專利名稱：一種以改性的環(huán)氧基樹脂為載體的固定化酶及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種固定化酶及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
生物催化反應(yīng)具有條件溫和、選擇性高、反應(yīng)效率高等特點(diǎn)，因而越來越多地應(yīng)用于化學(xué)合成領(lǐng)域。但由于生物酶在體外工業(yè)環(huán)境下的穩(wěn)定性差以及酶制劑的成本過高，極大地限制了生物催化在工業(yè)領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用。固定化酶技術(shù)通過將酶分子束縛(或結(jié)合) 于特殊的相，不僅有效解決了催化劑的重復(fù)使用問題，同時(shí)還可顯著改善生物酶的穩(wěn)定性及催化特性(底物親和力、立體選擇性等)。目前，作為固定化酶技術(shù)的一個(gè)重要分支，高性能酶固定化載體的開發(fā)和應(yīng)用十分活躍。研究內(nèi)容廣泛涉及載體的合成、表征，以及載體的幾何參數(shù)、表面性質(zhì)、表面活性及理化性質(zhì)等對于酶的固載量、酶活回收率和穩(wěn)定性等方面的影響。但有關(guān)載體表面電荷性質(zhì)對酶催化活性及穩(wěn)定性的影響卻鮮有系統(tǒng)的研究。研究表明，不同基質(zhì)的酶固定化載體的表面電荷性質(zhì)(pzc值)不同，導(dǎo)致其表面環(huán)境的PH值產(chǎn)生差異，而過高或過低的pH值不僅會(huì)降低酶的催化效率，同時(shí)也將影響酶分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。因此，在選擇酶固定化載體時(shí)，不僅僅要考慮酶負(fù)載量的大小和連接的牢固性，同時(shí)也需兼顧載體表面電荷性質(zhì)，使其與酶的最適作用條件相匹配。但由于目前缺乏各類載體表面電荷性質(zhì)的相關(guān)數(shù)據(jù)，使得人們在選擇載體時(shí)盲目性較大。環(huán)氧基載體Eupergit C250l是一種常用的酶固定化載體，由單體聚合而成的多孔小球狀樹脂，參與聚合的單體有N，N’_亞甲基-雙丙烯酰胺、烯丙基縮水甘油醚、甲基丙烯酸酯。商品化的Eupergit C250l粒徑分布在100 250 μ m的小球狀顆粒，樹脂上的微孔直徑90 130nm，擔(dān)載量200 μ mol環(huán)氧基團(tuán)/g干樹脂。Eupergit C250l具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，機(jī)械強(qiáng)度高，其pzc值為6. M。目前以Eupergit C250l為載體的酶固定化研究很多，但對各種酶的固定化效果差異巨大(酶活回收率從8% 92%不等)。盡管不排除固定化過程對酶構(gòu)象的機(jī)械性拉伸和扭曲以及對傳質(zhì)的影響，但載體自身電荷環(huán)境對酶分子構(gòu)象以及表觀催化性能的影響也是巨大的。目前，通過在Eupergit C25%表面接枝特定pH緩沖范圍的載體兩性電解質(zhì)，制備具有緩沖性能的功能性載體，并將其用于酶固定化的研究尚未見報(bào)道。y -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ -glutamyltranspeptidase, GGT,最適作用 pH 8. 5 9. 5) 可特異性地將Y-谷氨?；D(zhuǎn)移至受體分子，得到新的含Y-谷氨酰基的化合物，該反應(yīng)成為谷氨酰基化反應(yīng)。通過改變受體種類可獲得不同的谷氨酰化合物。由于該反應(yīng)具有位點(diǎn)特異性和光學(xué)選擇性強(qiáng)、無需對反應(yīng)物進(jìn)行保護(hù)和脫保護(hù)、反應(yīng)過程中也不消耗ATP 等特點(diǎn)，因此利用該反應(yīng)制備系列Y-谷氨?；惢衔锏难芯空诔蔀楣I(yè)生物催化領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前該反應(yīng)已成功地應(yīng)用于一些重要谷氨?；衔锏暮铣?，如Y-L-谷氨酰-L-多巴、谷胱甘肽、Y-D-谷氨酰-L-色氨酸、Y-L-谷氨酰-L-半胱氨酸以及茶氨酸等。