專利名稱：基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理的單分子型fret生物傳感器接頭的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于將基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理的單分子型FRET生物傳感器最適化的接頭(linker)、包括該接頭的生物傳感器、編碼該接頭或單分子型FRET生物傳感器的基因、包含該接頭或單分子型FRET生物傳感器的表達(dá)載體、具有該表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物、使用上述生物傳感器的測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
在生命科學(xué)領(lǐng)域中，利用突光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescene resonance energytransfer,以下稱為FRET)的原理和熒光蛋白的生物傳感器正在快速地?cái)U(kuò)展(例如參照非專利文獻(xiàn)I 4)。FRET是指從處于激發(fā)狀態(tài)的熒光分子(供體:能量供給體)向非常近的熒光分子(受體:能量接受體)轉(zhuǎn)移激發(fā)能量的現(xiàn)象。利用FRET的生物傳感器的普及大大促進(jìn)綠色熒光蛋白(GFP)的顏色突變體的出現(xiàn)及其改良。現(xiàn)在，很多情況下，作為GFP突變體的CFP(青色熒光蛋白)和YFP (黃色熒光蛋白)作為供體和受體熒光蛋白而被利用。使用熒光蛋白的FRET生物傳感器系統(tǒng)分為雙分子型FRET生物傳感器(圖1)和單分子型FRET生物傳感器(圖2)。雙分子型FRET生物傳感器檢測(cè)分子間相互作用，單分子型FRET生物傳感器檢測(cè)分子的結(jié)構(gòu)變化(例如，參照非專利文獻(xiàn)I 4)。其中，單分子型生物傳感器(單分子型FRET生物傳感器)開(kāi)發(fā)了離子、糖、脂質(zhì)等低分子的定量、低分子量GTP結(jié)合蛋白、激酶等的活性測(cè)定中使用的傳感器(例如，參照非專利文獻(xiàn)4)。

但是，為了制作該生物傳感器，需要結(jié)合至少3個(gè)，很多情況下4個(gè)以上的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，僅僅將它們簡(jiǎn)單接合，通常無(wú)法制作具有充分的靈敏度的單分子型FRET生物傳感器。即，為了制作這樣的單分子型FRET生物傳感器，必須考慮以下3個(gè)因子:i)受體熒光蛋白的發(fā)光光譜與受體熒光蛋白的吸光光譜的重疊；ii)受體熒光蛋白與受體熒光蛋白之間的距離；iii)受體熒光蛋白的發(fā)光瞬間和受體熒光蛋白的吸光瞬間的取向。此外，在熒光蛋白與其他蛋白質(zhì)融合的情況下，與其他蛋白質(zhì)融合成為負(fù)荷，從而產(chǎn)生熒光蛋白的錯(cuò)誤折疊，其結(jié)果，發(fā)色團(tuán)形成的效率降低，還必須考慮到有可能成為無(wú)熒光。這樣，利用受體熒光蛋白和受體熒光蛋白在兩者之間產(chǎn)生FRET的良好的表達(dá)存在嚴(yán)格的條件，兩者間的配置等也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)一定的規(guī)則，因此，每個(gè)制作的單分子型FRET生物傳感器都需要將各種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度、結(jié)構(gòu)域之間的接頭序列等進(jìn)行各種各樣的變更，制作最適宜的傳感器，但是這需要多次試行錯(cuò)誤或復(fù)雜高度的試驗(yàn)等，具有充分靈敏度的單分子型FRET生物傳感器的開(kāi)發(fā)非常的困難。作為連接各結(jié)構(gòu)域的接頭，報(bào)告有9個(gè)氨基酸的甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸構(gòu)成的接頭(例如參照非專利文獻(xiàn)5)、72個(gè)氨基酸的甘氨酸接頭(例如參照非專利文獻(xiàn)6)，但是不能夠說(shuō)充分最適化。此外，這些接頭中，沒(méi)有在多種單分子型FRET生物傳感器中共通的最適化的接頭?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1:Aoki, K.and M.Matsuda.2009.Visualization of small GTPaseactivity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors.NatureProtocol4:1623-1631非專利文獻(xiàn)2:Giepmans, B.N., S.R.Adams, M.H.Ellisman, and R.Y.Tsien.2006.The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.Science312:217-224非專利文獻(xiàn)3:Jares-Erijman, E.A.and T.M.Jovin.1maging molecularinteractions in living cells by FRET microscopy.2006.Curr.0pin.Chem.Biol.10:409-416.
非專利文獻(xiàn)4:Kiyokawa, E.，S.Hara, T.Nakamura, and M.Matsuda.2006.Fluorescence (Forster)resonance energy transfer imaging of oncogene activity inliving cells.Cancer Sc1.97:8-15.
非專利文獻(xiàn)5:1toh, R.E., K.Kurokawa, Y.0hba, H.Yoshizaki, N.Mochizuki,and M.Matsuda.2002.Activation of Rac and Cdc42video-1maged byFRET—based single-molecule probes in the membrane of living cells.Mol.Cell.Biol.22:6582-6591.
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發(fā)明內(nèi)容
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發(fā)明要解決的課題本發(fā)明就是為了解決上述現(xiàn)有的問(wèn)題，以達(dá)成以下的目的為課題的。即，本發(fā)明的目的在于提供一種用于將基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理的單分子型FRET生物傳感器最適化，得到高靈敏度的單分子型FRET生物傳感器而能夠廣泛使用的接頭(以下，本說(shuō)明書(shū)中，本發(fā)明的接頭稱為EV (Enhanced visualization)接頭)、包含該接頭的生物傳感器、編碼該接頭或生物傳感器的基因、包含該接頭或生物傳感器的表達(dá)載體、具有該表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物、和使用包含上述接頭的生物傳感器的測(cè)定絲氨酸-蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP結(jié)合蛋白的活性而使用適宜的上述單分子型FRET生物傳感器的測(cè)定方法。用于解決課題的方法為了解決上述課題進(jìn)行了潛心研究，發(fā)現(xiàn)具有一定以上長(zhǎng)度的接頭可以解決上述問(wèn)題，該接頭將基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理的單分子型FRET生物傳感器最適化，為了獲得高靈敏度的單分子型FRET生物傳感器而能夠廣泛應(yīng)用。并且發(fā)現(xiàn)，通過(guò)包含一定比例或一定序列的特定氨基酸的重復(fù)，能夠提高最適化的效果。S卩，本發(fā)明基于下述見(jiàn)解:使用具有一定以上長(zhǎng)度的接頭，能夠顯著降低作為降低單分子型FRET生物傳感器的增益的主要原因的基礎(chǔ)狀態(tài)的FRET，本發(fā)明能夠廣泛應(yīng)用在單分子型FRET生物傳感器制作中。本發(fā)明的接頭是為了增大上述單分子型FRET生物傳感器的增益而開(kāi)發(fā)得到的接頭，其技術(shù)價(jià)值非常大。 g卩，用于解決上述課題的方法如下。(I) 一種接頭，其為基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理的單分子型FRET生物傳感器的接頭，所述接頭的特征在于，其為包括52個(gè)氨基酸殘基以上、400個(gè)氨基酸殘基以下的多肽，總氨基酸殘基數(shù)的至少45%為甘氨酸和丙氨酸的至少任一個(gè)，丙氨酸在總氨基酸殘基數(shù)中含有至少10%。(2)如上述(I)所述的接頭，其為包括84個(gè)氨基酸殘基以上的多肽。(3)如上述(I)或(2)所述的接頭，絲氨酸和蘇氨酸的至少任一個(gè)在總氨基酸殘基數(shù)中含有至少10%。(4)如上述(3)所述的接頭，總氨基酸殘基數(shù)的至少95%由甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和丙氨酸構(gòu)成，甘氨酸含有35 65%，絲氨酸和蘇氨酸的至少任一個(gè)含有10 40%，丙氨酸含有10 40%o(5)上述(4)所述的接頭，總氨基酸序列的至少95%為由SAGG和GGAS的任一個(gè)的氨基酸序列的重復(fù)構(gòu)成，SAGG和GGAS的任一個(gè)的氨基酸序列的重復(fù)單元含有13個(gè)以上、100個(gè)以下。(6)如上述(I)或(2)所述的接頭，精氨酸和谷氨酸的至少任一個(gè)在總氨基酸殘基數(shù)中含有至少10%。(7)如上述(6)所述的接頭，總氨基酸殘基數(shù)的至少95%由甘氨酸、精氨酸、谷氨酸和丙氨酸構(gòu)成，甘氨酸含有 4 30%，精氨酸含有5 30%，谷氨酸含有5 30%，丙氨酸含有30 60%0(8) —種基因，其特征在于，編碼上述(I) (7)中任一項(xiàng)所述的接頭。(9) 一種表達(dá)載體，其特征在于，包含編碼上述(I) (7)中任一項(xiàng)所述的接頭的基因。(10)—種轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其特征在于，保持上述(9)所述的表達(dá)載體。(11) 一種轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其特征在于，保持上述(9)所述的表達(dá)載體。(12) 一種單分子型FRET生物傳感器，其為基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理的單分子型FRET生物傳感器，其特征在于，其為具有傳感器區(qū)域、配體區(qū)域、受體熒光蛋白區(qū)域、供體熒光蛋白區(qū)域和連接該傳感器區(qū)域與該配體區(qū)域的接頭區(qū)域的融合蛋白，該接頭區(qū)域上述(I) (7)中任一項(xiàng)所述的接頭構(gòu)成。(13)如上述(12)所述的單分子型FRET生物傳感器，該供體熒光蛋白為YPet。(14)一種基因，其特征在于，編碼上述(12)或(13)中任一個(gè)所述的單分子型FRET生物傳感器。(15)—種表達(dá)載體，其特征在于，包含編碼上述(14)所述的單分子型FRET生物傳感器的基因。(16)—種轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其特征在于，保持上述(15)所述的表達(dá)載體。(17)—種轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其特征在于，保持上述(15)所述的表達(dá)載體。(18)—種測(cè)定方法，其特征在于，包括使用上述(12)所述的單分子型FRET生物傳感器檢測(cè)FRET的工序，測(cè)定絲氨酸一蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性和低分子量GTP結(jié)合蛋白活性的任一個(gè)。(19) 一種測(cè)定方法，其特征在于，包括使用上述(16)所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞或上述(13)所述的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物檢測(cè)FRET的工序，測(cè)定絲氨酸一蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性和低分子量GTP結(jié)合蛋白活性的任一個(gè)。(20) 一種絲氨酸一蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性和低分子量GTP結(jié)合蛋白活性的任一個(gè)的調(diào)節(jié)物質(zhì)的篩選方法，包括:(a)使上述(16)所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞與被檢物質(zhì)接觸的工序；和(b)通過(guò)檢測(cè)FRET，檢測(cè)絲氨酸一蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性和低分子量GTP結(jié)合蛋白活性的任一個(gè)的變化的工序。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明的接頭，能夠?qū)⒒跓晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移原理的單分子型FRET生物傳感器最適化，得到高靈敏度單分子型FRET生物傳感器。根據(jù)本發(fā)明的單分子型FRET生物傳感器，能夠測(cè)定絲氨酸一蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性和低分子量GTP結(jié)合蛋白活性。


