專利名稱：一種發(fā)酵制備檸檬酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵制備檸檬酸的方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)檸檬酸發(fā)酵行業(yè)的發(fā)酵過程包括淀粉質(zhì)原料的預(yù)處理，將淀粉質(zhì)原料酶解成糊精糖液，其DE值在25左右，配制發(fā)酵培養(yǎng)基；將黑曲霉孢子接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)成熟后轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸。在發(fā)酵過程中，通過黑曲霉菌體自身合成的酶系將糖液酶解糖化成適合黑曲霉直接利用的葡萄糖和果糖，然后代謝合成檸檬酸，發(fā)酵周期一般在60小時(shí)左右，發(fā)酵酸度在14%左右停止發(fā)酵放罐。傳統(tǒng)檸檬酸發(fā)酵方法利用黑曲霉菌株自身分泌的糖化酶進(jìn)行邊糖化邊發(fā)酵。該法的缺點(diǎn)是黑曲霉生長到分泌糖化酶需要一個時(shí)間過程，且糖化酶作用的PH值在4. 0-4. 6左右，而隨著產(chǎn)酸增加，酸度持續(xù)升高，糖化酶活力受到抑制，在發(fā)酵后期無法起到正常糖化作用，導(dǎo)致發(fā)酵后期黑曲霉菌體產(chǎn)酸速率受糖化能力的限制，最終檸檬酸產(chǎn)量較低，發(fā)酵液中殘?zhí)禽^高、發(fā)酵周期較長。針對檸檬酸發(fā)酵過程中的糖化作用進(jìn)行了一些研究，CN101942487A公開了一種添加糖化酶發(fā)酵制備檸檬酸的方法，指出在發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后降溫過程中添加50-100酶活力單位的糖化酶，在降溫到正常接種溫度后接入種子液進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵。該方法由于是在接種前加入糖化酶，雖然環(huán)境溫度有利于糖化作用，但在接入黑曲霉菌株時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)基的 DE值過高，不利于黑曲霉菌株自身糖化酶的合成和作用，不利于黑曲霉菌株的生長；糖化酶的用量較大，成本較高；發(fā)酵液中殘?zhí)禽^高。因此，對于檸檬酸發(fā)酵過程中的糖化作用還有待于進(jìn)一步研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中檸檬酸合成與糖化作用對pH值要求之間的矛盾，并避免發(fā)酵培養(yǎng)基DE值較高對黑曲霉自身的不利影響，提供一種新的發(fā)酵制備檸檬酸的方法。本發(fā)明的發(fā)明人在研究中意外發(fā)現(xiàn)，在黑曲霉接種至發(fā)酵培養(yǎng)基后0-8小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入糖化酶，可加速發(fā)酵培養(yǎng)基中糖液的糖化，避免發(fā)酵后期檸檬酸含量增加對糖化作用的抑制，且可使發(fā)酵培養(yǎng)基的DE值維持在較低水平，避免高DE值對黑曲霉自身的不利影響。因此，為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵制備檸檬酸的方法，所述方法包括在生成檸檬酸的條件下，將檸檬酸發(fā)酵菌種接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，得到發(fā)酵液， 其特征在于，所述方法還包括在檸檬酸發(fā)酵菌種接種后的0-8小時(shí)內(nèi)向所述發(fā)酵培養(yǎng)基中加入糖化酶。優(yōu)選地，在檸檬酸發(fā)酵菌種接種后的0-6小時(shí)內(nèi)向所述發(fā)酵培養(yǎng)基中加入糖化酶。
優(yōu)選情況下，相對于所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的總糖，所述糖化酶的加入量為20-50酶活力單位/g總糖，進(jìn)一步優(yōu)選為30-40酶活力單位/g總糖。本發(fā)明提供的發(fā)酵制備檸檬酸的方法，加強(qiáng)了發(fā)酵過程中的糖化能力，解決了在發(fā)酵過程中檸檬酸合成與糖化作用對PH值要求之間的矛盾，并避免了高DE值對黑曲霉自身的不利影響，從而使發(fā)酵培養(yǎng)基中的糖液被糖化的更徹底，降低了發(fā)酵液中的殘?zhí)橇?，提高了終點(diǎn)檸檬酸含量和單罐供酸量，提高了糖酸轉(zhuǎn)化率，縮短了發(fā)酵周期。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的具體實(shí)施方式
部分予以詳細(xì)說明。
