專利名稱：一種回收片狀載體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種回收片狀載體的方法。
背景技術(shù)：
片狀載體，例如，美國(guó)NBS公司生產(chǎn)的Fibra disk載體，臺(tái)灣賽宇潮汐式反應(yīng)器應(yīng)用的紙片載體，杭州安普公司激流式反應(yīng)器應(yīng)用的紙片載體，山東省濱州貝爾凱瑞生物工程有限公司生產(chǎn)的Cephodisk載體等。片狀載體多為圓片狀、小平行四邊形、“N”形等，采用聚酯纖維、納米合成纖維等纖維材料制成，其內(nèi)部具有網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，這些網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成片狀載體的親水性三維多孔隙，可以為細(xì)胞生長(zhǎng)提供很高的比表面積(如IgFibra disk載體可提供1200cm2的生長(zhǎng)面積)，增強(qiáng)細(xì)胞的貼附能力，促進(jìn)細(xì)胞快速擴(kuò)增。正因?yàn)槿绱?，在?xì)胞反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的工藝中，片狀載體的應(yīng)用已非常普遍。在大規(guī)模細(xì)胞發(fā)酵過(guò)程中，片狀載體的使用量會(huì)隨著細(xì)胞反應(yīng)器規(guī)模的增大而增加，因而在細(xì)胞反應(yīng)器發(fā)酵過(guò)程中占據(jù)了主要的成本。而片狀載體是一次性耗材，且價(jià)格又非常昂貴，導(dǎo)致細(xì)胞反應(yīng)器發(fā)酵的成本非常高，例如，美國(guó)NBS公司的籃式反應(yīng)器，5L反應(yīng)器需添加片狀載體150g，40L反應(yīng)器需添加片狀載體1200g，使用量很大，而其市場(chǎng)價(jià)格在 5(Γ60元人民幣/g左右。片狀載體作為一種昂貴的一次性耗材，在該種細(xì)胞反應(yīng)器發(fā)酵過(guò)程中占據(jù)了主要的成本,因而,細(xì)胞發(fā)酵的生產(chǎn)成本較高。不僅如此,若將大量的片狀載體隨意丟棄堆放，易對(duì)環(huán)境造成污染，增加環(huán)境壓力。而片狀載體經(jīng)使用后，細(xì)胞碎片與蛋白雜質(zhì)殘留在在片狀載體三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)部，貼附在纖維束上，難以分離，因而難以清洗干凈，若不經(jīng)謹(jǐn)慎處理將其循環(huán)利用，極易對(duì)新的細(xì)胞生長(zhǎng)造成不利影響，造成生長(zhǎng)狀態(tài)不佳，甚至死亡，進(jìn)而降低目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量，故目前行業(yè)內(nèi)少有人對(duì)片狀載體進(jìn)行二次使用。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的提供一種回收片狀載體的方法，該方法簡(jiǎn)單易行，回收成本低廉，且對(duì)環(huán)境保護(hù)有積極作用。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種回收片狀載體的方法，其包括以下步驟
(1)純水清洗用溫?zé)峒兯菁?xì)胞發(fā)酵結(jié)束后所取出的片狀載體，然后清洗，直至清洗片狀載體的純水用肉眼觀察為無(wú)色且無(wú)雜質(zhì)，浙干；
(2)堿液浸泡經(jīng)步驟(I)處理后的片狀載體置于堿液中浸泡，然后用純水清洗至清洗后倒出的水無(wú)肉眼可見雜質(zhì)，浙干；
(3)胰蛋白酶溶液消化經(jīng)步驟(2)處理后的片狀載體置于胰蛋白酶溶液中浸泡消化，然后再用純水清洗至清洗后倒出的水中無(wú)肉眼可見雜質(zhì)，浙干；
(4)酸液浸泡步驟(3)處理后的片狀載體置于酸性溶液中浸泡以恢復(fù)其功能性，然后用超純水清洗干凈，至PH值為中性，清洗后倒出的水中無(wú)肉眼可見雜質(zhì)，浙干；