圖1表示雙分子型FRET生物傳感器的基本結(jié)構(gòu)和工作原理。為了檢測(cè)A和B的分子間相互作用，A融合FRET受體熒光蛋白(示例CFP)，B融合FRET受體熒光蛋白(示例YFP )。若A和B結(jié)合，則FRET供體熒光蛋白接近FRET受體熒光蛋白，利用FRET檢測(cè)來(lái)自FRET受體熒光蛋白的熒 光。帶有箭頭的波浪線是表示激發(fā)光和熒光。圖2表示單分子FRET生物傳感器的基本結(jié)構(gòu)和工作原理。已知A分子發(fā)生結(jié)構(gòu)變化的情況下，在兩個(gè)位置融合FRET供體熒光蛋白(示例CFP)和FRET受體熒光蛋白(示例YFP)。A分子的結(jié)構(gòu)變化帶來(lái)FRET的效率變化。附有箭頭的波浪線表示激發(fā)光和熒光。圖3表示利用包括傳感器區(qū)域和配體區(qū)域的FRET的單分子型FRET生物傳感器的原理。在FRET供體熒光蛋白(示例CFP)和FRET受體熒光蛋白(示例YFP)之間，通過(guò)接頭序列結(jié)合傳感器區(qū)域與配體區(qū)域。傳感器區(qū)域包括與激酶的活化、GTP交換因子的活化等各種細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的變化相對(duì)應(yīng)而發(fā)生結(jié)構(gòu)變化的部分。配體區(qū)域?yàn)榕c該傳感器區(qū)域的結(jié)構(gòu)變化相對(duì)應(yīng)而結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。若傳感器區(qū)域的結(jié)構(gòu)變化，則配體區(qū)域結(jié)合。與之相伴，F(xiàn)RET供體熒光蛋白接近FRET受體熒光蛋白，利用FRET檢測(cè)來(lái)自FRET受體熒光蛋白的熒光。圖4為以針對(duì)PKA的生物傳感器Eevee-PKA為例，例示利用包括傳感器區(qū)域和配體區(qū)域的FRET的單分子型FRET生物傳感器中的接頭區(qū)域的作用。傳感器區(qū)域包括由PKA特異性磷酸化的底物序列。配體區(qū)域?yàn)橐阎种婆c該磷酸化肽接合的Radl蛋白的FHAl結(jié)構(gòu)域。若傳感器區(qū)域的底物序列被PKA磷酸化，則與配體區(qū)域接合。與之相伴，F(xiàn)RET供體熒光蛋白(CFP)接近FRET受體熒光蛋白(YFP)，利用FRET檢測(cè)來(lái)自FRET受體熒光蛋白的熒光。圖5表示EV接頭的長(zhǎng)度與增益的關(guān)系，在HeLa細(xì)胞中表達(dá)具有各種長(zhǎng)度的EV接頭的Eevee-PKA，在24小時(shí)后，通過(guò)ImM的聯(lián)丁?；鵦AMP將PKA活化。測(cè)定刺激前和刺激后30分鐘的FRET/CFP熒光比，將相對(duì)于刺激前的增加的比例作為增益。圖6表示YFP受體蛋白為YPet突變株時(shí)，EV接頭的效果更顯著。制作具有YPet和各種長(zhǎng)度的EV接頭的Eevee-PKA。接著，在HeLa細(xì)胞中表達(dá)這些Eevee-PKA，24小時(shí)后，通過(guò)ImM的聯(lián)丁酰基cAMP將PKA活化。測(cè)定刺激前和刺激后30分鐘的FRET/CFP熒光比，將相對(duì)于刺激前的增加的比例作為增益。圖7表示EV接頭的效果是通過(guò)降低基礎(chǔ)狀態(tài)的FRET來(lái)獲得的。圖7A為在HeLa細(xì)胞中表達(dá)Eevee-PKA-52，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡FV1000以438nm的激光激發(fā)，測(cè)定各波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度的結(jié)果。圖7B為采用Eevee-PKA-84，與圖7A同樣測(cè)定的結(jié)果。圖7C為采用Eevee-PKA-116，與圖7A同樣測(cè)定的結(jié)果。表示基礎(chǔ)狀態(tài)下的FRET的530nm熒光通過(guò)增長(zhǎng)EV接頭而顯著降低。圖8A表示由EV接頭導(dǎo)致的基礎(chǔ)狀態(tài)的FRET效率降低來(lái)自磷酸化的降低。與圖7同樣，在HeLa細(xì)胞中表達(dá)Eevee-PKA。刺激前樣品分為ImM聯(lián)丁?；鵦AMP進(jìn)行15分鐘處理的物質(zhì)和ImM聯(lián)丁?；鵦APM和50nM花萼海綿誘癌素進(jìn)行15分鐘處理的物質(zhì)，通過(guò)含有50iiM PhosTag的6%SDS聚丙烯酸酰胺凝膠進(jìn)行分離。之后，以抗GFP抗體小鼠單克隆抗體進(jìn)行免疫印跡。得知隨著EV接頭縮短，基礎(chǔ)狀態(tài)的磷酸化降低。圖8B為用圖表表示圖8A的磷酸化比例的圖。圖9A表示具有PIP3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Akt生物傳感器(Eevee_Akt_84)的結(jié)構(gòu)。記載為84a.a.的為EV84接頭。AktPH表示Akt蛋白的PH結(jié)構(gòu)域，NES為核輸出信號(hào)。圖9B是與圖9A同樣表示具有PIP3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Akt生物傳感器(Eevee-Akt-116)的結(jié)構(gòu)。記載為116a.a.的為EV116接頭。圖10表示在Akt的生物傳感器中也觀察到由EV接頭導(dǎo)致的基礎(chǔ)狀態(tài)的FRET降低。在C0S7細(xì)胞中表達(dá)Eevee-Akt，測(cè)定FRET/CFP熒光比。對(duì)5個(gè)以上的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，顯示平均值。EV接頭為116的比72Gly接頭具有更低的基礎(chǔ)狀態(tài)的FRET。圖1lA為由Eevee-ERK進(jìn)行的ERK活性測(cè)定與具有甘氨酸接頭的情況下進(jìn)行比較的圖。圖1lA為在HeLa細(xì)胞中表達(dá)包含EV116接頭的Eevee-ERK (3560NES)，以10ng/ml的EGF刺激，將實(shí)測(cè)值的FRET/CFP熒光比記錄于Y軸的圖。圖1lB表示將上述FRET/CFP熒光比以刺激前狀態(tài)標(biāo)準(zhǔn)化后的圖。圖1lC為與圖1lA同樣表示具有甘氨酸接頭的EKAR-1667nes (72Gly接頭)(1667NES)的結(jié)果的圖。圖1lD為表示將上述FRET/CFP熒光比以刺激前狀態(tài)標(biāo)準(zhǔn)化后的圖。實(shí)測(cè)值的FRET/CFP的上限為2.2左右，因此顯示，相比于具有甘氨酸接頭的EKAR_1667nes，包括EV116接頭的Eevee-ERK(參照?qǐng)D1lA和B)具有很廣的增益，這是由于低的基礎(chǔ)狀態(tài)的FRET效率所導(dǎo)致的。圖12表示具有EV接頭的EGFR/Abl的生物傳感器Picchu_734的反應(yīng)性。在HeLa細(xì)胞中表達(dá)Picchu-734，用10ng/ml的EGF刺激?？芍c沒(méi)有EV接頭的Picchu-730相比，
具有更廣的增益。圖13A表示由具有EV接頭的Raichu-Racl (2246X)進(jìn)行的Racl活性測(cè)定。為在HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染沒(méi)有EV接頭的pRaichu-Racl (2241X)和具有EV接頭的pRaichu-Racl(2246X)，在48小時(shí)后，用實(shí)施例2記載的方法進(jìn)行顯像。在激光共聚焦顯微鏡FVlOOO下，用438nm的激光激發(fā)， 測(cè)定各波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度的圖?？芍硎净A(chǔ)狀態(tài)的FRET的530nm的熒光由于增長(zhǎng)EV接頭而顯著降低。圖13B為在圖13A的顯像中，在顯像開(kāi)始10分鐘后投與表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，使其達(dá)到25ng/ml，繼續(xù)顯像。將標(biāo)準(zhǔn)化后的FRET/CFP作為圖表顯示。具有EV接頭的Raichu-Racl (2246X)具有更高的反應(yīng)性。圖14A表示穩(wěn)定表達(dá)Raichu_2246X的大鼠C6細(xì)胞經(jīng)過(guò)24小時(shí)定時(shí)成像，測(cè)定FRET/CFP效率(記載為Racl活性)的數(shù)據(jù)。箭頭表示細(xì)胞分裂。顯示在表達(dá)EV接頭的細(xì)胞中，F(xiàn)RET長(zhǎng)時(shí)間能夠穩(wěn)定測(cè)定。圖14B為在與上述相同的條件下攝影的其他細(xì)胞的結(jié)果。圖14C為在與上述相同的條件下攝影的其他細(xì)胞的結(jié)果。圖14D為在與上述相同的條件下攝影的其他細(xì)胞的結(jié)果。圖15A為在C0S7細(xì)胞中表達(dá)具有EV接頭的Raichu-Cdc42。比較基礎(chǔ)狀態(tài)的FRET效率，顯示EV接頭顯著降低基礎(chǔ)狀態(tài)的FRET。圖15B為對(duì)具有EV接頭的Raichu_Cdc42在顯像開(kāi)始10分鐘后投與表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，使其達(dá)到25ng/ml，將繼續(xù)顯像時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)化后的FRET/CFP作為圖表表示的圖。圖15C為沒(méi)有EV接頭的Raichu_Cdu42，與圖15B同樣，將標(biāo)準(zhǔn)化后的FRET/CFP作為圖表表示?？芍c沒(méi)有EV接頭的Raichu-Cdc42相比，具有EV接頭的Raichu_Cdu42具有更高的反應(yīng)性。圖16A為在HeLa細(xì)胞中表達(dá)具有EV接頭的Raichu-Ras (3705X)，用10ng/ml的EGF刺激，每隔I分鐘獲取的定時(shí)攝影的圖?？芍c沒(méi)有EV接頭的Raichu-HRas (圖16B)相比較，具有EV接頭 的Raichu-HRas能夠早期檢測(cè)出很強(qiáng)的活化。圖16B為沒(méi)有EV接頭的Raichu-HRas與圖16A同樣獲取圖像的圖。圖17為用熒光顯微鏡拍攝表達(dá)Eevee-ERK的轉(zhuǎn)基因小鼠的胎兒的矢狀切面，獲取FRET圖像的圖?；A(chǔ)狀態(tài)前后40%用偽彩色表示(暖色表示高的FRET)。能夠觀察到個(gè)體內(nèi)的ERK活性分布。圖18為在HeLa細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)Eevee-ERK的細(xì)胞在96孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，加入梯度稀釋的抑制劑之后，用25ng/ml的EGF刺激得到的結(jié)果。對(duì)30個(gè)以上的細(xì)胞自動(dòng)測(cè)定ERK活性，將平均值圖表化。圖18A表示DMSO的對(duì)照。圖18B表示使用EGF受體抑制劑(AG1478)作為抑制劑的情況。圖18C表示使用MEK抑制劑(PD15035)作為抑制劑的情況。圖18D表示使用BRAF的抑制劑(PLX4720)作為抑制劑的情況。圖18E表示使用MEK抑制劑(PD184351)作為抑制劑的情況。圖18F表示使用磷脂酰肌醇3-磷酸激酶的抑制劑(LY294002)作為抑制劑的情況。圖18G表示使用RSK的抑制劑(B1-D1870)作為抑制劑的情況。圖18H表示使用JNK抑制劑(JNK inhibitor VIII)作為抑制劑的情況。顯示EGK依賴性ERK活化在HeLa細(xì)胞中通過(guò)EGF受體和MEK的抑制劑而被有效抑制。圖19表示在表達(dá)Eevee-PKA (3536NES)的轉(zhuǎn)基因小鼠中，分別靜脈注射磷酸二酯酶的抑制劑茶堿和環(huán)腺苷三磷酸的類似物布拉地新，測(cè)定PKA活性得到的結(jié)果。分別在肌間神經(jīng)細(xì)胞、腸道平滑肌、血管平滑肌中能夠?qū)崟r(shí)可視化PKA的活性變化。圖20為將圖19的圖像圖表化的圖。
圖21為顯示使用減少甘氨酸含量的EV3X8和EV6X4接頭的生物傳感器也具有與使用EV116接頭的生物傳感器幾乎相同的效果的圖。與圖7同樣，在HeLa細(xì)胞中表達(dá) Eevee-PKA_3X8、Eevee-PKA_4X6、Eevee-PKA-116，在激光共聚焦顯微鏡 FV1000 下，用438nm的激光激發(fā)，測(cè)定各波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度的圖?？芍狤V3X8和EV4X6接頭具有與EVl 16接頭相匹敵的效能。