具體實(shí)施例方式以下對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實(shí)施方式
僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明提供了一種發(fā)酵制備檸檬酸的方法，該方法包括在生成檸檬酸的條件下， 將檸檬酸發(fā)酵菌種接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，得到發(fā)酵液，該方法還包括在檸檬酸發(fā)酵菌種接種后的0-8小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入糖化酶。根據(jù)本發(fā)明，盡管在檸檬酸發(fā)酵菌種接種后的0-8小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入糖化酶即可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，即降低發(fā)酵液中的殘?zhí)橇?，提高糖酸轉(zhuǎn)化率，縮短發(fā)酵周期， 但優(yōu)選情況下，在檸檬酸發(fā)酵菌種接種后的0-6小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入糖化酶，可進(jìn)一步降低發(fā)酵液中的殘?zhí)橇?，提高糖酸轉(zhuǎn)化率，縮短發(fā)酵周期。本發(fā)明中，在檸檬酸發(fā)酵菌種接種后的0小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入糖化酶是指將檸檬酸發(fā)酵菌種與糖化酶同時(shí)加入發(fā)酵培養(yǎng)基中。本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)基為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的概念，指微生物發(fā)酵所需的供微生物生長和維持用的人工配制的養(yǎng)料，一般都含有碳水化合物、含氮物質(zhì)、無機(jī)鹽(包括微量元素)以及維生素和水等。發(fā)酵液也為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的概念，指接入微生物菌株的液體培養(yǎng)基(該液體培養(yǎng)基也即本發(fā)明中所稱發(fā)酵培養(yǎng)基)，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)后所得產(chǎn)物。本發(fā)明中，糖化酶即是葡萄糖淀粉酶(0-1，4_葡萄糖水解酶)，相對于發(fā)酵培養(yǎng)基中的總糖，糖化酶的加入量優(yōu)選為20-50酶活力單位/g總糖，進(jìn)一步優(yōu)選為30-40酶活力單位/g總糖。計(jì)算糖化酶的加入量所參照的發(fā)酵培養(yǎng)基中的總糖指的是剛接種后發(fā)酵培養(yǎng)基中的總糖。本發(fā)明中，酶活力單位的定義為在pH值為4. 6、溫度為60°C的條件下，1分鐘將1 毫克淀粉轉(zhuǎn)化為還原糖所需的酶量為一個酶活力單位。本發(fā)明中，對于檸檬酸發(fā)酵菌種的種類無特殊要求，可以為本領(lǐng)域中常用的菌種， 優(yōu)選為黑曲霉。發(fā)酵過程就其本質(zhì)來說是由微生物參與的生物化學(xué)反應(yīng)過程，因此微生物細(xì)胞的數(shù)量、狀態(tài)、代謝情況對產(chǎn)物的生物合成有著重要的影響。菌體濃度的大小對發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率有著重要的影響。理論上菌體濃度越大，產(chǎn)物的產(chǎn)量也越大，但是菌體濃度過高會產(chǎn)生其他影響，如營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，發(fā)酵液中的營養(yǎng)成分發(fā)生明顯的改變，有毒物質(zhì)的積累等， 這些可能改變菌體的代謝途徑。因此，本發(fā)明中，以每升發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，黑曲霉的接種量優(yōu)選為ι. ο X 107-5 X IO7個孢子，進(jìn)一步優(yōu)選為2. 0 X 107-3. 0 X IO7個孢子。