(5)干燥對(duì)步驟(4)處理后的片狀載體進(jìn)行干燥處理，去除水分使之干燥。本發(fā)明先用溫?zé)峒兯フ掣皆谄瑺钶d體上大部分的細(xì)胞碎片與可溶于水的蛋白雜質(zhì)，因?yàn)闇責(zé)崴鄬?duì)冷水更容易將細(xì)胞碎片與蛋白雜質(zhì)從載體上清洗下來(lái)；然后用堿液浸泡，使殘留的蛋白變性、溶解；而堿液沒有除去的剩余的小部分細(xì)胞碎片與蛋白雜質(zhì)通過(guò)胰蛋白酶的消化作用除去。而后，再用酸性溶液浸泡所述片狀載體材料以恢復(fù)其功能性， 使其再次使用時(shí)利于細(xì)胞貼附，此外酸液浸泡也有再次去除片狀載體中雜質(zhì)的作用，以盡可能將載體中的雜質(zhì)去除干凈。本發(fā)明推薦的實(shí)施方式是所述的步驟(I)中片狀載體在熱純水中的浸泡時(shí)間可以是1(Γ20分鐘，所述的清洗可以采用反復(fù)輕柔搓洗的方式，直至浸泡片狀載體的純水用肉眼觀察為無(wú)色且無(wú)雜質(zhì)。本發(fā)明所述步驟(I)中浸泡片狀載體的溫?zé)峒兯畱?yīng)沒過(guò)所有片狀載體為佳，所述溫?zé)峒兯畠?yōu)選采用4(Γ60 V純水即可,該溫度范圍的純水不僅容易將細(xì)胞碎片與蛋白雜質(zhì)從載體上清洗下來(lái)，而且溫度溫和適中不劇烈，便于操作人員手動(dòng)處理。本發(fā)明所述步驟(2)浸泡時(shí)堿液應(yīng)沒過(guò)所有片狀載體為佳。優(yōu)選地，所述的堿液與片狀載體比例為l(T20ml/g，既可以完全浸泡載體，還不會(huì)造成堿液的浪費(fèi)。由于堿液濃度過(guò)低，浸泡達(dá)不到去除載體中雜質(zhì)的目的，濃度過(guò)高，會(huì)對(duì)載體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)造成不必要的破壞，因此，所述的堿液采用優(yōu)選濃度為O. Γ0. 5mol/L的分析純氫氧化鈉(NaOH)溶液或分析純氫氧化鉀(KOH)溶液，能夠在達(dá)到最大程度去除載體中雜質(zhì)的同時(shí)，又保證載體內(nèi)部結(jié)構(gòu)的完整性。本發(fā)明更優(yōu)選O. 4^0. 5mol/L的分析純氫氧化鈉或分析純氫氧化鉀。本發(fā)明所述步驟(2)中堿液浸泡應(yīng)盡可能使片狀載體中的殘留的蛋白變性及溶解，本發(fā)明中堿液浸泡時(shí)間優(yōu)選O. 5 4h，在此時(shí)間范圍內(nèi)已能使載體中殘留的蛋白變性，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，堿液浸泡的效果已無(wú)實(shí)際意義，且會(huì)延長(zhǎng)處理時(shí)間，不利于提高處理效率。胰蛋白酶溶液消化的最佳PH值在7到8之間，此時(shí)消化力較強(qiáng)，故作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(2)中，可以對(duì)經(jīng)過(guò)堿液處理后的片狀載體用清水清洗至呈弱堿性，這樣可以利于步驟(3)中胰蛋白酶消化。本發(fā)明所述步驟(3)的胰蛋白酶溶液的用量應(yīng)以沒過(guò)所有片狀載體為佳，所述胰蛋白酶溶液與片狀載體間的比例優(yōu)選在l(T20ml/g范圍內(nèi)，既可以使片狀載體完全浸泡在胰蛋白酶溶液中，而且不會(huì)造成胰蛋白酶溶液的浪費(fèi)，有利于節(jié)約載體回收成本。本發(fā)明所述步驟(3)中胰蛋白酶溶液浸泡應(yīng)盡可能將堿液沒有除去的剩余的小部分細(xì)胞碎片與蛋白雜質(zhì)消化作用除去。而本發(fā)明中所述的胰蛋白酶溶液浸泡時(shí)間優(yōu)選 O. 5 2h，在該時(shí)間范圍內(nèi)胰蛋白酶已能充分消化貼附在載體中的殘余蛋白雜質(zhì)。本發(fā)明所述步驟(3)的胰蛋白酶溶液的濃度應(yīng)以能將片狀載體中的細(xì)胞碎片與蛋白雜質(zhì)消化完全為佳。本發(fā)明的胰蛋白酶溶液的質(zhì)量體積濃度優(yōu)選在O. 0259Γ0. 25% 范圍內(nèi)可以達(dá)到消化雜質(zhì)蛋白的效果，又不造成胰蛋白酶的浪費(fèi)，其具體配方為
O.025 O. 25g胰蛋白酶，IOOml PBS溶液。本發(fā)明所述步驟(3)的胰蛋白酶溶液的質(zhì)量體積濃度更優(yōu)選在O. 159ΓΟ. 25%范圍內(nèi)，可以達(dá)到消化雜質(zhì)蛋白的最佳效果，同時(shí)不造成胰蛋白酶的富余浪費(fèi)。而胰蛋白酶液最佳的消化條件是37 38°C，因而，所述步驟(3)中的消化溫度可以控制在37 38°C范圍內(nèi)。