具體實(shí)施例方式以下，說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式。本發(fā)明的接頭(EV接頭)為基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)原理的單分子型FRET生物傳感器的接頭，為包括52個(gè)氨基酸殘基以上、400個(gè)氨基酸殘基以下的多肽，總氨基酸殘基數(shù)的至少45%為甘氨酸和丙氨酸的任一個(gè)，丙氨酸在總氨基酸殘基數(shù)中至少包含10%。本發(fā)明的接頭，作為基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)原理的單分子型FRET生物傳感器，即單分子型FRET生物傳感器中的構(gòu)成要素之一而連結(jié)使用。本發(fā)明中，所謂FRET，是指從處于激發(fā)狀態(tài)的熒光分子(供體:能量供給體)向非常近的熒光分子(受體:能量接受體)轉(zhuǎn)移激發(fā)能量的現(xiàn)象。 單分子型FRET生物傳感器通常具有供體熒光蛋白、受體熒光蛋白、傳感器結(jié)構(gòu)域、配體結(jié)構(gòu)域這四個(gè)區(qū)域，接頭連接這些的2個(gè)區(qū)域之間。圖3為單分子型FRET生物傳感器中使用的本發(fā)明的接頭的示例。將CFP作為供體熒光蛋白的一例，YFP作為受體熒光蛋白的一例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說(shuō)明，但是如后所述，供體熒光蛋白和受體熒光蛋白不限于此。傳感器結(jié)構(gòu)域和配體結(jié)構(gòu)域在基礎(chǔ)狀態(tài)下處于空間上離開(kāi)的位置，在該狀態(tài)下，供體熒光蛋白和受體熒光蛋白也處于空間上離開(kāi)的位置，基礎(chǔ)狀態(tài)的FRET效率低。在活化狀態(tài)中，由結(jié)構(gòu)識(shí)別結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的配體區(qū)域(B)識(shí)別因磷酸化、GTP結(jié)合等各種信號(hào)誘導(dǎo)的傳感器區(qū)域(A)的結(jié)構(gòu)變化并與之結(jié)合，由此使供體接近受體，從而使FRET效率提高。在此，F(xiàn)RET效率是指激發(fā)供體熒光蛋白所得到的熒光強(qiáng)度的在受體熒光蛋白存在下的減少比例，但是在本說(shuō)明書(shū)中，為了方便起見(jiàn)，使用在供體熒光蛋白的激發(fā)波長(zhǎng)照射單分子型FRET生物傳感器的情況下的供體熒光蛋白的熒光強(qiáng)度與受體熒光蛋白的熒光強(qiáng)度的比(熒光強(qiáng)度比)(參照非專利文獻(xiàn)I和3)。以下，本說(shuō)明書(shū)中記載的參考文獻(xiàn)通過(guò)參照而將其全部教導(dǎo)弓I入本說(shuō)明書(shū)中。本說(shuō)明書(shū)中的EV接頭是至少具有52個(gè)氨基酸以上、400個(gè)氨基酸以下的長(zhǎng)度，沒(méi)有獲得穩(wěn)定的三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽。如果不足52個(gè)氨基酸，則基礎(chǔ)狀態(tài)下的FRET效率增高，不會(huì)獲得很大的增益；如果超過(guò)400個(gè)氨基酸，則FRET生物傳感器的分子量增大，表達(dá)量降低。從增大上述增益的觀點(diǎn)出發(fā)，更優(yōu)選84個(gè)氨基酸以上，特別優(yōu)選116個(gè)氨基酸以上。從抑制上述分子量的觀點(diǎn)出發(fā)，更優(yōu)選244個(gè)氨基酸以下。從上述觀點(diǎn)出發(fā)，接頭的長(zhǎng)度特別優(yōu)選84氨基酸以上、244氨基酸以下。本發(fā)明的EV接頭是沒(méi)有取得穩(wěn)定的三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽，總氨基酸殘基數(shù)的至少45%為甘氨酸和丙氨酸的至少任一個(gè)(即，意為甘氨酸殘基和丙氨酸殘基的合計(jì)占總氨基酸殘基數(shù)的至少45%)，丙氨酸在總氨基酸殘基數(shù)中至少包含10%?？偘被釟埢鶖?shù)的至少45%為甘氨酸和丙氨酸的至少任一個(gè)構(gòu)成，從制作可動(dòng)性大的多肽的觀點(diǎn)出發(fā)是非常重要的，通過(guò)使丙氨酸在總氨基酸殘基數(shù)中至少包含10%，能夠比僅由甘氨酸構(gòu)成的接頭增大增益。作為甘氨酸和丙氨酸以外的氨基殘基，只要注意不能取得穩(wěn)定的三級(jí)結(jié)構(gòu)，則也可以包含其他氨基酸。從制作不能取得穩(wěn)定的三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽的觀點(diǎn)出發(fā)，特別適宜包含絲氨酸、蘇氨酸、精氨酸、谷氨酸等。例如，優(yōu)選除了甘氨酸和丙氨酸，絲氨酸和蘇氨酸的至少任一個(gè)在總氨基酸殘基數(shù)中含有至少10%的多肽。作為這樣的多肽，可以舉出總氨基酸殘基數(shù)的至少95%由Gly, Ser, Thr和Ala構(gòu)成，Gly含有35 65%、Ser和Thr的至少任一個(gè)含有10 40%、Ala含有10 40%的多肽。這些氨基酸殘基優(yōu)選均勻分布于全長(zhǎng)中，其中，優(yōu)選重復(fù)包含Ser-Ala-Gly-Gly、其反向序列 Gly-Gly-Ala-Ser 或 Gly-Ala-Gly-Ser 的序列。作為這樣的序列，例如，優(yōu)選 Ser-Ala-Gly-Gly、Gly-Gly-Ala-Ser 或 Gly-Ala-Gly-Ser 的重復(fù)單元在總氨基酸殘基數(shù)中包含95%以上，在上述基本序列之外，也優(yōu)選以總體不足5%的范圍在序列中插入Gly、Ser、Ala、Thr等的序列。上述序列中，優(yōu)選以與Ser性質(zhì)非常接近的氨基酸Thr取代Ser的序列。上述氨基酸序列的重復(fù)單元優(yōu)選包含13個(gè)以上、100個(gè)以下。這樣的接頭的具體例子可以例舉如下。EV52接頭(序列號(hào):12)SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGEV84接頭(序列號(hào):15)SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGEV116 接頭(序列號(hào):18)SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGG EV180 接頭(序列號(hào):23) SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGS TSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGEV244 接頭(序列號(hào):26 )SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGG此外，優(yōu)選除了丙氨酸和甘氨酸，精氨酸和谷氨酸的至少任一個(gè)在總氨基酸殘基數(shù)中含有至少10%的多肽。作為這樣的多肽，可以舉出總氨基酸殘基數(shù)的至少95%由甘氨酸、精氨酸、谷氨酸和丙氨酸構(gòu)成，甘氨酸含有4 30%，精氨酸含有5 30%，谷氨酸含有5 30%、丙氨酸含有30 60%的多肽。這樣的氨基酸殘基優(yōu)選均勻分布于全長(zhǎng)中，例如，可以例舉下述序列。EV3X8 接頭(序列號(hào):45)EAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREMARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAAREV6X4 接頭(序列號(hào):46)EAAAREAAAREAAAREAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAAREAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAAREAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARAAREAAAREAAAREV3X8接頭為3次重復(fù)EAAAR序列得到的15個(gè)氨基酸殘基的序列單元以GG序列連接8個(gè)而得到的134個(gè)氨基酸殘基的多肽?？偘被釟埢鶖?shù)134個(gè)中，丙氨酸為72個(gè)(53.7%)，甘氨酸為14個(gè)(10.4%)，谷氨酸為24個(gè)(17.9%)，精氨酸為24個(gè)(17.9%)。丙氨酸和甘氨酸合計(jì)為64.1%。此外，EV6X4接頭為124個(gè)氨基酸殘基的多肽，總氨基酸殘基數(shù)124個(gè)中，丙氨酸為71個(gè)(57.3%)，甘氨酸6個(gè)(4.8%)，谷氨酸23個(gè)(18.5%)，精氨酸24個(gè)(19.4%)，丙氨酸和甘氨酸合計(jì)為62.1%。本發(fā)明的EV接頭增大了單分子型FRET生物傳感器的增益，該單分子型FRET生物傳感器中的插入部位考慮到基礎(chǔ)狀態(tài)和活化狀態(tài)的FRET效率之差，即，增益的增大而適宜選擇。即，能夠連接選自單分子型FRET生物傳感器的供體熒光蛋白、受體熒光蛋白、傳感器結(jié)構(gòu)域和配體結(jié)構(gòu)域的任2個(gè)區(qū)域之間而使用，對(duì)于用在哪個(gè)區(qū)域間沒(méi)有特別限定。例如，如圖3所示，能夠用在傳感器結(jié)構(gòu)域和配體結(jié)構(gòu)域之間的連接。本發(fā)明的單分子型FRET生物傳感器是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理的單分子型FRET生物傳感器，其為具有傳感器區(qū)域、配體區(qū)域、受體熒光蛋白區(qū)域、供體熒光蛋白區(qū)域和連接該傳感器區(qū)域和配體區(qū)域的接頭區(qū)域的融合蛋白，該接頭區(qū)域由上述本發(fā)明的接頭構(gòu)成。本發(fā)明的單分子型FRET生物傳感器的優(yōu)選方式為:至少包含供體熒光蛋白、受體熒光蛋白、傳感器結(jié)構(gòu)域、配體結(jié)構(gòu)域、接頭的5個(gè)區(qū)域的至少每一個(gè)，并且，從氨基末端側(cè)包含供體(或受體)熒光 蛋白、傳感器(或配體)結(jié)構(gòu)域、EV接頭、配體(或傳感器)結(jié)構(gòu)域、受體(或供體)熒光蛋白的方式(I);至少包含供體熒光蛋白、受體熒光蛋白、傳感器結(jié)構(gòu)域、配體結(jié)構(gòu)域、接頭的5個(gè)區(qū)域的至少每一個(gè)，并且，從氨基末端側(cè)包含傳感器(或配體)結(jié)構(gòu)域、供體(或受體)熒光蛋白、EV接頭、受體(或供體)熒光蛋白、配體(或傳感器)結(jié)構(gòu)域的方式
(2);至少包含供體熒光蛋白、受體熒光蛋白、傳感器結(jié)構(gòu)域、配體結(jié)構(gòu)域、接頭的5個(gè)區(qū)域的至少每一個(gè)，并且，從氨基末端側(cè)包含供體(或受體)熒光蛋白、傳感器(或配體)結(jié)構(gòu)域、EV接頭、受體(或供體)熒光蛋白、配體(或傳感器)結(jié)構(gòu)域的方式(3);至少包含供體熒光蛋白、受體熒光蛋白、傳感器結(jié)構(gòu)域、配體結(jié)構(gòu)域、接頭的5個(gè)區(qū)域的至少每一個(gè)，并且，從氨基末端側(cè)包含傳感器(或配體)結(jié)構(gòu)域、供體(或受體)熒光蛋白、EV接頭、受體(或供體)熒光蛋白、配體(或傳感器)結(jié)構(gòu)域的方式(4)。傳感器區(qū)域包括磷酸化的肽或者低分子量GTP結(jié)合蛋白的情況下優(yōu)選方式(I )。因此，該EV接頭在單分子型FRET生物傳感器中優(yōu)選存在于配體區(qū)域和傳感器區(qū)域之間。此夕卜，在單分子型FRET生物傳感器中不一定必須存在各一個(gè)受體熒光蛋白、受體熒光蛋白、傳感器區(qū)域、配體區(qū)域、EV接頭，也可以存在多個(gè)。作為構(gòu)成供體熒光蛋白區(qū)域的供體熒光蛋白，只要保持形成FRET對(duì)的功能，就沒(méi)有特別限定，但是從功能性的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選CFP或TFP (Teal Fluorescence Protein)。構(gòu)成另一方面的受體熒光蛋白區(qū)域的受體熒光蛋白也同樣，只要保持形成FRET對(duì)的功能，就沒(méi)有特別限定，但是從功能性的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選YFP。在此，所謂的FRET對(duì)的功能，是指從激發(fā)狀態(tài)的供體熒光蛋白向附近的受體熒光蛋白轉(zhuǎn)移激發(fā)能量，并能夠檢測(cè)該激發(fā)能量的轉(zhuǎn)移。供體熒光蛋白和/或受體熒光蛋白只要能夠保持形成FRET對(duì)的功能，則也可以為這些蛋白質(zhì)的一部分，而不一定為全長(zhǎng)。通過(guò)屢屢縮短這些氨基酸序列的羧基末端，產(chǎn)生FRET效率之差的增大。例如，作為受體熒光蛋白和/或供體熒光蛋白的一部分，可以例舉在這些氨基酸序列的羧基末端區(qū)域優(yōu)選具有至少I個(gè)、更優(yōu)選I 11個(gè)缺失的蛋白。其中，該區(qū)域中的氨基酸缺失部位沒(méi)有特別限定。例如，在YFP的情況下，其氨基酸序列的羧酸末端區(qū)域優(yōu)選具有至少I個(gè)、更優(yōu)選I 11個(gè)、更優(yōu)選11個(gè)氨基酸缺失。在CFP的情況下，其氨基酸序列的羧酸末端區(qū)域中優(yōu)選具有至少I個(gè)、更優(yōu)選I 11個(gè)、更優(yōu)選11個(gè)氨基酸缺失。這里，羧酸末端區(qū)域是指在本發(fā)明中使用的GFP關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)的氨基酸序列中，從其羧酸末端直到氨基酸的個(gè)數(shù)優(yōu)選I 20個(gè)、更優(yōu)選11個(gè)的區(qū)域。此外，是否保持形成FRET對(duì)的功能，例如能夠通過(guò)以下方法評(píng)價(jià)，S卩，依照公知的方法在大腸桿菌中共同產(chǎn)生假想形成FRET對(duì)的一對(duì)蛋白質(zhì)分子，在含有該一對(duì)蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取液中，觀察該蛋白質(zhì)在各自的假定激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度。