專利名稱：檢測生物活性的方法和組合物的制作方法
檢測生物活性的方法和組合物相關(guān)申請的交叉引用本專利申請要求2010年11月24日提交的美國臨時專利申請N0.61/416，858的權(quán)益，該申請以引用的方式全文并入本文中。
背景技術(shù)：
用于檢測樣品中靶微生物的方法經(jīng)常包括使用受靶微生物作用而形成可檢測產(chǎn)物的指示試劑。例如，可以通過與細(xì)胞(如致病微生物，生物學(xué)指示生物或癌細(xì)胞)相關(guān)的催化活性來檢測生物活性。檢測到樣品中的特定生物活性可以指示樣品中的特定微生物。例如，細(xì)菌孢子包含可以在檢測樣品內(nèi)活孢子的存在的方法(例如，包括快速方法)中使用的生物活性(例如，酶活性如α-吡喃葡萄糖苷酶或β-吡喃葡萄糖苷酶)對這些生物活性或其他生物活性之一的破壞可以用來驗(yàn)證和/或證實(shí)消毒過程的的成效
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要涉及檢測生物活性在樣品中的存在或不存在的組合物、制品和方法。在一些實(shí)施例中，生物活性的存在或不存在可以指示微生物的存在或不存在。本發(fā)明方法包括在樣品、可以由第一生物活性轉(zhuǎn)化成第一生物衍生物的第一指示試劑和多個能夠接收并保持來自含水液體的第一生物衍生物的粒子之間提供流體連通。有利地，第一生物衍生物可以從含水液體分配到粒子上和/或分配到粒子中，從而將第一生物衍生物濃縮至相對小的區(qū)域或體積中。將第一生物衍生物分配到粒子上和/或分配到粒子中，可以使得第一生物衍生物與它原本在含水液體中的檢測相比更容易地檢測。另外，粒子可以極大地限制第一生物衍生物在水凝膠中的擴(kuò)散，從而使得可以檢測水凝膠中存在的多種單獨(dú)的生物活性、微生物或微菌落。在一個方面，本發(fā)明提供一種檢測生物活性的方法。該方法可以包括提供可能包含第一生物活性的樣品、可由第一生物活性轉(zhuǎn)化成第一生物衍生物的第一指示試劑和多個粒子，每個粒子包含接受并保持所述第一生物衍生物的有機(jī)聚合物。第一指示試劑可以包含具有突光團(tuán)的生突光(fluorogenic)酶底物,所述突光團(tuán)選自傘形酮、7-氨基香豆素、β _萘胺、β _萘酌 、突光素、試齒靈、9Η_(1, 3-二氯-9,9-二甲基B丫卩定-2-酮)、羅丹明110、任何前述熒光團(tuán)的衍生物和任何前述熒光團(tuán)的組合。該方法還可以包括形成含水分散體，所述含水分散體包含所述第一指示試劑和所述多個粒子；使所述樣品與所述含水分散體處于流體連通；并且檢測所述第一生物衍生物的存在或不存在，其中所述第一生物衍生物被粒子保持。在該方法的以上實(shí)施例的任一項(xiàng)中，檢測生物衍生物的存在或不存在可以包括檢測發(fā)熒光(fluorescent)第一生物衍生物或有色生物衍生物。在以上實(shí)施例的任一項(xiàng)中，該方法還可以包括提供膠凝劑，其中形成含水分散體包括形成水凝膠，其中所述多個粒子中的至少一部分分散在所述水凝膠中。在該方法的以上實(shí)施例的任一項(xiàng)中，提供膠凝劑可以包括提供冷水可溶性膠凝劑。在一些實(shí)施例中，冷水可溶性膠凝劑可以選自羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、聚丙烯酰胺、刺槐豆膠、瓜耳膠、黃原膠和褐藻膠、二醇改性的多糖和淀粉接枝的聚(丙烯酸鈉-共-丙烯酰胺)。在一些實(shí)施例中，該方法還可以包括提供可以由第二生物活性轉(zhuǎn)化成第二生物衍生物的第二指示試劑，使第二指示試劑與水凝膠處于流體連通并檢測第二生物衍生物的存在或不存在。當(dāng)?shù)诙甘驹噭┌鸁晒饷傅孜飼r，第二指示試劑可以具有熒光團(tuán)，所述熒光團(tuán)選自傘形酮、7-氨基香豆素、β-萘胺、萘酚、熒光素、試鹵靈、9Η-(1，3-二氯-9，9- 二甲基吖啶-2-酮)、羅丹明110、任何前述熒光團(tuán)的衍生物和任何前述熒光團(tuán)的組合。