本發(fā)明所述步驟(4)的酸性溶液的用量應(yīng)以沒過(guò)所有片狀載體為佳，優(yōu)選地，所述的酸性溶液與片狀載體間的比例在l(T20ml/g范圍內(nèi)，不僅可以使片狀載體完全浸泡在酸性溶液中，而且不會(huì)造成酸性溶液的浪費(fèi),有利于節(jié)約載體回收成本。酸性溶液濃度過(guò)低，不利于片狀載體的功能性恢復(fù)，濃度過(guò)高則對(duì)片狀載體的功能性恢復(fù)起反作用，因此，所述步驟(4)的酸性溶液的PH范圍優(yōu)選為(Γ5，可以采用 O. Γ0. 5mol/L鹽酸溶液，優(yōu)選O. 3^0. 4mol/L的鹽酸溶液，另外采用上述濃度的酸性溶液還可對(duì)經(jīng)過(guò)步驟(2)和(3)處理后繼續(xù)殘留在片狀載體中的極少量蛋白雜質(zhì)起到再次清除的作用。本發(fā)明所述步驟(4)中酸性溶液浸泡應(yīng)充分恢復(fù)片狀載體功能性，浸泡時(shí)間過(guò)短，載體的功能性恢復(fù)不完全，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)增長(zhǎng)回收的時(shí)間，因此，所述步驟(4)中酸性溶液浸泡時(shí)間優(yōu)選是O. 5 lh。本發(fā)明所述步驟(5)的干燥溫度不宜過(guò)高，應(yīng)控制在能干燥片狀載體又不破壞片狀載體的材質(zhì)和結(jié)構(gòu)的范圍內(nèi)，避免片狀載體的材質(zhì)和結(jié)構(gòu)因干燥高溫而破壞。本發(fā)明的干燥溫度優(yōu)選控制在4(T50°C范圍內(nèi)，干燥時(shí)間優(yōu)選在8 10小時(shí)范圍內(nèi)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
I.本發(fā)明提供的方法簡(jiǎn)單易行，回收成本低廉，且在處理的過(guò)程中，堿性溶液、酸性溶液的濃度以及干燥溫度適中，不易對(duì)片狀載體的材質(zhì)和結(jié)構(gòu)造成破壞，可使片狀載體的回收率達(dá)到100%，可重復(fù)利用4至5次以上，回收后的應(yīng)用效率可達(dá)到回收前應(yīng)用效果的90% 以上。2.經(jīng)本發(fā)明回收的片狀載體在重新使用前最好再用較多的細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)的超純水侵泡I小時(shí)以上，若和新片狀載體混合使用，效果會(huì)更加理想。3.本發(fā)明的方法回收的片狀載體可以二次利用，不僅降低了細(xì)胞發(fā)酵的生產(chǎn)成本，而且減少了丟棄的片狀載體的堆積，減少環(huán)境污染緩解環(huán)境壓力，因此本發(fā)明對(duì)環(huán)境保護(hù)就有積極作用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一回收NBS公司Fibra disk載體
(I)純水清洗上一批次細(xì)胞發(fā)酵結(jié)束后，從細(xì)胞反應(yīng)器中取出片狀載體，用40°C的溫?zé)峒兯?0分鐘后，反復(fù)輕柔的搓洗片狀載體，中間不斷換水，直至浸泡片狀載體的純水用肉眼觀察為無(wú)色，看不到雜質(zhì)，用漏盆浙干。(2)堿液浸泡用純水和分析純NaOH配制O. 5mol/L的NaOH (分析純)溶液，將經(jīng)步驟(I)處理并浙干后的片狀載體按比例10ml/g的比例浸入該NaOH (分析純)溶液中，浸泡I小時(shí)后用純水反復(fù)清洗，用PH試紙測(cè)定為至弱堿性為止，用漏盆浙干。(3)胰酶消化用O. 25g胰蛋白酶，IOOmlPBS配制濃度為O. 25%的胰蛋白酶溶液，將經(jīng)步驟⑵處理并浙干后的片狀載體按比例10ml/g的比例浸入胰蛋白酶溶液中在 37 38°C下消化2小時(shí)后用純水反復(fù)清洗干凈，用漏盆浙干。(4)酸液浸泡用純水和濃鹽酸配制O. 5mol/L鹽酸溶液，將經(jīng)步驟(3)處理并浙干后的片狀載體按比例10ml/g的比例浸入該鹽酸溶液中，浸泡O. 5小時(shí)后用純水反復(fù)清洗，用PH試紙測(cè)定至PH值在中性附近，再用超純水反復(fù)清洗3到6遍，清洗后倒出的水中無(wú)雜質(zhì)，用漏盆浙干。(5)烘干放入電烘箱內(nèi)在40°C下干燥10小時(shí)，去除片狀載體上的水分，使之干燥。將回收的片狀載體在用較多的細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)的超純水侵泡I小時(shí)以上，然后按以下方法進(jìn)行細(xì)胞發(fā)酵，然后測(cè)試細(xì)胞耗糖量、耗氧量、病毒收獲量、病毒滴度參數(shù)，結(jié)果參見表 I。將新NBS公司Fibra disk片狀載體與本實(shí)施例回收一次的載體進(jìn)行參數(shù)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，其中所用反應(yīng)器型號(hào)為NBS 510型40L反應(yīng)器，添加載體1200g，細(xì)胞株為PK-15細(xì)胞， 接種總量為5*109個(gè)、接毒豬圓環(huán)2型病毒(PCV2)，接毒MOI相同。