但由于GGT在體外環(huán)境下易發(fā)生亞基解聚，引起酶活的不可逆下降，限制了其應(yīng)用范圍的進(jìn)一步拓展。目前，對Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的固定化及穩(wěn)定化研究較少，且以載體兩性電解質(zhì)改性材料為載體的GGT固定化及應(yīng)用均未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種以改性后的環(huán)氧基樹脂為載體的固定化酶，以進(jìn)一步提高Y -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶對環(huán)境PH值的適應(yīng)性，以及酶的穩(wěn)定性和催化活性，降低制備茶氨酸的工藝成本。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述固定化酶的制備方法。本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題是提供上述固定化酶在催化合成茶氨酸中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種以改性的環(huán)氧基樹脂為載體的固定化酶，它包括酶和固定所述酶的改性載體，所述的酶為Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，所述的改性載體為經(jīng)過PH8 10. 5的載體兩性電解質(zhì)改性后的環(huán)氧基樹脂Eupergit C25。l。其中，所述的改性載體按如下方法制備得到將干燥后的環(huán)氧基樹脂Eupergit C250l加入pH8 10. 5的載體兩性電解質(zhì)中，常溫下攪拌反應(yīng)16 20h后，將液體濾出，固體顆粒分別經(jīng)純水反復(fù)淋洗、0. 5mol/L的NaCl溶液反復(fù)淋洗、純水反復(fù)淋洗三道淋洗后烘干即制得改性載體。其中，所述的pH8 10. 5的載體兩性電解質(zhì)為pharmalyte 8-10. 5，液態(tài)，CAS 號為17-0455-01，緩沖范圍為pH 8 10. 5，生產(chǎn)廠商為GE healthcare，原溶液濃度為 0. 36meq/mL。其中，所述的環(huán)氧基樹脂EupergitC25ql為Eupergit C250L，CAS號為 149531-08-8， 生產(chǎn)廠商為FLUKA，EupergitTM C25tlL為N，N’_亞甲基-雙丙烯酰胺、烯丙基縮水甘油醚、甲基丙烯酸酯共聚物，粒徑分布在100 250 μ m的小球狀顆粒，樹脂上的微孔直徑90 130nm， 環(huán)氧基團(tuán)濃度大于等于200 μ mol/g干樹脂。其中，對于每g干重環(huán)氧基樹脂Eupergit C25Ql，載體兩性電解質(zhì)的用量為10 20mLo其中，將pH8 10. 5的載體兩性電解質(zhì)用濃度為50% (ν/ν)以上的ρΗ8 10. 5 的載體兩性電解質(zhì)水溶液替換。其中，所述的烘干條件為真空干燥箱內(nèi)干燥48 72h，干燥溫度不高于40°C。上述以改性的環(huán)氧基樹脂為載體的固定化酶的制備方法，將改性載體加入Y -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶溶液中，于常溫下振蕩反應(yīng)1 證(優(yōu)選2. 5h)，將液體濾出，固體顆粒純水淋洗 3 4次，烘干后即得。其中，所述的γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶溶液的濃度為0. 25 0. 30mg/mL。其中，對于每g干重改性載體，Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶溶液的用量為10 20mL。其中，所述的烘干條件為真空干燥箱內(nèi)干燥48 72h，干燥溫度不高于40°C。上述制備得到的以改性的環(huán)氧基樹脂為載體的固定化酶最終水淋洗吹干后置于冰箱4°C保存，制得的固定化酶具有很好的化學(xué)穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、有很好的機(jī)械操作強(qiáng)度、表面富含-NH2和-C00H，極易與酶分子間形成氫鍵或離子鍵。上述以改性的環(huán)氧基樹脂為載體的固定化酶在催化合成茶氨酸中的應(yīng)用。