在以上實(shí)施例的任一項(xiàng)中，該方法還可以包括提供可以由第二生物活性轉(zhuǎn)化成第二生物衍生物的第二指示試劑并檢測第二生物衍生物的存在或不存在。當(dāng)?shù)诙甘驹噭┌鸁晒饷傅孜飼r，第二指示試劑可以具有熒光團(tuán)，所述熒光團(tuán)選自傘形酮、7-氨基香豆素、萘胺、β _萘酌■、突光素、試齒靈、9Η-(1,3_ 二氯-9,9-二甲基B丫唳-2-酮)、羅丹明110、任何前述熒光團(tuán)的衍生物和任何前述熒光團(tuán)的組合。形成含水分散體可以包括形成包含第二指示試劑的含水分散體。在該方法的以上實(shí)施例的任一項(xiàng)中，使樣品與含水分散體處于流體接觸可以包括形成包含所述樣品、第一指示試劑和所述多個粒子的含水分散體。在該方法的以上實(shí)施例的任一項(xiàng)中，使樣品與含水分散體處于流體連通后，該方法還可以包括分離來自含水分散體或在其內(nèi)部的所述多個粒子的一部分。在一些實(shí)施例中，分離所述部分包括通過沉降、離心、絮凝或過濾分離所述部分。在另一個方面，本發(fā)明提供一種檢測生物活性的方法。該方法可以包括提供可能包含第一生物活性的樣品；可以由第一生物活性轉(zhuǎn)化成第一生物衍生物的第一指示試劑；多個粒子，每個粒子包含接受并保持所述第一生物衍生物的有機(jī)聚合物；和膠凝劑。第一指示試劑可以包含具有熒光團(tuán)的生熒光酶底物，所述熒光團(tuán)選自傘形酮、7-氨基香豆素、β -萘胺、β -萘酌■、突光素、 試齒靈、9Η-(I, 3- 二氯-9,9- 二甲基B丫唳-2-酮)、羅丹明110、任何前述熒光團(tuán)的衍生物和任何前述熒光團(tuán)的組合。該方法還可以包括形成水凝膠，所述水凝膠包含第一指示試劑和膠凝劑；使粒子分布在水凝膠的主表面的至少一部分上；使樣品與水凝膠的一部分處于流體連通；并且檢測第一生物衍生物的存在或不存在，其中所述第一生物衍生物由粒子保持。在一些實(shí)施例中，檢測第一生物衍生物的存在或不存在可以包括檢測發(fā)熒光第一生物衍生物或有色第一生物衍生物。在一些實(shí)施例中，提供膠凝劑可以包括提供冷水可溶性膠凝劑。在一些實(shí)施例中，冷水可溶性膠凝劑可以選自羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、聚丙烯酰胺、刺槐豆膠、瓜耳膠、黃原膠和褐藻膠、二醇改性的多糖和淀粉接枝的聚(丙烯酸鈉-共-丙烯酰胺)。在一些實(shí)施例中，該方法還可以包括提供可以由第二生物活性轉(zhuǎn)化成第二生物衍生物的第二指示試劑、使第二指示劑與水凝膠處于流體連通；并且檢測第二生物衍生物的存在或不存在。當(dāng)?shù)诙甘驹噭┌鸁晒饷傅孜飼r，第二指示試劑可以具有熒光團(tuán)，所述熒光團(tuán)選自傘形酮、7-氨基香豆素、β-萘胺、β-萘酚、熒光素、試鹵靈、9Η-(1，3- 二氯-9，9- 二甲基吖啶-2-酮)、羅丹明110、任何前述熒光團(tuán)的衍生物和任何前述熒光團(tuán)的組合。在一些實(shí)施例中，使粒子在水凝膠的主表面的至少一部分上分布還可以包括使第二指示試劑與水凝膠處于流體連通。在一些實(shí)施例中，使樣品與水凝膠的主表面的至少一部分處于流體連通還可以包括使第二指示試劑與水凝膠處于流體連通。在一些實(shí)施例中，形成水凝膠還可以包括形成包含第二指示試劑的水凝膠。在一些實(shí)施例中，檢測第一生物衍生物的存在或不存在可以包括檢測分立的發(fā)熒光區(qū)域。在一些實(shí)施例中，檢測分立的發(fā)熒光區(qū)域還包括計(jì)數(shù)分立的發(fā)熒光區(qū)域的數(shù)量。在一些實(shí)施例中，檢測第一生物衍生物的存在或不存在可以包括檢測分立的有色區(qū)域。在一些實(shí)施例中，檢測分立的發(fā)熒光區(qū)域還包括計(jì)數(shù)分立的有色區(qū)域的數(shù)量。在又一個方面，本發(fā)明提供一種組合物。