孢子的數(shù)量可以通過本領(lǐng)域公知的方法測定，例如，通過血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。由于在接入黑曲霉菌株時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)基的DE值過高不利于黑曲霉菌株自身糖化酶的合成和作用，不利于黑曲霉菌株的生長，發(fā)酵培養(yǎng)基的DE值過低，又缺少可被黑曲霉直接利用進(jìn)行發(fā)酵的還原性糖，因此，在黑曲霉接種之前，發(fā)酵培養(yǎng)基的DE值優(yōu)選為 15-40%，進(jìn)一步優(yōu)選為15-25%。本發(fā)明中，DE值指的是以葡萄糖計(jì)，還原性糖占發(fā)酵培養(yǎng)基中總糖的百分比。本領(lǐng)域中常用的檸檬酸發(fā)酵培養(yǎng)基的DE值一般均在15-40 %，但為了使發(fā)酵培養(yǎng)基的DE值控制在15-25 %范圍內(nèi)，本發(fā)明中的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選含有淀粉質(zhì)原料酶解產(chǎn)物。一般地，淀粉質(zhì)原料酶解得到淀粉質(zhì)原料酶解殘?jiān)偷矸圪|(zhì)原料酶解液化清液， 通?？梢詫⒌矸圪|(zhì)原料酶解液化清液用于制備發(fā)酵培養(yǎng)基，也可以將淀粉質(zhì)原料酶解液化清液與淀粉質(zhì)原料酶解殘?jiān)旌虾笥糜谥苽浒l(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明中，淀粉質(zhì)原料酶解產(chǎn)物優(yōu)選由淀粉質(zhì)原料酶解殘?jiān)偷矸圪|(zhì)原料酶解液化清液與水混合或不與水混合得到，且進(jìn)一步優(yōu)選以發(fā)酵培養(yǎng)基的總重量為100重量份為基準(zhǔn)，淀粉質(zhì)原料酶解液化清液的用量為 80-95重量份，淀粉質(zhì)原料酶解殘?jiān)挠昧繛?-10重量份，水的用量為0-15重量份。根據(jù)本發(fā)明，淀粉質(zhì)原料酶解液化清液可以通過多種方法制備得到，例如，可以通過如下方法制備得到將淀粉質(zhì)原料粉碎，將粉碎后的產(chǎn)物進(jìn)行酶解，得到酶解產(chǎn)物，將酶解產(chǎn)物固液分離，得到淀粉質(zhì)原料酶解液化清液和淀粉質(zhì)原料酶解殘?jiān)?，固液分離的條件使淀粉質(zhì)原料酶解殘?jiān)墓毯繛?5-60重量％，更優(yōu)選為55-60重量％。根據(jù)本發(fā)明，淀粉質(zhì)原料可以為本領(lǐng)公知的各種可以用于酶解、發(fā)酵制備檸檬酸的含有淀粉的原料，例如，可以選自玉米、薯類(如木薯)和小麥中的一種或幾種，優(yōu)選情況下，所述淀粉質(zhì)原料為玉米。所述酶解步驟可以通過本領(lǐng)域常用的方法完成，比如向粉碎產(chǎn)物中添加產(chǎn)酶微生物和/或酶，在產(chǎn)酶微生物的生長溫度和/或酶有活力的溫度下保溫完成。所述產(chǎn)酶微生物為能夠分泌淀粉酶的產(chǎn)酶微生物。所述酶包括淀粉酶。由于微生物生長會產(chǎn)生副產(chǎn)物，因此優(yōu)選直接加入酶。所述酶的用量越多越好，出于成本考慮，優(yōu)選以每克粉碎后的粉碎產(chǎn)物的干重計(jì)，淀粉酶的用量為15-50個酶活力單位。酶解的溫度可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選為70_105°C，更優(yōu)選為80-95°C。酶解的時(shí)間理論上越長越好，考慮到設(shè)備利用率，優(yōu)選酶解的時(shí)間為90-150分鐘，更優(yōu)選為 100-120分鐘。酶解的pH值可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選為5. 0-7. 0，更優(yōu)選為5. 4-5. 7。淀粉酶是指能夠分解淀粉糖苷鍵的一類酶的總稱，淀粉酶一般包括α-淀粉酶、 β -淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選使用α -淀粉酶和/或異淀粉酶。根據(jù)本發(fā)明，固液分離的方法與裝置為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，壓濾機(jī)或離心機(jī)。黑曲霉可以采用常規(guī)的方法接種，例如，在被接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中之前，將黑曲霉經(jīng)過種子罐培養(yǎng)，之后將得到的成熟種子液加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中。黑曲霉種子培養(yǎng)的程度可以通過取樣顯微鏡鏡檢、酸度測定和PH測定來確定，當(dāng)pH在2. 0-2. 5、酸度為 0. 5-2. 0g/100ml、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時(shí)停止培養(yǎng)，此時(shí)的種子液稱為成熟種子