而且，受體熒光蛋白和/或受體熒光蛋白是否具有突變都可以。只要是能夠保持形成FRET對(duì)的功能，則突變的導(dǎo)入可以對(duì)受體熒光蛋白和/或受體熒光蛋白的氨基酸序列中的任意部位進(jìn)行。例如，作為突變的方式，可以舉出多個(gè)氨基酸的取代，作為這樣的氨基酸取代的具體方式，例如可以舉出GFP的突變體Leu65Phe、Phe47Leu、Thr66Ser等。通過(guò)導(dǎo)入這樣的突變，能夠獲得使得發(fā)色團(tuán)形成效率上升、FRET效率上升等效果，因此優(yōu)選。突變的導(dǎo)入能夠通過(guò)公知的使用PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))的方法進(jìn)行。作為YFP的突變體，例如，可以舉出 Ypet [Nguyen A.ff., and P.S.Daugherty.Evolutionary optimization offluorescent proteins for intracellular FRET.2005.Nat.Biotechnol.23:355-360]>EYFP (Clontech 公司)、Venus [Nagai, T., K.1bata, E.S.Park, M.Kubota, K.Mikoshiba, andA.Miyawak1.A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficientmaturation for cell-biological applications.2002.Nat.Biotechnol.20:87-90.]等，作為 CFP 的突變體，例如能夠舉出 CyPet [Nguyen A.ff., and P.S.Daugherty.Evolutionaryoptimization of fluorescent proteins for intracellular FRET.2005.Nat.Biotechnol.23:355-360]、ECFP (Clontech 公司)、SECFP (非專利文獻(xiàn) 5)、Turquoise(Goedhart, J., L.an ffeeren, M.A.Hink, N.0.Vischer, K.Jalink, and T.ff.Gadella, Jr.Bright cyan fluorescent protein variants` identified by fluorescence lifetimescreening.2010.Nat.Methods7:137-139.)等。作為受體熒光蛋白和供體熒光蛋白的組合，適宜使用 Venus 和 ECFP、YPet 和 ECFP、Venus 和 Turquoise、YPet 和 Turquoise。作為構(gòu)成傳感器區(qū)域的傳感器蛋白和構(gòu)成配體區(qū)域的配體的組合，沒(méi)有特別限定，可以適宜舉出能夠測(cè)定絲氨酸-蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP結(jié)合蛋白的任一個(gè)的組合。作為測(cè)定絲氨酸-蘇氨酸激酶活性的組合，可以適宜地舉出包含叉頭關(guān)聯(lián)(Forkhead-associated,以下記載為FHA1)區(qū)域、Wff (Trp-Trp)區(qū)域、或者BRCT(BRCA1-C末端)區(qū)域和絲氨酸或蘇氨酸的肽序列；作為測(cè)定酪氨酸激酶活性的組合，可以適宜地舉出包含SH2 (Src同源-2)結(jié)構(gòu)域或PTB (Phsophotyrosine-binding:磷酸酪氨酸結(jié)合)結(jié)構(gòu)域和酪氨酸的肽序列；作為測(cè)定低分子量GTP結(jié)合蛋白活性的組合，可以適宜地舉出包含Ras家族低分子量GTP結(jié)合蛋白、Rho家族低分子量GTP結(jié)合蛋白、Rab家族低分子量GTP結(jié)合蛋白、Arf家族低分子量GTP結(jié)合蛋白、或者Ran家族低分子量GTP結(jié)合蛋白和各自的標(biāo)的蛋白。
作為本發(fā)明的單分子型FRET生物傳感器的構(gòu)成要素和分別特別優(yōu)選的組合，從有效性、特異性、靈敏度的觀點(diǎn)出發(fā)，傳感器區(qū)域?yàn)榈头肿恿縂TP結(jié)合蛋白R(shí)as，配體區(qū)域?yàn)镽as的標(biāo)的蛋白R(shí)af，供體熒光蛋白為CFP，受體熒光蛋白為YFP ;或者，傳感器區(qū)域?yàn)榈头肿恿縂TP結(jié)合蛋白R(shí)acl，配體區(qū)域?yàn)镽acl的標(biāo)的蛋白Pak，供體熒光蛋白為CFP，受體熒光蛋白為YFP ;或者，傳感器區(qū)域?yàn)榈头肿恿縂TP結(jié)合蛋白Cdc42，配體區(qū)域?yàn)镃dc42的標(biāo)的蛋白Pak，供體熒光蛋白為CFP，受體熒光蛋白為YFP ;或者，傳感器區(qū)域?yàn)橛傻鞍准っ窤 (A激酶，以下記為PKA)磷酸化的肽，配體區(qū)域?yàn)镕HAl結(jié)構(gòu)域，供體熒光蛋白為CFP，受體熒光蛋白為YFP ;或者,傳感器區(qū)域?yàn)橛杉?xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular Signal-regulatedKinase,以下記載為ERK)磷酸化的肽，配體區(qū)域?yàn)閃ff結(jié)構(gòu)域，供體熒光蛋白為CFP，受體熒光蛋白為YFP ;或者，傳感器區(qū)域?yàn)橛衫野彼峒っ噶姿峄碾?，配體區(qū)域?yàn)镃rk蛋白的SH2結(jié)構(gòu)域，供體熒光蛋白為CFP，受體熒光蛋白為YFP。受體(供體)熒光蛋白、配體(或傳感器)結(jié)構(gòu)域、低分子量GTP結(jié)合蛋白、標(biāo)的蛋白的結(jié)合順序，從增大增益的觀點(diǎn)出發(fā)，在包含本發(fā)明的EV接頭的單分子型FRET生物傳感器中，優(yōu)選可以例舉從氨基酸末端側(cè)為YFP-FHA1-EV接頭-PKA底物肽-CFP、YFP-FHA1-EV接頭-ERK 底物肽-CFP、YFP-Raf-EV 接頭-Ras-CFP、YFP-Racl-EV 接頭-Pak-CFP、YFP-Cdc42-EV接頭-Pak-CFP、或者YFP-CRK SH2結(jié)構(gòu)域-EV接頭-酪氨酸激酶底物肽-CFP。這些中，能夠適宜地使用YFP和CFP的位置相互交換的，或者也能夠適宜地使用YFP和CFP的各種突變體，例如 Ypet、CyPet> EYFP (Clontech 公司)、ECFP (Clontech 公司)、SECFP>Venus 等。本發(fā)明的單分子型FRET生物傳感器只要是具有上述5個(gè)區(qū)域的即可，為了根據(jù)目的改變細(xì)胞內(nèi)分布，或者為了容易進(jìn)行單分子型FRET生物傳感器的精制，適宜使用在其N末端、C末端或者單分子型FRET生物傳感器內(nèi)部含有肽標(biāo)簽、其他熒光蛋白或者細(xì)胞內(nèi)定位信號(hào)、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間相互作用的結(jié)構(gòu)域等。對(duì)于上述本發(fā)明的EV接頭是否實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所期望的效果的評(píng)價(jià)，例如，基于后述的實(shí)施例1記載的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明的上述EV接頭的基因(DNA)和編碼本發(fā)明的上述單分子型FRET生物傳感器的基因(DNAXEV接頭的基因能夠化學(xué)合成，此外，上述單分子型FRET生物傳感器的基因，對(duì)于EV接頭以外的上述各構(gòu)成蛋白質(zhì)而言，能夠從GenBank等獲得基因信息，通過(guò)公知的使用PCR的方法和使用限制性內(nèi)切酶和連接酶的方法依照通常的方法制作。本發(fā)明還提供包含上述基因的表達(dá)載體。這樣的載體能夠通過(guò)下述方法獲得，即，依照公知的方法將編碼本發(fā)明的EV接頭或者單分子型FRET生物傳感器的基因插入公知的原核細(xì)胞表達(dá)載體，例如PGEX-2T (GE Healthcare公司制造)、真核細(xì)胞表達(dá)載體，例如 pCAGGS[Niwa, H., K.Yamamura, and J.Miyazak1.1991.Efficientselection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.Genel08:193-200.]、或者病毒載體，例如 pCX4 [Iwahara, T., T.Akagi, Y.Fujitsuka, andH.Hanafusa.2004.CrkII regulates focal adhesion kinase activation by makinga complex with Crk—associated substrate,pl30Cas.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.AlOl:17693-17698.]而得到。
本發(fā)明還提供保持上述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。該轉(zhuǎn)化細(xì)胞通過(guò)將上述表達(dá)載體導(dǎo)入作為對(duì)象的細(xì)胞而獲得。作為導(dǎo)入細(xì)胞中的方法，能夠使用公知的轉(zhuǎn)染法或病毒感染法，沒(méi)有特別限定，例如磷酸鈣法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、電穿孔法或者使用轉(zhuǎn)座子的方法等。作為該細(xì)胞，能夠使用真核細(xì)胞或者原核細(xì)胞，沒(méi)有特別限定。例如，作為真核細(xì)胞能夠使用來(lái)自人癌的HeLa細(xì)胞、來(lái)自人胎兒腎臟的HEK293細(xì)胞、來(lái)自狗腎臟的MDCK細(xì)胞、來(lái)自猴腎臟的C0S7細(xì)胞、大鼠C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、酵母等，作為原核細(xì)胞能夠使用大腸桿菌等及其他的各種細(xì)胞。另一方面，通過(guò)公知的方法，例如，在小鼠受精卵的核內(nèi)顯微注射質(zhì)粒DNA的方法或者利用 Tol2 轉(zhuǎn)座酶的方法[Sumiyama, K., K.Kawakami, and K.Yagita.2010.A simpleand highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2transposon systemand cytoplasmic microinjection.Genomics95:306-311.]等將上述表達(dá)載體直接導(dǎo)入小鼠等的個(gè)體中，能夠獲得轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。作為轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，只要是人以外的則沒(méi)有特別限定，能夠舉出小鼠、大鼠、豬、斑馬魚(yú)、線蟲(chóng)等。從應(yīng)用于醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選小鼠。本發(fā)明還提供測(cè)定絲氨酸-蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP結(jié)合蛋白活性的任一個(gè)的測(cè)定方法，該測(cè)定方法包括使用本發(fā)明的單分子型FRET生物傳感器檢測(cè)FRET的工序。作 為使用本發(fā)明的單分子型FRET生物傳感器檢測(cè)FRET的工序，可以舉出在熒光顯微鏡下觀察表達(dá)單分子型FRET生物傳感器的細(xì)胞株、進(jìn)行定時(shí)攝影的方法；使用流式細(xì)胞儀分析表達(dá)單分子型FRET生物傳感器的細(xì)胞株的方法等。通過(guò)這些方法就檢測(cè)本發(fā)明的單分子型FRET生物傳感器中的FRET，從而能夠測(cè)定絲氨酸_蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP結(jié)合蛋白活性。此外，本發(fā)明提供測(cè)定絲氨酸-蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性以及低分子量GTP結(jié)合蛋白活性的任一個(gè)的測(cè)定方法，該測(cè)定方法包括使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細(xì)胞或者轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物檢測(cè)FRET的工序。絲氨酸-蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性以及低分子量GTP結(jié)合蛋白活性能夠通過(guò)使用上述的能夠測(cè)定絲氨酸-蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP結(jié)合蛋白活性的任一個(gè)的具有傳感器區(qū)域和配體區(qū)域的單分子型FRET生物傳感器來(lái)測(cè)定。作為檢測(cè)FRET的工序，只要能夠檢測(cè)FRET激發(fā)能量的轉(zhuǎn)移，就沒(méi)有特別限定，例如，可以舉出使用顯微鏡的測(cè)定方法、使用流式細(xì)胞儀的測(cè)定方法、使用分光光度計(jì)的測(cè)定方法、使用熒光ELISA檢測(cè)儀的方法等。