載體兩性電解質(zhì)Pharmalyte，以下簡稱CL·經(jīng)過pH8 10. 5的載體兩性電解質(zhì)改性后的環(huán)氧基樹脂Eupergit C250l,即改性載體，以下簡稱ECCA。以上述改性的環(huán)氧基樹脂為載體的固定化Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，以下簡稱 ECCA-GGT。有益效果本發(fā)明充分利用環(huán)氧基樹脂Eupergit C250l的良好特性，通過在其表面共價(jià)鍵合緩沖范圍在PH8 10. 5的載體兩性電解質(zhì)制備新載體ECCA，制備得到的ECCA 電荷零點(diǎn)值為9. 1，接近GGT的最適作用pH值，且ECCA載體形狀均一、穩(wěn)定性高、表面富含-COOH和-NH2，為固定化γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶提供了良好的操作條件。以本發(fā)明方法制備的ECCA-GGT形狀均一，酶活力回收率平均達(dá)到19. 22% ；在純水中，固定化酶ECCA-GGT的最大反應(yīng)速度為緩沖體系下的81% 95. 8% ；與游離酶相比， 固定化酶的最適作用PH和溫度略有改變，適用pH和溫度范圍均有一定程度的增大；固定化酶的熱穩(wěn)定性和PH穩(wěn)定性均較游離酶有大幅度提高，且重復(fù)使用性能好。


圖1為ECCA對GGT的吸附-時(shí)間曲線。由于ECCA對GGT的固載是通過物理吸附， 其吸附量與載體的比表面積相關(guān)，且可形成多分子層吸附。因此，載體對酶的平衡吸附量和酶活回收率可達(dá)2. 7mg/g樹脂和19.四％，較Eupergit C250l有較大幅度的提高。圖2為溫度對ECCA-GGT固定化酶和游離酶活力的影響。該圖顯示，固定化酶 ECCA-GGT和游離GGT的最適反應(yīng)溫度均在60°C左右。但ECCA-GGT對溫度的敏感性有所降低，在室溫70C )條件下，ECCA-GGT的相對酶活仍可達(dá)最高酶活的60%以上。圖3為pH值對固定化酶和游離酶活力的影響。該圖顯示，游離酶和固定化酶的最適作用PH值均在9. 0左右。但固定化酶在對pH值變化的敏感性明顯下降，當(dāng)pH值為6. 0 時(shí)，固定化酶的相對酶活仍高達(dá)70%左右，而此時(shí)游離酶的相對酶活僅剩40. 44%。圖4為ECCA-GGT固定化酶在純水(A)和Tris-HCl緩沖體系(pH 8. 0) (B)在的動(dòng)力學(xué)常數(shù)擬合結(jié)果。該圖顯示，固定化酶在純水中的最大反應(yīng)速度(rmax)為0.0236mmol/ L. min，為其在Tris-HCl緩沖液中的116. 5%0圖5為游離酶和ECCA-GGT固定化酶的熱穩(wěn)定性比較。該圖顯示，ECCA-GGT的熱穩(wěn)定性較游離酶有大幅度的提高。圖6為ECCA-GGT的操作穩(wěn)定性。該圖顯示，ECCA-GGT的操作穩(wěn)定性良好。經(jīng)19 個(gè)批次的重復(fù)使用，固定化酶ECCA-GGT的相對酶活仍可達(dá)初始值的50%以上。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。以下實(shí)施例中酶活力檢測方法如下
酶活定義以Y -谷氨酰對硝基苯胺(GpNA)為供體，以雙甘二肽為受體，每分鐘催化GpNA水解生成Iumol對硝基苯胺(pNA)所需的酶量對硝基苯胺(pNA)標(biāo)準(zhǔn)曲線配制不同濃度(1 5mmol/L)的pNA標(biāo)準(zhǔn)溶液，并在 410nm下測定其吸光值，分別以pNA濃度和相應(yīng)的吸光值為橫、豎坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。游離酶酶活測定取酶液50μ 1，加入Tris-HCl，定容置IOmL(酶液稀釋200倍)。 取稀釋后酶液 0. 5mL,加入 0. 5mL GpNA(濃度 5mmol/L)，0. 5mL 雙甘二肽，1. 5mLTris-HCl buffer，總反應(yīng)體系3. OmL。37°C水浴反應(yīng)5 15min。反應(yīng)液于A41tl測定吸光值。固定化酶酶活測定取固定化酶10 30mg，加入0. 5mL GpNA, 0. 5mL雙甘二肽，2. OmLTris-HCl buffer,總反應(yīng)體系3. OmL。37°C水浴反應(yīng)5 lOmin。反應(yīng)液濾出后于A41tl測定吸光值。