優(yōu)選情況下，種子罐培養(yǎng)的方法包括將黑曲霉接種在種子罐培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，種子罐培養(yǎng)基中含有10-17重量％的玉米粉，以每升培養(yǎng)液為基準(zhǔn)，黑曲霉的接種量為 2X 108-3X 108 個孢子。根據(jù)本發(fā)明，種子罐培養(yǎng)基的制備方法沒有特別的限制，只要得到的種子罐培養(yǎng)基能夠適用于黑曲霉的培養(yǎng)即可。根據(jù)本發(fā)明，黑曲霉在種子罐培養(yǎng)的培養(yǎng)條件可以在很大范圍內(nèi)改變，例如培養(yǎng)的條件可以包括培養(yǎng)的溫度為25-45°C，起始pH值為5-6，通氣量為0. 1-1體積(體積·分鐘)；更優(yōu)選的情況下，培養(yǎng)的條件可以包括培養(yǎng)的溫度為30-40°C，起始pH值為 5-6，通氣量為0. 3-0. 8體積(體積·分鐘)。術(shù)語“通氣量”一般以通氣比來表示，通常以每分鐘內(nèi)通過單位體積培養(yǎng)液的空氣體積比來表示(ν/ν ·π η)，例如通氣比為1 0. 1-1，簡稱通氣量為0. 1-1體積(體積 分鐘)。本發(fā)明中，對于發(fā)酵的條件沒有特別的限制，可以為本領(lǐng)域常規(guī)的發(fā)酵條件，例如，發(fā)酵的條件可以包括溫度為30-40°C，優(yōu)選為33-38°C ；起始pH值為4_5 ；通氣量為 0. 1-1體積(體積·分鐘)；優(yōu)選為0. 3-0. 8體積(體積·分鐘)。發(fā)酵的設(shè)備為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，可以使用發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵。按照本發(fā)明的方法制備得到的發(fā)酵產(chǎn)物檸檬酸可以用常規(guī)的方法，根據(jù)不同工業(yè)產(chǎn)品的要求分離并精制，比如中和、酸解、脫色、濃縮、結(jié)晶、包裝。以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。另外需要說明的是，在上述具體實(shí)施方式
中所描述的各個具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。實(shí)施例以下的實(shí)施例將對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不因此限制本發(fā)明。在以下實(shí)施例和對比例中黑曲霉菌種為黑曲霉Co827。根據(jù)GB 1987-2007標(biāo)準(zhǔn)檢測所得檸檬酸溶液的濃度(即終點(diǎn)檸檬酸含量或稱酸度)。按照GB/T5009. 7-2008的方法測定發(fā)酵培養(yǎng)基中還原性糖的濃度。按照GB/T5009. 8-2003的方法測定發(fā)酵培養(yǎng)基中總糖的濃度。DE值=發(fā)酵培養(yǎng)基中還原性糖含量/發(fā)酵培養(yǎng)基中總糖含量。以下實(shí)施例和對比例中均以發(fā)酵培養(yǎng)基中還原性糖濃度檢測值低于0. 2g/100ml 時(shí)停止發(fā)酵，確定為發(fā)酵終點(diǎn)。從在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入黑曲霉菌種開始至發(fā)酵終點(diǎn)所經(jīng)歷的時(shí)間為發(fā)酵周期。
殘?zhí)橇繛榘l(fā)酵終點(diǎn)時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)基中總糖的濃度。單罐供酸量=檸檬酸溶液的濃度X檸檬酸溶液的體積。轉(zhuǎn)化率(％ )=單罐供酸量/用糖的總重量X100%，其中用糖的總重量包括種子罐用糖重量和發(fā)酵罐用糖重量。實(shí)施例1本實(shí)施例用于說明本發(fā)明提供的發(fā)酵制備檸檬酸的方法。(1)將收獲的56千克玉米在熱水槽潤燜，直至玉米的含水量為15重量％，然后進(jìn)行粉碎，得到平均粒子直徑為400微米的粉碎后產(chǎn)物。(2)將粉碎后的產(chǎn)物按25重量％的濃度調(diào)漿，相對于每克粉碎后的產(chǎn)物，加入20 個酶活力單位的淀粉酶(諾維信公司，α-淀粉酶，本發(fā)明實(shí)施例和對比例中均為此淀粉酶)，進(jìn)入噴射器，在85°C、pH為5. 5的條件下酶解100分鐘，得到酶解產(chǎn)物。(3)將酶解產(chǎn)物通過用液壓式板框壓濾機(jī)進(jìn)行壓濾，分離出酶解液化清液和酶解濾渣，其中，酶解殘?jiān)暮繛?5重量％。(4)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，將180千克的上述酶解液化清液、10千克的酶解殘?jiān)?3 千克的水滅菌后降溫至35°C，加入到300L的發(fā)酵罐中，得到發(fā)酵培養(yǎng)基。