該測(cè)定方法中，檢測(cè)FRET，能夠直接測(cè)定該細(xì)胞或動(dòng)物中的絲氨酸-蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP結(jié)合蛋白活性。在這樣的情況下，能夠另外使用磷酸化特異性抗體，計(jì)算磷酸化的比例，測(cè)定對(duì)應(yīng)的FRET效率，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；或者測(cè)定GTP結(jié)合的低分子量GTP結(jié)合蛋白和由GTP的無(wú)機(jī)磷酸游離產(chǎn)生的⑶P結(jié)合的低分子量GTP結(jié)合蛋白，計(jì)算GTP/⑶P比[或者GTP/ (⑶P+DTP)比](均為摩爾比)，測(cè)定對(duì)應(yīng)的FRET效率，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用這樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)該細(xì)胞或者動(dòng)物的FRET效率，計(jì)算磷酸化、GTP/⑶P比。例如，示例如下的具體方法。在熒光顯微鏡下觀察表達(dá)本發(fā)明的單分子型FRET生物傳感器的本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細(xì)胞或者轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，直接檢測(cè)傳感器區(qū)域的結(jié)構(gòu)變化前后產(chǎn)生的FRET效率的變化。該測(cè)定方法基于(非專利文獻(xiàn)I)進(jìn)行。在轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的情況下，觀察對(duì)象優(yōu)選例如外耳等容易固定的部位。使用的熒光顯微鏡沒(méi)有特別限定，優(yōu)選具有公知的氙光源的倒置熒光顯微鏡(1X81,奧林巴斯公司生產(chǎn))上具備旋轉(zhuǎn)式突光激發(fā)濾色片和旋轉(zhuǎn)式突光發(fā)光濾色片、具備高靈敏度冷卻CXD照相機(jī)的顯微鏡。濾色片和照相機(jī)圖像優(yōu)選能夠通過(guò)MolecularDevices公司生產(chǎn)的MetaMorph圖像分析軟件控制和分析的系統(tǒng)。對(duì)上述細(xì)胞或者動(dòng)物照射供體熒光蛋白的激發(fā)光，供體熒光蛋白的熒光波長(zhǎng)下的圖像通過(guò)CCD照相機(jī)拍攝，然后，拍攝受體熒光蛋白的熒光波長(zhǎng)下的圖像。測(cè)定兩圖像的熒光強(qiáng)度的比，由此能夠計(jì)算各測(cè)定點(diǎn)的FRET效率。根據(jù)本發(fā)明，能夠提供包含本發(fā)明的EV接頭的、可以非侵襲性地測(cè)定絲氨酸-蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP結(jié)合蛋白活性的單分子型FRET生物傳感器、其基因等。能夠進(jìn)行非侵襲性活性測(cè)定是由于使用的激發(fā)光為可見(jiàn)光區(qū)域的緣故。還提供表達(dá)這樣的單分子型FRET生物傳感器、保持在非侵襲性測(cè)定絲氨酸-蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP結(jié)合蛋白活性中有用的上述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物、以及使用包含上述EV接頭的單分子型FRET生物傳感器測(cè)定絲氨酸-蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP結(jié)合蛋白活性的方法。因此，在細(xì)胞內(nèi)或者個(gè)體內(nèi)非侵襲性地獲知絲氨酸-蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP結(jié)合蛋白活性成為可能，不僅能夠理解生命現(xiàn)象，還能夠在藥劑開(kāi)發(fā)(例如，癌、自身免疫疾病、過(guò)敏性疾病等的治療劑或者預(yù)防劑)方面帶來(lái)利益。作為本發(fā)明的其他方式，提供絲氨酸-蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP結(jié)合蛋白活性調(diào)節(jié)物質(zhì)的篩選方法。即，該篩選方法為絲氨酸-蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP結(jié)合蛋白活性的任一個(gè)的調(diào)節(jié)物質(zhì)的篩選方法，包括:(a)使本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細(xì)胞與被檢物質(zhì)接觸 的工序、和(b)通過(guò)檢測(cè)FRET而檢測(cè)絲氨酸-蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP結(jié)合蛋白活性的任一個(gè)的變化的工序。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細(xì)胞是表達(dá)本發(fā)明的單分子型FRET生物傳感器、保持包含具有EV接頭的單分子型FRET生物傳感器基因的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的篩選方法，構(gòu)建表達(dá)包含本發(fā)明的EV接頭的單分子型FRET生物傳感器的細(xì)胞，使用生物檢測(cè)體系，由此能夠有效篩選使得絲氨酸-蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP結(jié)合蛋白活性變化的物質(zhì)或其鹽(即，絲氨酸-蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP結(jié)合蛋白的活性調(diào)節(jié)物質(zhì))。作為該方法中的被檢物質(zhì)沒(méi)有特別限定，例如能夠舉出肽、蛋白質(zhì)、非肽性物質(zhì)、合成物質(zhì)、發(fā)酵產(chǎn)物等。實(shí)施例以下，根據(jù)實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，但是本發(fā)明的范圍不限于這些實(shí)施例。(實(shí)施例1)由Eevee-PKA進(jìn)行的絲氨酸-蘇氨酸激酶A激酶(PKA)的酶活性測(cè)定(I)編碼用于測(cè)定PKA的酶活性的包含EV接頭的單分子型FRET生物傳感器的基因的制作(i)用于插入EV接頭基因的平臺(tái)Eevee-PKA-G72 (3520NES)基因的制作單分子型FRET生物傳感器Eevee-PKA-G72 (3520NES)基因使用PCR等公知的方法制造(圖3)。S卩，單分子型FRET生物傳感器從氨基末端依次具有YFP、接頭、配體結(jié)構(gòu)域(本例中是與磷酸化蘇氨酸特異性結(jié)合的FHAl結(jié)構(gòu)域)、接頭、由PKA磷酸化的底物序列、接頭、CFP供體熒光蛋白。說(shuō)明該堿基序列(序列號(hào):I)和預(yù)測(cè)的氨基酸序列(序列號(hào):2):ntl_714:水母(Aequorea)的 YFP (YPet)nt715_720:接頭(Leu-Glu)nt721-1143:酵母的Rad53基因的FHAl結(jié)構(gòu)域ntll44_1149:接頭(Gly-Thr)ntll50_1392:甘氨酸接頭ntl393-1437:PKA 的底物序列ntl438_1446:接頭(Gly-Gly-Arg)ntl447-2163:水母的 CFP (ECFP)nt2164_2169:接頭(Ser-Arg)nt2170-2205:核輸出信號(hào)(NES)nt2206-2208:終止密碼子(ii) EV20 接頭的合成和 Eevee-PKA-20 基因(3532NES)的制作將正義引物F_20a.a_linker (序列號(hào):3)和反義引物R_20a.a_linker (序列號(hào):4)退火，插入3520NE S的Asp7181和Aor3HI的限制性內(nèi)切酶的切斷部位。該插入的核苷酸所編碼的20個(gè)氨基酸的接頭稱為EV20接頭(序列號(hào):5)。此外，將YPet取代為Venus。所制作的單分子型FRET生物傳感器命名為Eevee-PKA-20(3532NES)。說(shuō)明該堿基序列(序列號(hào):6)和預(yù)測(cè)的氨基酸序列(序列號(hào):7):ntl-714:水母(Aequorea)的 YFP (Venus)nt715_720:接頭(Leu-Glu)nt721-1143:酵母的Rad53基因的FHAl結(jié)構(gòu)域ntll44_1149:接頭(Gly-Thr)ntll50-1209:EV20 接頭(序列號(hào):5)ntl210_1215:接頭(Ser-Gly)ntl216_1239:PKA 的底物序列ntl239-1248:接頭(Gly-Gly-Arg)ntl249-1965:水母的 CFP (ECFP)ntl966_1971:接頭(Ser-Arg)ntl972_2007:核輸出信號(hào)(NES)nt2008_2010:終止密碼子(iii) Eevee-PKA-52 (3535NES)的制作用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Asp718I切斷Eevee-PKA-20的哺乳細(xì)胞表達(dá)載體pEevee-PKA-20，將尺寸大的片段調(diào)整為載體。將該pEevee-PKA-20片段與用EcoRI和Aor3HI切斷得到的包含接頭的部分以及將正義引物F_10a.a_linker (序列號(hào):8)和反義引物R_10a.a_linker (序列號(hào):9)進(jìn)行退火得到的DNA這3者進(jìn)行連接，制作了pEevee-PKA-52。說(shuō)明該堿基序列(序列號(hào):10)和預(yù)測(cè)的氨基酸序列(序列號(hào):11):ntl_714:水母(Aequorea)的 YFP (Venus)nt715_720:接頭(Leu-Glu)
nt721-1143:酵母的Rad53基因的FHAl結(jié)構(gòu)域ntll44_1149:接頭(Gly-Thr)ntll50-1305:EV52 接頭(序列號(hào):12)ntl306_1311:接頭(Ser-Gly)ntl312_1335:PKA 的底物序列ntl336_1344:接頭(Gly-Gly-Arg)ntl345_2061:水母的 CFP (ECFP)nt2062_2067:接頭(Ser-Arg)nt2068_2103:核輸出信號(hào)(NES)nt2104_2106:終止密碼子(iv)pEevee-PKA-84 (3537NES)的制作用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Asp718I切斷Eevee-PKA-20的哺乳細(xì)胞表達(dá)載體pEevee-PKA-20，將尺寸大的片段調(diào)整為載體。將該pEevee-PKA-20片段與用EcoRI和Aor3HI切斷的含有接頭的部分以及將正義引物F_10a.a_linker (序列號(hào):8)和反義引物R_10a.a_linker (序列號(hào):9)進(jìn)行退火得到的DNA這3者進(jìn)行連接,制作了 Eevee_PKA_84。說(shuō)明該堿基序列(序列號(hào):13)和預(yù)測(cè)的氨基酸序列(序列號(hào):14):
ntl_714:水母(Aequorea)的 YFP (Venus)nt715_720:接頭(Leu-Glu)nt721-1143:酵母的Rad53基因的FHAl結(jié)構(gòu)域ntll44_1149:接頭(Gly-Thr)ntll50-1401:EV84 接頭(序列號(hào):15)ntl402_1407:接頭(Ser-Gly)nt 1408-1431:PKA 的底物序列ntl432_1440:接頭(Gly-Gly-Arg)ntl441-2157:水母的 CFP (ECFP)nt2158-2163:接頭(Ser-Arg)nt2164_2199:核輸出信號(hào)(NES)nt2200_2202:終止密碼子(v)pEevee-PKA-116 (3536NES)的制作用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Asp718I切斷Eevee-PKA-52的哺乳細(xì)胞表達(dá)載體pEevee-PKA-20，將尺寸大的片段調(diào)整為載體。將該pEevee-PKA-52片段與用EcoRI和Aorl3HI切斷的包含接頭的部分以及將正義引物F_10a.a_linker (序列號(hào):8)和反義引物R_10a.a_linker(序列號(hào):9)進(jìn)行退火得到的DNA這3者進(jìn)行連接，制作了 Eevee-PKA-116。說(shuō)明該堿基序列(序列號(hào):16)和預(yù)測(cè)的氨基酸序列(序列號(hào):17):ntl_714:水母(Aequorea)的 YFP (YPet)nt715_720:接頭(Leu-Glu)nt721-1143:酵母的Rad53基因的FHAl結(jié)構(gòu)域ntll44_1149:接頭(Gly-Thr)ntll50-1497:EV116 接頭(序列號(hào):18)
