菌液的生物修復效果進行評價。經(jīng)連續(xù)2個月的生物修復處理后，復合海洋菌液的處理相對于自然風化處理對芘、熒蒽等HMW-PAHs的降解率預計可以提高20. 00% 60. 00%。結果表明本發(fā)明篩選的菌株和復合菌液具有很好的降解HMW-PAHs的功效。
權利要求
1.一株解環(huán)菌屬細菌Cycloclasticus sp.，其保藏編號為CGMCC No. 4339。
2.一株海桿菌屬細菌Marinobacter sp.，其保藏編號為CGMCC No. 5669。
3.一種復合菌液，包括有權利要求1和權利要求2所述菌株的活菌。
4.如權利要求3所述的復合菌液，其特征在于所述菌的細胞濃度為IO7 109CFU/mL。
5.權利要求3所述的復合菌液，其特征在于，制備該菌液所用的培養(yǎng)基為乙酸鈉培養(yǎng)基或M8培養(yǎng)基。
6.如權利要求5所述的復合菌液，其特征在于，所述的乙酸鈉培養(yǎng)基每升含如下組分 22. 79g NaCl, 11. 18g MgCl2 ·6Η20，3· 98g Na2SO4,1. 46g CaCl2 ·2Η20，1. 30gTAPS0，0. 72gKCl，0.27g NH4Cl, 89. OOmg Na2HPO4 ‘ 7H20,83. OOmg NaBr, 31. OOmg NaHCO3, 27. OOmg H3BO3, 24. OOmg SrCl2 · 6H20, 2. 60mg NaF, 2. OOmgFeCl2 · 4H20，2g 乙酸鈉，ρΗ7· 6。
7.如權利要求5所述的復合菌液，其特征在于，所述的Μ8培養(yǎng)基每升含如下組分 22. 79g NaCl, 11. 18g MgCl2 ·6Η20，3· 98g Na2SO4,1. 46g CaCl2 ·2Η20，1. 30gTAPS0，0. 72gKCl，0.27g NH4Cl, 89. OOmg Na2HPO4 ‘ 7H20,83. OOmg NaBr, 31. OOmg NaHCO3, 27. OOmg H3BO3, 24. OOmg SrCl2 · 6H20, 2. 60mg NaF, 2. OOmgFeCl2 · 4H20，2g 乙酸鈉，0. 5g 蛋白胨，0. 5g 酵母提取物，0. 5g馬鈴薯浸出粉，0. 2g葡萄糖，0. 2g蔗糖，0. 05g蘋果酸鈉，0. 05g檸檬酸三鈉， 0. 05g酒石酸鉀鈉，pH7. 8。
8.權利要求3所述的復合菌液用于降解高分子量多環(huán)芳烴。
9.如權利要求8所述的降解高分子量多環(huán)芳烴，是對海岸線或灘涂地帶的高分子量多環(huán)芳烴進行降解。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種協(xié)同降解高分子量多環(huán)芳烴HMW-PAHs的復合海洋菌液及其制備方法。該復合海洋菌液由一株解環(huán)菌PY97M和一株海桿菌D15-8W的發(fā)酵培養(yǎng)液混合而成，細胞濃度均為107～109CFU/mL。制備方法是將解環(huán)菌和海桿菌的種子液分別接入乙酸鈉培養(yǎng)基或M8培養(yǎng)基，流加消泡劑消泡的條件下發(fā)酵培養(yǎng)，再將各發(fā)酵培養(yǎng)液混合即制得復合海洋菌液，再離心制成5倍濃縮液后于4℃保藏。該復合海洋菌液適合于較低環(huán)境溫度的HMW-PAHs污染生物降解，比單一降解菌的菌液具有更高的降解率，具有明顯的協(xié)同降解效應。本發(fā)明的復合海洋菌液應用于對包括HMW-PAHs在內的POPs污染的海岸線或灘涂的生物修復。
文檔編號C12R1/01GK102533615SQ201210038958
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月20日 優(yōu)先權日2012年2月20日
發(fā)明者崔志松, 李倩, 許光素, 鄭立, 陳發(fā)榮, 高偉 申請人:國家海洋局第一海洋研究所