測定發(fā)酵培養(yǎng)基中的還原性糖的濃度和總糖的濃度，計(jì)算DE值為20%。(5)將步驟O)中的部分酶解產(chǎn)物，加水稀釋至總糖為10重量％，得到種子罐培養(yǎng)基，將種子罐培養(yǎng)基投入種子罐，加熱到121°C消毒，維持30分鐘后快速降溫至36°C，接入黑曲霉菌種，每升種子罐培養(yǎng)基中黑曲霉的接種量為3X IO8個孢子。在36°C、起始pH值為5、0. 3體積(體積·分鐘)的通氣條件下進(jìn)行菌種培養(yǎng)；通過取樣顯微鏡鏡檢、酸度測定和PH測定對黑曲霉的生長進(jìn)行觀察，當(dāng)pH在2. 0、酸度lg/100ml、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時(shí)，停止培養(yǎng)，得到成熟種子液。(6)將步驟( 得到的成熟種子液加入到步驟(4)的發(fā)酵罐中開始發(fā)酵，接種量為每升發(fā)酵培養(yǎng)基2. 4X IO7個孢子，發(fā)酵條件包括溫度為35°C，起始pH值為5，通氣量為0. 3 體積(體積 分鐘)，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)3小時(shí)時(shí)向培養(yǎng)基中加入糖化酶，相對于剛接種后發(fā)酵培養(yǎng)基中的總糖，糖化酶的加入量為35酶活力單位/g總糖，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中還原性糖檢測值低于0. 2g/100ml時(shí)停止發(fā)酵，統(tǒng)計(jì)發(fā)酵周期，測定發(fā)酵培養(yǎng)基中的總糖濃度(即為殘?zhí)橇浚?下同)，然后進(jìn)行固液分離，得到檸檬酸溶液，測定檸檬酸溶液的濃度(即終點(diǎn)檸檬酸含量， 或稱酸度，下同)，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。實(shí)施例2本實(shí)施例用于說明本發(fā)明提供的發(fā)酵制備檸檬酸的方法。(1)將收獲的56千克玉米在熱水槽潤燜，直至玉米的含水量為20重量％，然后進(jìn)行粉碎，得到平均粒子直徑為800微米的粉碎后產(chǎn)物。(2)將粉碎后的產(chǎn)物按25重量％的濃度調(diào)漿，相對于每克粉碎后的產(chǎn)物，加入50 個酶活力單位的淀粉酶，進(jìn)入噴射器，在95°C、pH為5. 7的條件下酶解110分鐘，得到酶解產(chǎn)物。(3)將酶解產(chǎn)物通過用液壓式板框壓濾機(jī)進(jìn)行壓濾，分離出酶解液化清液和酶解濾渣，其中，酶解殘?jiān)暮繛?0重量％。(4)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，將190千克的上述酶解液化清液、10千克的酶解殘?jiān)鼫缇蠼禍刂?8°C，加入到300L的發(fā)酵罐中，得到發(fā)酵培養(yǎng)基。測定發(fā)酵培養(yǎng)基中的還原性糖的濃度和總糖的濃度，計(jì)算DE值為25%。(5)將步驟( 中的部分酶解液化清液，加水稀釋至總糖為10重量％，得到種子罐培養(yǎng)基，將種子罐培養(yǎng)基投入種子罐，加熱到121°C消毒，維持30分鐘后快速降溫至33°C， 接入黑曲霉菌種，每升種子罐培養(yǎng)基中黑曲霉的接種量為2X108個孢子。在33°C、起始pH 值為5. 5,0. 6體積(體積·分鐘)的通氣條件下進(jìn)行菌種培養(yǎng)；通過取樣顯微鏡鏡檢、酸度測定和PH測定對黑曲霉的生長進(jìn)行觀察，當(dāng)pH在2. 5、酸度0. 5g/100ml、菌球大小均勻、 菌絲粗壯伸出時(shí)，停止培養(yǎng)，得到成熟種子液。(6)將步驟( 得到的成熟種子液加入到步驟(4)的發(fā)酵罐中開始發(fā)酵，接種量為每升發(fā)酵培養(yǎng)基2. 2 X IO7個孢子，發(fā)酵條件包括溫度為38°C，起始pH值為4. 5，通氣量為 0. 6體積(體積·分鐘)，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)6小時(shí)時(shí)向培養(yǎng)基中加入糖化酶，相對于剛接種后發(fā)酵培養(yǎng)基中的總糖，糖化酶的加入量為30酶活力單位/g總糖，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中還原性糖檢測值低于0. 2g/100ml時(shí)停止發(fā)酵，統(tǒng)計(jì)發(fā)酵周期，測定發(fā)酵培養(yǎng)基中的總糖濃度，然后進(jìn)行固液分離，得到檸檬酸溶液，測定檸檬酸溶液的濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。實(shí)施例3本實(shí)施例用于說明本發(fā)明提供的發(fā)酵制備檸檬酸的方法。