以下實(shí)施例中酶活回收率計(jì)算方法如下回收率=(固定化酶活力/總投入酶活)X 100%以下實(shí)施例中，Eupergit C250l購自于FLUKA公司，載體兩性電解質(zhì)pharmalyte 8-10. 5購自于GE Healthcare公司，、-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶為自制，所得GGT為電泳純，酶活為8. 12U/mL，蛋白濃度為0. 5mg/mL。實(shí)施例1 :ECCA載體制備。取0. 3g烘干的Eupergit C25ql置于20ml砂芯管內(nèi)，按照固液比lg/20mL加入50% (ν/ν)的CA水溶液，常溫反應(yīng)16h，反應(yīng)結(jié)束后將先將反應(yīng)液體濾出。濾干后的固體顆粒用純水反復(fù)淋洗6 7次；再用0. 5mol/L的NaCl溶液反復(fù)淋洗3 4次；最后再用純水淋洗 6 7次后濾干，于40°C烘干即制得CA修飾的載體ECCA。按質(zhì)量差減法計(jì)算CA的接枝量為 0.0964g。實(shí)施例2 =ECCA載體制備。稱取0. 3g烘干的Eupergit C250l置于20ml砂芯管內(nèi)，按照固液比lg/10mL加入 100% (￥八乂4，241室溫反應(yīng)2011，反應(yīng)結(jié)束后將先將反應(yīng)液體濾出。濾干后的固體顆粒用純水反復(fù)淋洗6 7次；再用0. 5mol/L的NaCl溶液反復(fù)淋洗3 4次；最后再用純水淋洗 6 7次后濾干，于40°C烘干即制得CA修飾的載體ECCA。按質(zhì)量差減法計(jì)算CA的接枝量為 0. 124g。實(shí)施例3 =ECCA-GGT的制備方法。稱取以實(shí)施例2中最優(yōu)選方法制備好的干成品載體ECCA 0. 3g至于安瓿瓶中，按固液比Ig 13. 3mL加入純化后的GGT酶液(酶濃度為0. 3mg/mL)，于常溫下水浴搖床振蕩反應(yīng)lh，反應(yīng)結(jié)束后先將反應(yīng)液體濾出，濾干后的固體顆粒用純水反復(fù)淋洗3 4次，于 30°C烘干即制得ECCA-GGT。GGT吸附量為1. 26mg/g樹脂，酶活回收率為9. 72%。實(shí)施例4 =ECCA-GGT的制備方法。稱取以實(shí)施例2中最優(yōu)選方法制備好的干成品載體ECCA 3.0g至于安瓿瓶中，按固液比Ig 20mL加入純化后的GGT酶液(酶濃度為0. 25mg/mL)，于常溫下水浴搖床振蕩反應(yīng)2. 5h，反應(yīng)結(jié)束后先將反應(yīng)液體濾出，濾干后的固體顆粒用純水反復(fù)淋洗3 4次，于 30°C烘干即制得ECCA-GGT。GGT吸附量為2. 7mg/g樹脂，酶活回收率為19.。實(shí)施例5 =ECCA-GGT的制備方法。稱取以實(shí)施例2中最優(yōu)選方法制備好的干成品載體ECCA 3.0g至于安瓿瓶中，按固液比Ig IOmL加入純化后的GGT酶液(酶濃度為0. 3mg/mL)，于常溫下水浴搖床振蕩反應(yīng)5h，反應(yīng)結(jié)束后先將反應(yīng)液體濾出，濾干后的固體顆粒用純水反復(fù)淋洗3 4次，于30°C 烘干即制得ECCA-GGT。GGT吸附量為2. 68mg/g樹脂，酶活回收率為19. 21 %。實(shí)施例6 =ECCA-GGT催化制備茶氨酸。茶氨酸(Theanine)屬酰胺類化合物，系統(tǒng)命名為N-乙基-γ-L-谷氨酰胺 (N-ethyl-Y-L-glutamine)。以Y -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶為催化劑，L-谷氨酰胺(Gln)和乙胺為底物，可實(shí)現(xiàn)酶法合成茶氨酸。配制Gln和乙胺濃度皆為5mmol/L，加入游離酶GGT，以及按實(shí)施例4方法制備的固定化酶ECCA-GGT，于40°C水浴反應(yīng)，定時(shí)取樣測定產(chǎn)物茶氨酸的濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以本發(fā)明的固定化酶為催化劑，在相同的酶濃度下，經(jīng)反應(yīng)Mh，供體轉(zhuǎn)化率為62. 3% ；以游離酶為催化劑時(shí)，供體轉(zhuǎn)化率僅為34. 1%。該反應(yīng)體系簡單，條件溫和，可實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。