ntl498_1503:接頭(Ser-Gly)ntl504-1527:PKA 的底物序列ntl528-1536:接頭(Gly-Gly-Arg)nt 1537-2247:水母的 CFP (ECFP)nt2248-2253:接頭(Ser-Arg)nt2254_2289:核輸出信號(hào)(NES)nt2290-2292:終止密碼子(vi)pEevee-PKA-5 (3522NES)的制作單分子型FRET生物傳感器pEevee-PKA-5使用PCR等公知的方法制作，說(shuō)明該堿基序列(序列號(hào):19)和預(yù)測(cè)的氨基酸序列(序列號(hào):20):ntl-714:水母(Aequorea)的 YFP (Venus)nt715_720:接頭(Leu-Glu)nt721-1143:酵母的Rad53基因的FHAl結(jié)構(gòu)域ntl 144-170:接頭(Gly-Thr-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly)ntll71_1194:PKA 的底物序列ntll95_1203:接頭(Gly-Gly-Arg)ntl204_1920:水母的 CFP (ECFP)ntl921_1926:接頭(Ser-Arg)ntl927_1962:核輸出信號(hào)(NES)ntl963_1965:終止密碼子(vii) pEevee-PKA-lSO (3597NES)的制作用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Asp718I切斷pEevee-PKA-116，將尺寸大的片段調(diào)整為載體。將該pEevee-PKA-116片段與用EcoRI和Aor3HI切斷的包含接頭的部分以及將正義弓丨物F_10a.a_linker (序列號(hào):8)和反義引物R_10a.a_linker (序列號(hào):9)進(jìn)行退火得到的DNA這3者進(jìn)行連接，制作了 Eevee-PKA-180。并將Venus取代為YPet。說(shuō)明該堿基序列(序列號(hào):21)和預(yù)測(cè)的氨基酸序列 (序列號(hào):22):ntl-714:水母(Aequorea)的 YFP (YPet)nt715_720:接頭(Leu-Glu)nt721-1143:酵母的Rad53基因的FHAl結(jié)構(gòu)域ntll44_1149:接頭(Gly-Thr)ntll50-1689:EV180 接頭(序列號(hào):23)ntl690_1695:接頭(Ser-Gly)ntl696-1719:PKA 的底物序列ntl720-1728:接頭(Gly-Gly-Arg)ntl729-2439:水母的 CFP (ECFP)nt2440_2445:接頭(Ser-Arg)nt2446_2481:核輸出信號(hào)(NES)nt2482-2484:終止密碼子(vii)pEevee-PKA-244 (3598NES 的制作)
用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Asp718I切斷pEevee-PKA-116，將尺寸大的片段調(diào)整為載體。將該pEevee-PKA-116片段與用EcoRI和Aor3HI切斷的包含接頭的部分以及將正義弓丨物F_10a.a_linker (序列號(hào):8)和反義引物R_10a.a_linker (序列號(hào):9)進(jìn)行退火得到的DNA這3者進(jìn)行連接，制作了 Eevee-PKA-244。說(shuō)明該堿基序列(序列號(hào):24)和預(yù)測(cè)的氨基酸序列(序列號(hào):25):ntl-714:水母(Aequorea)的 YFP (YPet)nt715_720:接頭(Leu-Glu)nt721-1143:酵母的Rad53基因的FHAl結(jié)構(gòu)域ntll44_1149:接頭(Gly-Thr)ntll50-1881:EV244 接頭(序列號(hào):26)ntl882_1887:接頭(Ser-Gly)nt 1888-1911:PKA 的底物序列ntl912-1920:接頭(Gly-Gly-Arg)ntl921-2631:水母的 CFP (ECFP)nt2632_2637:接頭(Ser-Arg)nt2638_2673:核輸出信號(hào)(NES)nt2674-267 6:終止密碼子(2)包含EV接頭的單分子型FRET生物傳感器(Eevee-PKA)在哺乳類細(xì)胞中的表達(dá)和由定時(shí)熒光顯微鏡進(jìn)行的分析在此，將具有各種長(zhǎng)度的EV接頭的PKA的生物傳感器總稱為Eevee-PKA，將其哺乳細(xì)胞表達(dá)載體總稱為pEevee-PKA。作為哺乳細(xì)胞表達(dá)載體使用pCAGGS[Niwa，H.，K.Yamamura, and J.Miyazak1.1991.Efficient selection for high—expressiontransfectants with a novel eukaryotic vector.Genel08:193-200.]。來(lái)自宮頸癌的HeLa細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(INVITR0GEN公司生產(chǎn))中培養(yǎng)。使用293fectin (INVITR0GEN公司生產(chǎn))，根據(jù)該試劑附加的操作方法將上述(I)中得到的pEevee-PKA轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染后的HeLa細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(INVITR0GEN公司生產(chǎn))中培養(yǎng)，使Eevee-PKA蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，通過(guò)定時(shí)熒光顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞。該顯微鏡是具備旋轉(zhuǎn)式熒光激發(fā)濾色裝置和旋轉(zhuǎn)式熒光發(fā)光濾色裝置(LUDLelectronic公司生產(chǎn))、還具備高靈敏度冷卻C⑶照相機(jī)(NIPPON ROPER公司生產(chǎn)CooISNAP-HQ)的、具有氙光源的倒置熒光顯微鏡(奧林巴斯公司生產(chǎn)，1X81)，觀察時(shí)，該顯微鏡的控制和觀察結(jié)果的分析使用由日本Molecular Devices公司生產(chǎn)的MetaMorph圖像分析軟件進(jìn)行的系統(tǒng)。熒光激發(fā)濾色片、熒光發(fā)光濾色片、分色鏡從Omega公司購(gòu)入。 對(duì)上述培養(yǎng)細(xì)胞照射440nm的激發(fā)光，由CXD照相機(jī)拍攝在480nm的CFP供體的熒光波長(zhǎng)下的圖像，接著，照射在530nm的YFP受體的熒光波長(zhǎng)下的圖像。根據(jù)兩圖像數(shù)據(jù)求出兩者的熒光強(qiáng)度比，作為各測(cè)定點(diǎn)的FRET效率的指標(biāo)。通過(guò)添加作為PKA活化劑的ImM的聯(lián)丁?；鵦AMP并與刺激前的FRET效率比較，就能夠知道Eevee-PKA的增益。如圖4所示，由PKA的活化而變化的增益,通過(guò)使用52個(gè)氨基酸以上的長(zhǎng)度的EV接頭而顯著增加。
此外，將YFP供體蛋白設(shè)為最適于FRET的物質(zhì)，例如為YPet，效果更顯著(圖6)。但是，該效果在116個(gè)氨基酸時(shí)幾乎飽和，即使比其更長(zhǎng)也沒(méi)有顯著的效果。為了研究該增益增大的原因，測(cè)定了基礎(chǔ)狀態(tài)的熒光曲線(圖7A、B和C)。可知隨著EV接頭變長(zhǎng)，基礎(chǔ)狀態(tài)的YFP供體蛋白質(zhì)的熒光減少。即，可知EV接頭通過(guò)減少基礎(chǔ)狀態(tài)的FRET而得到高的增益。該效果一直持續(xù)直至達(dá)到244個(gè)氨基酸。(3)由免疫印跡法分析Eevee-PKA的磷酸化水平與上述同樣在HeLa細(xì)胞中表達(dá)Eevee-PKA，24小時(shí)后，用ImM的聯(lián)丁?；鵦AMP和50nM花萼海綿誘癌素處理之后，用公知的方法將細(xì)胞可溶化，通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行分離。其中，在蛋白質(zhì)分離中使用含有50μΜ PhosTag (PhosTag企業(yè)集團(tuán))的6%聚丙烯酸酰胺凝膠。轉(zhuǎn)印到PVDF膜(Millipore公司生產(chǎn))之后，與ant1-GFP抗體(自家制)反應(yīng)，接著，用IRDye800CW標(biāo)記抗兔抗體(L1-C0R公司制造)檢測(cè)Eevee-PKA蛋白質(zhì)。結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體通過(guò)Odyssey熒光分析儀(L1-C0R公司生產(chǎn))定量。如圖8A和圖8B所示，EV接頭顯著減少基礎(chǔ)狀態(tài)的磷酸化水平。即，配體結(jié)構(gòu)域通常因與傳感器結(jié)構(gòu)域結(jié)合而具有阻礙活化狀態(tài)的傳感器區(qū)域返回基礎(chǔ)狀態(tài)的效果，但是EV接頭使得該效果降低，由此使基礎(chǔ)狀態(tài)的FRET降低，這就導(dǎo)致增益的增大。(實(shí)施例2)由Eevee-Akt進(jìn)行的絲氨酸-蘇氨酸激酶Akt的酶活性測(cè)定(I)編碼用于測(cè)定絲氨酸-蘇氨酸激酶Akt的酶活性的包含EV接頭的單分子型FRET生物傳感器的基因的制作利用合成引物等制作了將Eevee-Akt-84 (3547NES)和 Eevee-Akt-116 (3548NES)的PKA底物序列部位取代為適宜Akt的磷酸化的氨基酸序列的基因。將該序列插入上述Eevee-PKA中，并且在氨 基末端插入Akt的PH結(jié)構(gòu)域，表示由此制作得到的基因Eevee-Akt-84和Eevee-Akt-116的堿基序列(序列號(hào):27，29)和預(yù)測(cè)的氨基酸序列(序列號(hào):28，30)。此外，其結(jié)構(gòu)如圖9A和B所示。Eevee-Akt-84 (3547NES)nt 1-453:Akt 蛋白的 AH 結(jié)構(gòu)域nt454_462:接頭(Glu-Phe-Gly)nt463_l 176:水母(Aequorea)的 YFP (YPet)ntll77_1182:接頭(Leu-Glu)ntl 183-1605:酵母的Rad53基因的FHAl結(jié)構(gòu)域ntl606_1611:接頭(Gly-Thr)ntl612_1863:EV84 接頭ntl864_l869:接頭(Ser-Gly)ntl870-1902:PKA 的底物序列ntl903_1911:接頭(Gly-Gly-Arg)ntl912-2622:水母的 CFP (ECFP)nt2623_2628:接頭(Ser-Arg)nt2629_2664:核輸出信號(hào)(NES)nt2665-2667:終止密碼子
Eevee-Akt-116 (3548NES)nt 1-453:Akt 蛋白的 AH 結(jié)構(gòu)域nt454_462:接頭(Glu-Phe-Gly)nt463_l 176:水母(Aequorea)的 YFP (YPet)ntll77_1182:接頭(Leu-Glu)ntl 183-1605:酵母的Rad53基因的FHAl結(jié)構(gòu)域ntl606_1611:接頭(Gly-Thr)ntl612-1959:EV116 接頭ntl864_l965:接頭(Ser-Gly)nt 1870-1998:PKA 的底物序列ntl903-2007:接頭(Gly-Gly-Arg)ntl912-2718:水母的 CFP (ECFP)nt2623_2724:接頭(Ser-Arg)nt2629_2760:核輸出信號(hào)(NES)
nt2665-2763:終止密碼子(2)包含EV接頭的單分子型FRET生物傳感器(Eevee-Akt)在哺乳類細(xì)胞中的表達(dá)和由定時(shí)熒光顯微鏡進(jìn)行的分析采用實(shí)施例1-(2)記載的方法進(jìn)行分析，但是細(xì)胞使用C0S7細(xì)胞。如圖10所示，116個(gè)氨基酸的EV接頭能夠顯著降低基礎(chǔ)狀態(tài)。(實(shí)施例3)由Eevee-ERK進(jìn)行的ERK的酶活性測(cè)定(I)編碼用于ERK的酶活性測(cè)定的包含EV接頭的單分子型FRET生物傳感器Eevee-ERK (3550NES)的基因的制作(i)利用PCR和合成引物制作了將Eevee-PKA-116的底物序列部位和磷酸化蛋白質(zhì)識(shí)別序列取代為ERK的底物序列的質(zhì)粒。制作得到的質(zhì)粒命名為Eevee-ERK，說(shuō)明該堿基序列(序列號(hào):31)和預(yù)測(cè)的氨基酸序列(序列號(hào):32):ntl-714:水母(Aequorea)的 YFP (YPet)nt715_720:接頭(Leu-Glu)nt721_882:Pinl 基因的 Wff 區(qū)域ntl 144-888:接頭(Gly-Thr)ntll50-1236:EV116 接頭ntl498_1242:接頭(Ser-Gly)ntl504-1272:ERK 的底物序列ntl528-1281:接頭(Gly-Gly-Arg)ntl537-1992:水母的 CFP (ECFP)nt2248_2004:接頭(Gly-Arg-Ser-Arg)nt2254_2040:核輸出信號(hào)(NES)nt2290-2043:終止密碼子(ii)也同樣制作了在ERK底物中添加特有的錨定序列的載體，命名為Eevee-ERK-DS (3560NES)。說(shuō)明該堿基序列(序列號(hào):33)和預(yù)測(cè)的氨基酸序列(序列號(hào):34):ntl-714:水母(Aequorea)的 YFP (YPet)nt715_720:接頭(Leu-Glu)nt721_882:Pinl 基因的 Wff 結(jié)構(gòu)域nt883_888:接頭(Gly-Thr)nt889-1236:EV116 接頭ntl237_1242:接頭(Ser-Gly)nt l243_1272:ERK 的底物序列ntl273_1284:接頭(Ala-Lys-Leu-Ser)ntl285_1296:鋪定序列(Phe-Gln-Phe-Pro)ntl297-1305:接頭(Gly-Gly-Arg)ntl306-2016:水母的 CFP (ECFP)nt2017_2028:接頭(Gly-Arg-Ser-Arg)nt2029_2064:核輸出信號(hào)(NES)nt2065-2067:終止密碼子(2)包含EV接頭的單分子型FRET生物傳感器(Eevee-ERK)在哺乳類細(xì)胞中的表達(dá)和由定時(shí)熒光顯微鏡進(jìn)行的分析采用實(shí)施例1- (2)記載的方法進(jìn)行分析。S卩，在HeLa細(xì)胞中表達(dá)Eevee-ERK，用EGF刺激。如圖11A、B、C和D所示，具有EV接頭的生物傳感器(3560NES)比包含Gly接頭的生物傳感器(EKAR-1667nes)具有更大的增益。該效果的原因之一是起因于基礎(chǔ)狀態(tài)的FRET降低。(實(shí)施例4)由包含EV接頭的單分子型FRET生物傳感器Picchu-734進(jìn)行的酪氨酸激酶活性測(cè)定(I)用于測(cè)定酪氨酸激酶活性用的包含EV接頭的單分子型FRET生物傳感器Picchu-734 的制作(i)將包含CrkII蛋白的SH2結(jié)構(gòu)域的區(qū)域由PCR擴(kuò)增并插入由XhoI和Asp718I切斷Eevee-PKA-116 (3536NES)得到片段中。并取代底物序列部位，制作了 Picchu-734的基因。說(shuō)明該堿基序列(序列號(hào):35)和預(yù)測(cè)的氨基酸序列(序列號(hào):36):ntl-714:水母(Aequorea)的 YFP (YPet)nt715_720:接頭(Leu-Glu)nt721-1332 =CRKII 基因的 SH2 結(jié)構(gòu)域nt883_1338:接頭(Gly-Thr)nt889-1686:EV116 接頭ntl237_1692:接頭(Ser-Gly)ntl243-1719 =CRKII的酪氨酸磷酸化底物序列ntl273-1728:接頭(Ala-Lys-Leu-Ser)ntl306-2439:水母的 CFP (ECFP)