表權(quán)利要求
1.一種回收片狀載體的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)純水清洗用溫?zé)峒兯菁?xì)胞發(fā)酵結(jié)束后所取出的片狀載體，然后清洗，直至清洗片狀載體的純水用肉眼觀察為無(wú)色且無(wú)雜質(zhì)，浙干；(2)堿液浸泡經(jīng)步驟(I)處理后的片狀載體置于堿液中浸泡，然后用純水清洗至清洗后倒出的水無(wú)肉眼可見雜質(zhì)，浙干；(3)胰蛋白酶溶液消化經(jīng)步驟(2)處理后的片狀載體置于胰蛋白酶溶液中浸泡消化，然后再用純水清洗至清洗后倒出的水中無(wú)肉眼可見雜質(zhì)，浙干；(4)酸液浸泡步驟(3)處理后的片狀載體置于酸性溶液中浸泡以恢復(fù)其功能，然后用超純水清洗干凈，至PH值為中性，清洗后倒出的水中無(wú)肉眼可見雜質(zhì)，浙干；(5)干燥對(duì)步驟(4)處理后的片狀載體進(jìn)行干燥處理，去除水分使之干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的回收片狀載體的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，對(duì)經(jīng)過(guò)堿液處理后的片狀載體用純水清洗至呈弱堿性。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的回收片狀載體的方法，其特征在于，所述步驟(2)所述的堿液與片狀載體比例為l(T20ml/g ;所述的堿液采用濃度為O. Γ0. 5mol/L的分析純氫氧化鈉溶液或分析純氫氧化鉀溶液；所述堿液浸泡時(shí)間為O. 5 4h。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的回收片狀載體的方法，其特征在于，所述步驟(3)中所述胰蛋白酶溶液與片狀載體間的比例在l(T20ml/g范圍內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的回收片狀載體的方法，其特征在于，所述步驟(3)中胰蛋白酶溶液浸泡時(shí)間為O. 5^2h ;所述的胰蛋白酶溶液的質(zhì)量體積濃度在O. 0259Γ0. 25%范圍內(nèi)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的回收片狀載體的方法，其特征在于，所述步驟(3)的胰蛋白酶溶液的質(zhì)量體積濃度在O. 159ΓΟ. 25%范圍內(nèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的回收片狀載體的方法，其特征在于，所述步驟(4)的酸性溶液與片狀載體間的比例在l(T20ml/g范圍內(nèi)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的回收片狀載體的方法，其特征在于，所述的酸性溶液采用O.Γ0. 5mol/L鹽酸溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的回收片狀載體的方法，其特征在于，所述步驟(4)中酸性溶液浸泡時(shí)間為O. 5 lh。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的回收片狀載體的方法，其特征在于，所述步驟(5)的干燥溫度在4(T50°C范圍內(nèi)，干燥時(shí)間在8 10小時(shí)范圍內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種回收片狀載體的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)用溫?zé)峒兯菁?xì)胞發(fā)酵結(jié)束后所取出的片狀載體，然后清洗；(2)堿液浸泡經(jīng)步驟(1)處理后的片狀載體置于堿液中浸泡，然后清洗；(3)胰蛋白酶溶液消化經(jīng)步驟(2)處理后的片狀載體置于胰蛋白酶溶液中浸泡消化，然后清洗；(4)酸液浸泡步驟(3)處理后的片狀載體置于酸性溶液中浸泡，以恢復(fù)其功能性；(5)干燥對(duì)步驟(4)處理后的片狀載體進(jìn)行干燥處理，去除水分使之干燥。該方法簡(jiǎn)單易行，回收成本低廉，且對(duì)環(huán)境保護(hù)有積極作用。
文檔編號(hào)C12M3/00GK102586107SQ20121003868
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月21日
發(fā)明者羅乃杰, 蔣天華, 趙立民 申請(qǐng)人:廣東溫氏食品集團(tuán)有限公司