(1)將收獲的56千克玉米在熱水槽潤燜，直至玉米的含水量為10重量％，然后進(jìn)行粉碎，得到平均粒子直徑為500微米的粉碎后產(chǎn)物。(2)將粉碎后的產(chǎn)物按25重量％的濃度調(diào)漿，相對于每克粉碎后的產(chǎn)物，加入15 個酶活力單位的淀粉酶，進(jìn)入噴射器，在80°C、pH為5. 4的條件下酶解120分鐘，得到酶解產(chǎn)物。(3)將酶解產(chǎn)物通過用液壓式板框壓濾機(jī)進(jìn)行壓濾，分離出酶解液化清液和酶解濾渣，其中，酶解殘?jiān)暮繛?0重量％。(4)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，將160千克的上述酶解液化清液和20千克的酶解殘?jiān)?0 千克的水滅菌后降溫至40°C，加入到300L的發(fā)酵罐中，得到發(fā)酵培養(yǎng)基。測定發(fā)酵培養(yǎng)基中的還原性糖的濃度和總糖的濃度，計(jì)算DE值為15%。(5)將步驟( 中的部分酶解液化清液，加水稀釋至總糖為10重量％，得到種子罐培養(yǎng)基，將種子罐培養(yǎng)基投入種子罐，加熱到121°C消毒，維持30分鐘后快速降溫至38°C， 接入黑曲霉菌種，每升種子罐培養(yǎng)基中黑曲霉的接種量為2. 5X IO8個孢子。在38°C、起始 pH值為6、0. 8體積(體積·分鐘)的通氣條件下進(jìn)行菌種培養(yǎng)；通過取樣顯微鏡鏡檢、酸度測定和PH測定對黑曲霉的生長進(jìn)行觀察，當(dāng)pH在2. 5、酸度2g/100ml、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時(shí)，停止培養(yǎng)，得到成熟種子液。(6)將步驟( 得到的成熟種子液加入到步驟(4)的發(fā)酵罐中開始發(fā)酵，接種量為每升發(fā)酵培養(yǎng)基2. 6 X IO7個孢子，發(fā)酵條件包括溫度為33°C，起始pH值為4，通氣量為0. 8 體積(體積 分鐘)，加入成熟種子液后立即向培養(yǎng)基中加入糖化酶，相對于剛接種后發(fā)酵培養(yǎng)基中的總糖，糖化酶的加入量為40酶活力單位/g總糖，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中還原性糖檢測值低于0. 2g/100ml時(shí)停止發(fā)酵，統(tǒng)計(jì)發(fā)酵周期，測定發(fā)酵培養(yǎng)基中的總糖濃度，然后進(jìn)行固液分離，得到檸檬酸溶液，測定檸檬酸溶液的濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。實(shí)施例4
按照實(shí)施例1的方法發(fā)酵制備檸檬酸，不同的是，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)8小時(shí)時(shí)向培養(yǎng)基中加入糖化酶。統(tǒng)計(jì)發(fā)酵周期，測定發(fā)酵培養(yǎng)基中的總糖濃度，測定檸檬酸溶液的濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。實(shí)施例5按照實(shí)施例1的方法發(fā)酵制備檸檬酸，不同的是，相對于剛接種后發(fā)酵培養(yǎng)基中的總糖，糖化酶的加入量為50酶活力單位/g總糖。統(tǒng)計(jì)發(fā)酵周期，測定發(fā)酵培養(yǎng)基中的總糖濃度，測定檸檬酸溶液的濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。實(shí)施例6按照實(shí)施例1的方法發(fā)酵制備檸檬酸，不同的是，相對于剛接種后發(fā)酵培養(yǎng)基中的總糖，糖化酶的加入量為20酶活力單位/g總糖。統(tǒng)計(jì)發(fā)酵周期，測定發(fā)酵培養(yǎng)基中的總糖濃度，測定檸檬酸溶液的濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。對比例1按照實(shí)施例1的方法發(fā)酵制備檸檬酸，不同的是，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)10小時(shí)時(shí)向培養(yǎng)基中加入糖化酶。統(tǒng)計(jì)發(fā)酵周期，測定發(fā)酵培養(yǎng)基中的總糖濃度，測定檸檬酸溶液的濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。對比例2按照實(shí)施例1的方法發(fā)酵制備檸檬酸，不同的是，步驟(4)配制發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，滅菌后降溫至60°C時(shí)向培養(yǎng)基中加入糖化酶，相對于發(fā)酵培養(yǎng)基中的淀粉，糖化酶的加入量為80酶活力單位/g淀粉，然后再降溫至35°C，加入到300L的發(fā)酵罐中，得到發(fā)酵培養(yǎng)基， 并且在將步驟( 培養(yǎng)的黑曲霉菌種加入到步驟(4)的發(fā)酵罐中后不再加入糖化酶。