nt2017-2451:接頭(Gly-Arg-Ser-Arg)nt2029_2487:核輸出信號(hào)(NES)nt2065_2490:終止密碼子(2)用于測(cè)定酪氨酸激酶活性的包含EV接頭的單分子型FRET生物傳感器Picchu-734在哺乳類細(xì)胞中的表達(dá)和由定時(shí)熒光顯微鏡進(jìn)行的分析采用實(shí)施例3- (2)記載的方法進(jìn)行分析。如圖12所示，可知包含EV接頭的Picchu生物傳感器(Picchu-734)與不含該接頭的Picchu生物傳感器(Picchu_730)[Kurokawa, K., N.Mochizuki, Y.0hba, H.Mizuno, A.Miyawaki, and M.Matsuda.2001.A pairof FRET—based probes for tyrosine phosphorylation of the CrkII adaptor proteinin viv0.J.Biol.Chem.276:31305-31310.]相比具有更大的增益。(實(shí)施例5)由Raichu-Racl進(jìn)行的Racl活性測(cè)定(I)用于測(cè)定Racl活性的含有EV接頭的單分子型FRET生物傳感器Raichu-Racl(2246X)的制作(i)使用PCR等，以已知的Raichu-Racl (IOllX)(非專利文獻(xiàn)5)為基礎(chǔ)制作了測(cè)定Racl活性的單分子型FRET生物傳感器Raichu-Racl(2241X)。說(shuō)明該堿基序列(序列號(hào):37)和預(yù)測(cè)的氨基酸序列(序列號(hào):38):ntl-714:水 母(Aequorea)的 YFP (YPet)nt715_720:接頭(Leu-Glu)nt721-969:Pak 蛋白的 CRIB 結(jié)構(gòu)域nt883_996:甘氨酸接頭ntl237-1527 =Raclntl273_1536:接頭(Arg-Gly-Arg)ntl306_2247:水母的 CFP (Turquoise)ntl273-2253:接頭(Ser-Arg)nt2017-231 3:KRas蛋白的C末端結(jié)構(gòu)域nt2065-2316:終止密碼子(ii)以Raichu-Racl (2241X)為基礎(chǔ)，通過(guò)替換接頭而制作了測(cè)定Racl活性的包含EV接頭的單分子型FRET生物傳感器Raichu-Racl (2246X)。說(shuō)明該堿基序列(序列號(hào):39)和預(yù)測(cè)的氨基酸序列(序列號(hào):40):ntl-714:水母(Aequorea)的 YFP (YPet)nt715_720:接頭(Leu-Glu)nt721-969:Pak 蛋白的 CRIB 結(jié)構(gòu)域nt970-1332:EV116 接頭ntl333-1860:Raclntl861_1869:接頭(Arg-Gly-Arg)ntl870_2580:水母的 CFP (Turquoise)nt2581_2586:接頭(Ser-Arg)nt2587-2646:KRas蛋白的C末端結(jié)構(gòu)域
nt2647-2649:終止密碼子(2)用于測(cè)定Racl活性的包含EV接頭的單分子型FRET生物傳感器Raichu-Racl在哺乳類細(xì)胞中的表達(dá)和由定時(shí)熒光顯微鏡進(jìn)行的分析采用實(shí)施例3- (2)記載的方法進(jìn)行分析。如圖13A和圖13B所示，具有EV接頭的Raichu生物傳感器(Raichu_2246X)比具有通常的接頭的Raichu生物傳感器(Raichu-2241X)在基礎(chǔ)狀態(tài)下的FRET降低，EGF刺激下觀察到的上升，即靈敏度大幅上升。(3)穩(wěn)定表達(dá)Raichu-Racl (2246X)的細(xì)胞株的建立將Raichu-Racl (2246X)的基因插入pPB質(zhì)粒中。將該質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體(pCMV-mPBase) [Yusa, K.，R.Rad, J.Takeda, and A.Bradley.2009.Generation oftransgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon.Nat.Methods6:363-369.]同時(shí)轉(zhuǎn)染 C6 細(xì)胞,2 天后，添加 10 μ g/ml 濃度的 Blasticidine(殺稻瘟菌素)，繼續(xù)培養(yǎng)2周。之后，在96孔培養(yǎng)皿中進(jìn)行克隆。其結(jié)果，成功建立了穩(wěn)定表達(dá)生物傳感器的培養(yǎng)細(xì)胞株。使用該細(xì)胞株能夠長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)控Racl活性。(圖14A、B、C和D)。(實(shí)施例6)由Raichu_Cdc42 (2253X)進(jìn)行的 Cdc42 活性測(cè)定(I)用于測(cè)定Cdc42活性的包含EV接頭的單分子型FRET生物傳感器Raichu-Cdc42 (2253X)的制作(i)使用PCR等，以已知的Raichu_Cdc42 (1054X)為基礎(chǔ)制作了測(cè)定Cdc42活性的單分子型FRET生物傳感器Ra ichu-Cdc42 (2253X)。說(shuō)明該堿基序列(序列號(hào):41)和預(yù)測(cè)的氨基酸序列(序列號(hào):42):ntl-714:水母(Aequorea)的 YFP (YPet)nt715_720:接頭(Leu-Glu)nt721-969:Pak 蛋白的 CRIB 結(jié)構(gòu)域nt970-1332:EV116 接頭ntl333-1857:Cdc42ntl858_1866:接頭(Arg-Gly-Arg)ntl867-2577:水母的 CFP (Turquoise)nt2578_2583:接頭(Ser-Arg)nt2584-2643:KRas蛋白的C末端結(jié)構(gòu)域nt2644-2646:終止密碼子(2)用于測(cè)定Cdc42活性的包含EV接頭的單分子型FRET生物傳感器Raichu-Cdc42在哺乳類細(xì)胞中的表達(dá)和由定時(shí)熒光顯微鏡進(jìn)行的分析采用實(shí)施例3- (2)記載的方法進(jìn)行分析。如圖15A到圖15C所示，該生物傳感器也觀察到基礎(chǔ)狀態(tài)下低的FRET，迄今為止難以檢測(cè)的EGF刺激依賴性Cdc42的活化能夠以高靈敏度檢測(cè)出來(lái)。(實(shí)施例8)由Raichu-HRas (3705X)進(jìn)行的 HRas 活性測(cè)定(I)用于測(cè)定HRas活性的含有EV接頭的單分子型FRET生物傳感器Raichu-HRas(3705X)的制作(i)使用 PCR 等,以已知的 Raichu-HRas [Mochizuki, N., S.Yamashita, K.Kurokawa, Y.0hba, T.Nagai, A.Miyawaki, and M.Matsuda.2001.Spacio-temporal imagesof growth factor-1nduced activation of Ras and Rapl.Nature411:1065-1068.]為基礎(chǔ)制作了測(cè)定HRas活性的單分子型FRET生物傳感器Raichu-HRas (3705X)。說(shuō)明制作的基因Raichu-HRas (3705X)的堿基序列(序列號(hào):43)和預(yù)測(cè)的氨基酸序列(序列號(hào):44):ntl-714:水母(Aequorea)的 YFP (YPet)nt715_720:接頭(Leu-Glu)nt721_1236:HRas 蛋白質(zhì)ntl237-1602:EV116 接頭ntl603-1845:Raf 蛋白的 RBD 結(jié)構(gòu)域ntl846_1854:接頭(Gly-Gly-Arg)ntl855-2565:水母的 CFP (Turquoise)nt2566_2571:接頭(Ser-Arg)nt2584-2631:KRas蛋白的C末端結(jié)構(gòu)域n t2632-2634:終止密碼子(2)用于測(cè)定HRas活性的包含EV接頭的單分子型FRET生物傳感器Raichu-HRas在哺乳類細(xì)胞中的表達(dá)和由定時(shí)熒光顯微鏡進(jìn)行的分析通過(guò)實(shí)施例3- (2)記載的方法進(jìn)行分析。圖16A和B表示定時(shí)FRET成像的數(shù)據(jù)。可知相比于原型的 HRas [Mochizuki, N., S.Yamashita, K.Kurokawa, Y.0hba, T.Nagai, A.Miyawaki, and M.Matsuda.2001.Spacio-temporal images of growth factor-1nducedactivation of Ras and Rapl.Nature411:1065-1068.],能夠在更期檢測(cè)出更強(qiáng)的活性。(實(shí)施例10)表達(dá)Eevee-ERK (3560NES)和 Eevee-PKA (3536NES)的轉(zhuǎn)基因小鼠的制作(I)編碼用于測(cè)定ERK和PKA的酶活性的包含EV接頭的單分子型FRET生物傳感器Eevee-ERK (3560NES)和Eevee-PKA (3536NES)的基因向受精卵的顯微注射將包含實(shí)施例1記載的Eevee-PKA (3536NES)或者實(shí)施例3記載的Eevee-ERK(3560NES)基因的哺乳細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒插入具有轉(zhuǎn)座子識(shí)別序列的質(zhì)粒pT2A中。將該質(zhì)粒和Tol2轉(zhuǎn)座子如已經(jīng)報(bào)道的那樣進(jìn)行顯微注射[Sumiyama, K., K.Kawakami, andK.Yagita.2010.A simple and highly efficient transgenesis method in mice withthe Tol2transposon system and cytoplasmic microinjection.Genomics95:306-311.]。(2)表達(dá)生物傳感器的轉(zhuǎn)基因小鼠的篩選出生的小鼠用420nm的LED照射，使用470nm短波長(zhǎng)截止濾色片，用彩色數(shù)碼照相機(jī)拍攝，通過(guò)確認(rèn)綠色熒光能夠容易地鑒定出發(fā)生了重組的小鼠。此外，通過(guò)以實(shí)施例1記載的熒光顯微鏡對(duì)胎兒的矢狀切面的FRET圖像進(jìn)行拍攝，能夠研究ERK或者PKA活性的空間分布(圖17)。(實(shí)施例11)使用表達(dá)Eevee-ERK (3560NES)的細(xì)胞株的藥劑感受性試驗(yàn)(I)穩(wěn)定表達(dá)編碼用于測(cè)定ERK的酶活性的包含EV接頭的單分子型FRET生物傳感器Eevee-ERK (3560NES)的基因的細(xì)胞株的建立將實(shí)施例3記載的包含Eevee-ERK (3560NES)基因的哺乳細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒插入具有轉(zhuǎn)座子識(shí)別序列的質(zhì)粒中。將該質(zhì)粒與轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體如已報(bào)告的那樣進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，以殺稻痕菌素(blasticidin)選擇生物傳感器表達(dá)細(xì)胞株[Yusa, K., R.Rad, J.Takeda, andA.Bradley.2009.Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stemcells by the piggyBac transposon.Nat.Methods6(5):363-369]。(2)用穩(wěn)定表達(dá)生物傳感器的細(xì)胞株進(jìn)行FRET測(cè)定在96孔培養(yǎng)皿中接種培養(yǎng)細(xì)胞株，加入梯度稀釋的抑制劑，之后用25ng/ml的EGF刺激。