實(shí)施例7 緩沖性能比較試驗(yàn)=ECCA-GGT固定化酶在純水和Tris-HCl緩沖體系下的動(dòng)力學(xué)常數(shù)測定。按照上述的最優(yōu)固定化條件制備得到ECCA-GGT，分別在純水和Tris-HCl緩沖 (PH8.0)中測定固定化酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。實(shí)驗(yàn)中固定受體雙甘二肽的濃度為lOOmmol/L，供體GpNA濃度為0. 5 5mmol/L，測定不同GpNA濃度下的GGT反應(yīng)速率。通過單底物米氏方程擬合，得到固定化酶ECCA-GGT在純水和Tris-HCl緩沖體系下的最大反應(yīng)速率分別為 0. 0275mmol/L. min 和 0. 0236mmol/L. min(如圖 4 所示)。純水中 ECCA-GGT 在純水中的最大反應(yīng)速率為緩沖體系下的116. 5%。實(shí)施例8 游離酶和ECCA-GGT固定化酶的最適溫度比較。按照上述的最優(yōu)固定化條件制備得到ECCA-GGT，在不同溫度7 70°C )下分別測定游離酶及固定化酶活力，結(jié)果如圖2所示固定化酶ECCA-GGT和游離GGT的最適反應(yīng)溫度均在60°C左右。但ECCA-GGT對溫度的敏感性有所降低，在室溫7°C )條件下， ECCA-GGT的相對酶活仍可達(dá)最高酶活的60%以上。實(shí)施例9 游離酶、Eupergit C250l-GGT和ECCA-GGT的最適pH值比較。按照上述的最優(yōu)固定化條件制備得到ECCA-GGT。按宋希文等的方法(詳見《現(xiàn)代化工》，2009，29 (增刊2) 147 149)，以未經(jīng)修飾的Eupergit C·為載體，按固液比 1 10加入純化后的GGT，混合物于4°C下振蕩反應(yīng)Mh，濾除殘液后，用10倍于樹脂量(V/ w)的Tris-HCl緩沖液(50mmol/L，pH 8.0)多次洗滌后，制得固定化酶Eupergit C250l-GGTo分別在pH 7 9 (Tris-HCl緩沖)及pHIO 11 (碳酸氫鈉緩沖)的溶液中測定游離酶、Eupergit C250l-GGT和ECCA-GGT的活力，結(jié)果如圖3所示游離酶和固定化酶的最適作用PH值均在9. 0左右。但ECCA-GGT對pH值變化的敏感性明顯下降，當(dāng)pH值為6. 0 時(shí)，ECCA-GG的相對酶活仍高達(dá)70%左右，而此時(shí)游離酶和Eupergit C250l-GGT的相對酶活僅剩40. 44%和17. 9%。表明以CA修飾的Eupergit C250l為載體對GGT進(jìn)行固定化可有效地?cái)U(kuò)大酶的作用PH范圍。實(shí)施例10 =ECCA-GGT固定化酶熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。取一定量的游離GGT和ECCA-GGT分別在不同溫度下(30 50°C )保溫，每隔一定時(shí)間取樣測定GGT酶活，以0時(shí)刻的GGT活性為100%，計(jì)算相對酶活A(yù)r。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， ECCA-GGT的熱穩(wěn)定性較游離酶有較大幅度的上升(圖5A和5B)。經(jīng)擬合，ECCA-GGT的熱失活反應(yīng)活化能為& = 125. 4KJ/mol，較游離酶( = 49. 8KJ/mol)有大幅度提高。
實(shí)施例11 =ECCA-GGT使用穩(wěn)定性試驗(yàn)。稱取18. Img的ECCA-GGT，于4°C下貯藏，定期測定酶活，固定化酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性測試，結(jié)果如圖6所示=ECCA-GGT的操作穩(wěn)定性良好。經(jīng)19個(gè)批次的重復(fù)使用，固定化酶 ECCA-GGT的相對酶活仍可達(dá)初始值的50%以上。
權(quán)利要求