統(tǒng)計(jì)發(fā)酵周期，測定發(fā)酵培養(yǎng)基中的總糖濃度，測定檸檬酸溶液的濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。對比例3按照實(shí)施例1的方法發(fā)酵制備檸檬酸，不同的是，不加入糖化酶。統(tǒng)計(jì)發(fā)酵周期， 測定發(fā)酵培養(yǎng)基中的總糖濃度，測定檸檬酸溶液的濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。表 權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵制備檸檬酸的方法，所述方法包括在生成檸檬酸的條件下，將檸檬酸發(fā)酵菌種接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，得到發(fā)酵液，其特征在于，所述方法還包括在檸檬酸發(fā)酵菌種接種后的0-8小時(shí)內(nèi)向所述發(fā)酵培養(yǎng)基中加入糖化酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在檸檬酸發(fā)酵菌種接種后的0-6小時(shí)內(nèi)向所述發(fā)酵培養(yǎng)基中加入糖化酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，相對于所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的總糖，所述糖化酶的加入量為20-50酶活力單位/g總糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，相對于所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的總糖，所述糖化酶的加入量為30-40酶活力單位/g總糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述檸檬酸發(fā)酵菌種為黑曲霉。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，以每升發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，黑曲霉的接種量為 1 X 107-5X 107 個孢子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，以每升發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，黑曲霉的接種量為 2X 107-3X 107 個孢子。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，在黑曲霉接種之前，發(fā)酵培養(yǎng)基的 DE 值為 15-40% ο
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有淀粉質(zhì)原料酶解產(chǎn)物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述發(fā)酵的條件包括溫度為 30-400C，起始pH值為4-5，通氣量為0. 1-1體積(體積·分鐘)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種發(fā)酵制備檸檬酸的方法，所述方法包括在生成檸檬酸的條件下，將檸檬酸發(fā)酵菌種接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，得到發(fā)酵液，其特征在于，所述方法還包括在檸檬酸發(fā)酵菌種接種后的0-8小時(shí)內(nèi)向所述發(fā)酵培養(yǎng)基中加入糖化酶。本發(fā)明提供的發(fā)酵制備檸檬酸的方法，加強(qiáng)了發(fā)酵過程中的糖化能力，解決了在發(fā)酵過程中檸檬酸合成與糖化作用對pH值要求之間的矛盾，并避免了高DE值對黑曲霉自身的不利影響，從而使發(fā)酵培養(yǎng)基中的糖液被糖化的更徹底，降低了發(fā)酵液中的殘?zhí)橇?，提高了終點(diǎn)檸檬酸含量和單罐供酸量，提高了糖酸轉(zhuǎn)化率，縮短了發(fā)酵周期。
文檔編號C12P7/48GK102533877SQ20121000929
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月13日
發(fā)明者周勇, 廖四祥, 楊儒文, 滿云, 章輝平 申請人:中糧生物化學(xué)(安徽)股份有限公司