30分鐘后，如實(shí)施例3所記載的那樣測(cè)定ERK活性(圖18A 圖18H)。對(duì)30個(gè)以上的細(xì)胞測(cè)定ERK活性，將平均值制成圖表。使用的抑制劑是EGF受體抑制劑(AG1478)、MEK抑制劑(PD15035、PD184351), BRAF抑制劑(PLX4720)、磷脂酰肌醇3-磷酸激酶的抑制劑(LY294002)、RSK 的抑制劑(B1-D1870)、JNK 的抑制劑(JNK inhibitor VIII )。結(jié)果，在HeLa細(xì)胞中，EGF依賴性的ERK活性被EGE受體(AG1478)和MEK抑制劑(PD153035、PD184352)有效抑制。使用活細(xì)胞能夠非常容易地測(cè)定EGF依賴性的ERK活性被這些抑制劑濃度依賴性地抑制。(實(shí)施例12)使用表達(dá)Eevee-PKA (3536NES)的轉(zhuǎn)基因小鼠的藥劑感受性試驗(yàn)(I)表達(dá)Eevee-PKA (3536NES)的轉(zhuǎn)基因小鼠的小腸成像用異氟醚麻醉實(shí)施例10制作的表達(dá)Eevee-PKA (3536NES)的轉(zhuǎn)基因小鼠，用奧林巴斯公司制造的倒置雙光子顯微鏡IX81/FV1000對(duì)小腸進(jìn)行定時(shí)攝影。使用SpectraPhysics公司制造的鈦寶石脈沖激光系統(tǒng)Mai Tai DeepSee HP,以840nm激發(fā)細(xì)胞,通過(guò)BA460-500 (奧林巴斯)熒光過(guò)濾器取得CFP的熒光，通過(guò)BA520-560 (奧林巴斯)熒光濾色片獲取YFP的熒光，如實(shí)施例3所記載的那樣制作了 FRET圖像。(2)在活小鼠中的藥劑效果的可視化對(duì)小鼠分別靜脈注射磷酸二酯酶的抑制劑茶堿和環(huán)腺苷三磷酸的類似物布拉地新，測(cè)定PKA活性。如圖19和20所示，分別在肌間神經(jīng)細(xì)胞、腸道平滑肌、血管平滑肌中的PKA的活性變化能夠?qū)崟r(shí)可視化。(實(shí)施例13)如果增長(zhǎng)接頭的長(zhǎng)度，則有可能容易引起蛋白酶的分解。因此，制作了從接頭中減少甘氨酸、增加容易獲取α -螺旋的丙氨酸的接頭EV3X8和EV6X4，研究增益。(I) (i) Eevee-PKA-3X8 (3676NES)的制作與實(shí)施例1 (I) (iii)同樣，用限制性內(nèi)切酶Asp718I和Aorl3HI切斷Eevee-PKA-20的哺乳細(xì)胞表達(dá)載體pEevee-PKA-20，將尺寸大的片段調(diào)整為載體。合成在對(duì)應(yīng)于EV3 X 8接頭(序列號(hào):45)的DNA的兩端添加有限制性內(nèi)切酶Asp718I和Aorl3HI的酶切位點(diǎn)的DNA。用Asp718I和Aorl3HI切斷該DNA，將其作為插入序列使用。將插入序列與載體連接，制作了 pEeVee-PKA-3X8。說(shuō)明該堿基序列(序列號(hào):47)和預(yù)測(cè)的氨基酸序列(序列號(hào):48):ntl-714:水母(Aequorea)的 YFP (YPet)nt715_720: 接頭(Leu-Glu)
nt721-1143:酵母的Rad53基因的FHAl結(jié)構(gòu)域ntll44_1149:接頭(Gly-Thr)ntll50-1551:EV3X8 接頭(序列號(hào):45)ntl552_1557:接頭(Ser-Gly)ntl558-1581:PKA 的底物序列ntl582-1590:接頭(Gly-Gly-Arg)ntl591-2307:水母的 ECFPnt2308_2313:接頭(Ser-Arg)nt2314_2349:核輸出信號(hào)(NES)nt2350-2352:終止密碼子
`
(I) (ii) Eevee-PKA-6X4 (3677NES)的制作用限制性內(nèi)切酶Asp718I和Aorl3HI切斷Eevee-PKA-20的哺乳細(xì)胞表達(dá)載體pEevee-PKA-20，將尺寸大的片段調(diào)整為載體。合成在對(duì)應(yīng)于EV6X4接頭(序列號(hào):46)的DNA的兩端添加有限制性內(nèi)切酶Asp718I和Aorl3HI的酶切位點(diǎn)的DNA。用Asp718I和Aorl3HI切斷該DNA，將其作為插入序列使用。將插入序列與載體連接，制作了pEevee-PKA-6X40說(shuō)明該堿基序列(序列號(hào):49)和預(yù)測(cè)的氨基酸序列(序列號(hào):50):ntl-714:水母(Aequorea)的 YFP (YPet)nt715_720:接頭(Leu-Glu)nt721-1143:酵母的Rad53基因的FHAl結(jié)構(gòu)域ntll44_1149:接頭(Gly-Thr)ntll50-1521:EV6X4 接頭(序列號(hào):46)ntl522_1527:接頭(Ser-Gly)ntl528-1551:PKA 的底物序列ntl552-1560:接頭(Gly-Gly-Arg)ntl561-2277:水母的 ECFPnt2278-2283:接頭(Ser-Arg)nt2284_2319:核輸出信號(hào)(NES)nt2320-2322:終止密碼子(2)與實(shí)施例1同樣研究增益，可知EV3X8和EV6X4具有與116個(gè)氨基酸相匹敵的增益(圖21)。工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明，提供能夠非侵襲性地測(cè)定絲氨酸-蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP結(jié)合蛋白的活性等的EV接頭和包含該EV接頭的單分子型FRET生物傳感器；編碼該EV接頭和生物傳感器進(jìn)行的基因；包含該基因的表達(dá)載體；表達(dá)上述生物傳感器、保持對(duì)非侵襲性測(cè)定絲氨酸-蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP結(jié)合蛋白的活性有用的上述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物；使用上述生物傳感器的絲氨酸-蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP結(jié)合蛋白的活性的測(cè)定方法；以及絲氨酸-蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP結(jié)合蛋白的活性調(diào)節(jié)物質(zhì)的篩選方法。
權(quán)利要求
1.一種接頭，其為基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理的單分子型FRET生物傳感器的接頭，所述接頭的特征在于: 其為包括52個(gè)氨基酸殘基以上、400個(gè)氨基酸殘基以下的多肽，總氨基酸殘基數(shù)的至少45%為甘氨酸和丙氨酸的至少任一個(gè)，丙氨酸在總氨基酸殘基數(shù)中含有至少10%。
2.如權(quán)利要求1所述的接頭，其特征在于: 其為包括84個(gè)氨基酸殘基以上的多肽。
3.如權(quán)利要求1或2所述的接頭，其特征在于: 絲氨酸和蘇氨酸的至少任一個(gè)在總氨基酸殘基數(shù)中含有至少10%。
4.如權(quán)利要求3所述的接頭，其特征在于: 總氨基酸殘基數(shù)的至少95%由甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和丙氨酸構(gòu)成，甘氨酸含有35 65%，絲氨酸和蘇氨酸的至少任一個(gè)含有10 40%，丙氨酸含有10 40%。
5.如權(quán)利要求4所述的接頭，其特征在于: 總氨基酸序列的至少95%為由SAGG和GGAS的任一個(gè)的氨基酸序列的重復(fù)構(gòu)成，SAGG和GGAS的任一個(gè)的氨基酸序列的重復(fù)單元含有13個(gè)以上、100個(gè)以下。
6.如權(quán)利要求1或2所述的接頭，其特征在于: 精氨酸和谷氨酸的至少任一個(gè)在總氨基酸殘基數(shù)中含有至少10%。
7.如權(quán)利要求6所述的接頭，其特征在于: 總氨基酸殘基數(shù)的至少95%由甘氨酸、精氨酸、谷氨酸和丙氨酸構(gòu)成，甘氨酸含有4 30%，精氨酸含有5 30%，谷氨酸含有5 30%，丙氨酸含有30 60%。
8.一種基因，其特征在于: 編碼權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述的接頭。
9.一種表達(dá)載體，其特征在于: 包含編碼權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述的接頭的基因。
10.一種轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其特征在于: 保持權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體。
11.一種轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其特征在于: 保持權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體。
12.—種單分子型FRET生物傳感器，其為基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理的單分子型FRET生物傳感器，其特征在于: 其為具有傳感器區(qū)域、配體區(qū)域、受體熒光蛋白區(qū)域、供體熒光蛋白區(qū)域和連接該傳感器區(qū)域與該配體區(qū)域的接頭區(qū)域的融合蛋白，該接頭區(qū)域由權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述的接頭構(gòu)成。
13.如權(quán)利要求12所述的單分子型FRET生物傳感器，其特征在于:該供體熒光蛋白為YPet。
14.一種基因，其特征在于: 編碼權(quán)利要求12或13中任一項(xiàng)所述的單分子型FRET生物傳感器。
15.—種表達(dá)載體,其特征在于: 包含編碼權(quán)利要求14所述的單分子型FRET生物傳感器的基因。
16.一種轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其特征在于:保持權(quán)利要求15所述的表達(dá)載體。
17.一種轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其特征在于: 保持權(quán)利要求15所述的表達(dá)載體。
18.—種測(cè)定方法，其特征在于: 包括使用權(quán)利要求12所述的單分子型FRET生物傳感器檢測(cè)FRET的工序，測(cè)定絲氨酸一蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性和低分子量GTP結(jié)合蛋白活性的任一個(gè)。
19.一種測(cè)定方法，其特征在于: 包括使用權(quán)利要求16所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞或權(quán)利要求17所述的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物檢測(cè)FRET的工序，測(cè)定絲氨酸一蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性和低分子量GTP結(jié)合蛋白活性的任一個(gè)。
20.一種絲氨酸一蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性和低分子量GTP結(jié)合蛋白活性的任一個(gè)的調(diào)節(jié)物質(zhì)的篩選方法，包括: Ca)使權(quán)利要求16所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞與被檢物質(zhì)接觸的工序；和(b)通過(guò)檢測(cè)FRET，檢測(cè)絲氨酸一蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性和低分子量GTP結(jié)合蛋白活性的任一個(gè)的變化的工序 。
全文摘要
本發(fā)明提供一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理的單分子型FRET生物傳感器的接頭以及包含該接頭的單分子型FRET生物傳感器等，其能夠非侵襲性地測(cè)定絲氨酸－蘇氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性和低分子量GTP結(jié)合蛋白活性等。一種接頭，其為包括52個(gè)氨基酸殘基以上、400個(gè)氨基酸殘基以下的多肽，總氨基酸殘基數(shù)的至少95%由甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和丙氨酸構(gòu)成，甘氨酸為35～65%，絲氨酸和蘇氨酸的至少任一個(gè)為10～40%，丙氨酸為10～40%；包含該接頭的單分子型FRET生物傳感器；保持包含編碼該生物傳感器的基因的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。
文檔編號(hào)C12N1/19GK103228669SQ20118005700
公開(kāi)日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2011年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月27日
發(fā)明者松田道行, 小松直貴, 青木一洋, 上岡裕治, 幸長(zhǎng)弘子, 稻岡芳惠, 櫻井敦朗, 清川悅子, 隅山健太 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人京都大學(xué)