1.一種以改性的環(huán)氧基樹脂為載體的固定化酶，其特征在于，它包括酶和固定所述酶的改性載體，所述的酶為Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，所述的改性載體為經(jīng)過PH8 10. 5的載體兩性電解質(zhì)改性后的環(huán)氧基樹脂Eupergit C25。l。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以改性的環(huán)氧基樹脂為載體的固定化酶，其特征在于，所述的改性載體按如下方法制備得到將干燥后的環(huán)氧基樹脂Eupergit C250l加入pH8 10. 5 的載體兩性電解質(zhì)中，常溫下攪拌反應(yīng)16 20h后，將液體濾出，固體顆粒分別經(jīng)純水、 0. 5mol/L的NaCl溶液和純水反復(fù)淋洗后干燥即制得改性載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求4所述的以改性的環(huán)氧基樹脂為載體的固定化酶，其特征在于，對于每g干重環(huán)氧基樹脂Eupergit C25Ql，載體兩性電解質(zhì)的用量為10 20mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求4所述的以改性的環(huán)氧基樹脂為載體的固定化酶，其特征在于，將 PH8 10. 5的載體兩性電解質(zhì)用濃度為50% (ν/ν)以上的ρΗ8 10. 5的載體兩性電解質(zhì)水溶液替換。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的以改性的環(huán)氧基樹脂為載體的固定化酶，其特征在于，所述的烘干條件為真空干燥箱內(nèi)干燥48 72h，干燥溫度不高于40°C。
6.權(quán)利要求1所述的以改性的環(huán)氧基樹脂為載體的固定化酶的制備方法，其特征在于，將改性載體加入Y -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶溶液中，于常溫下振蕩反應(yīng)1 證，將液體濾出，固體顆粒純水淋洗3 4次，烘干后即得。
7.根據(jù)權(quán)利要求7所述的以改性的環(huán)氧基樹脂為載體的固定化酶的制備方法，其特征在于，所述的Y -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶溶液的濃度為0. 25 0. 30mg/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的以改性的環(huán)氧基樹脂為載體的固定化酶的制備方法，其特征在于，對于每g干重改性載體，Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶溶液的用量為10 20mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的以改性的環(huán)氧基樹脂為載體的固定化酶的制備方法，其特征在于，所述的烘干條件為真空干燥箱內(nèi)干燥48 72h，干燥溫度不高于40°C。
10.權(quán)利要求1所述的以改性的環(huán)氧基樹脂為載體的固定化酶在催化合成茶氨酸中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以改性的環(huán)氧基樹脂為載體的固定化酶，它包括酶和固定所述酶的改性載體，所述的酶為γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，所述的改性載體為經(jīng)過pH8～10.5的載體兩性電解質(zhì)改性后的環(huán)氧基樹脂Eupergit C250L。本發(fā)明還公開了上述固定化酶的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明所得到的固定化酶具有性狀均一、酶穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)使用性能好、對反應(yīng)環(huán)境pH值適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，進(jìn)一步提高了γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的穩(wěn)定性，并實(shí)現(xiàn)了新型固定化酶在茶氨酸合成中的應(yīng)用。
文檔編號C12P13/04GK102559648SQ20121001098
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月13日
發(fā)明者周治, 姚忠, 徐虹, 房鑫, 楊敬, 王浩綺, 韋萍 申請人:南京工業(yè)大學(xué)