該組合物可以包含水；可以由第一生物活性轉(zhuǎn)化成第一生物衍生物的第一指示試劑；和多個粒子，其中所述粒子能夠接收并保持來自含水液體的第一生物衍生物。第一指示試劑可以包含具有熒光團(tuán)的生熒光酶底物，所述熒光團(tuán)選自傘形酮、7-氨基香豆素、β -萘胺、β -萘酚、熒光素、試鹵靈、9Η-(1，3- 二氯-9，9- 二甲基吖啶-2-酮)、羅丹明110、任何前述熒光團(tuán)的衍生物和任何前述熒光團(tuán)的組合。在一些實(shí)施例中，該組合物還可以包含促進(jìn)微生物生長的營養(yǎng)物質(zhì)。在以上實(shí)施例的任一項(xiàng)中，該組合物還可以包含膠凝劑。在一些實(shí)施例中，該膠凝劑可以與水反應(yīng)以形成水凝膠。在一些實(shí)施例中，該膠凝劑可以包含冷水可溶性膠凝劑。在一些實(shí)施例中，冷水可溶性膠凝劑可以選自羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、聚丙烯酰胺、刺槐豆膠、瓜耳膠、黃原膠和褐藻膠、二醇改性的多糖和淀粉接枝的聚(丙烯酸鈉-共-丙烯酰胺)。在一些實(shí)施例中，該多個粒子中的至少一部分可以分散在水凝膠中。在一些實(shí)施例中，該多個粒子中的至少一部分可以布置在水凝膠的主表面上。在以上實(shí)施例的任一項(xiàng)中，該組合物還可以包含表面活性劑。在該組合物的任何實(shí)施例中，所述粒子可以包含有機(jī)聚合物，所述有機(jī)聚合物選自丙烯酸酯聚合物、聚苯乙烯聚合物、纖維素聚合物、葡聚糖聚合物、任何前述聚合物的組合和任何前述聚合物的衍生物。在又一個方面，本發(fā)明提供一種制品。該制品可以包括含有自支承防水基材的本體件，所述基材具有第一主表面和第二主表面；和粘附于第一主表面的至少一部分的涂層，其中所述涂層包含膠凝劑和多個粒子。所述粒子可以接受并保持來自水凝膠的第一指示試劑的第一生物衍生物。在一些實(shí)施例中，膠凝劑可以包含干的冷水可溶性膠凝劑。在一些實(shí)施例中，冷水可溶性膠凝劑可以選自羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、聚丙烯酰胺、刺槐豆膠、瓜耳膠、黃原膠和褐藻膠、二醇改性的多糖和淀粉接枝的聚(丙烯酸鈉-共-丙烯酰胺)。在該制品的以上實(shí)施例的任一項(xiàng)中，第一生物衍生物可以是源自生熒光酶底物的發(fā)熒光化合物。在以上實(shí)施例的任一項(xiàng)中，該制品還可以包含第一指示試劑。在以上實(shí)施例的任一項(xiàng)中，第一指示試劑可以包含具有熒光團(tuán)的生熒光酶底物，所述熒光團(tuán)選自傘形酮、7-氨基香丑素、β _萘胺、β _萘酌■、突光素、試齒靈、9Η_(1, 3- 二氯-9,9- 二甲基B丫唳-2-酮)、羅丹明110、任何前述熒光團(tuán)的衍生物和任何前述熒光團(tuán)的組合。在以上實(shí)施例的任一項(xiàng)中，該制品還可以包含布置在涂層和第一主表面之間的粘合劑層，其中所述粘合劑層布置在第一主表面和涂層之間并且粘結(jié)性地與第一主表面和涂層結(jié)合。在該制品的以上實(shí)施例的任一項(xiàng)中，涂層還可以包含營養(yǎng)物質(zhì)。在該制品的以上實(shí)施例的任一項(xiàng)中，涂層或粘合劑層可以包含第二指示試劑。在該制品的以上實(shí)施例的任一項(xiàng)中，涂層或粘合劑層還包含選擇劑。在該制品的以上實(shí)施例的任一項(xiàng)中，粒子可以包含有機(jī)聚合物，所述有機(jī)聚合物選自丙烯酸酯聚合物、聚苯乙烯聚合物、纖維素聚合物、葡聚糖聚合物、任何前述聚合物的組合和任何前述聚合物的衍生物。在該制品的以上實(shí)施例的任一項(xiàng)中，涂層還包含表面活性劑。在以上實(shí)施例的任一項(xiàng) 中，粒子直徑可以為約0.01 μ m至約1000 μ m。
詞語“優(yōu)選的”和“優(yōu)選地”是指在某些情況下可以提供某些有益效果的本發(fā)明的實(shí)例。然而，在相同的情況或其他情況下，其他實(shí)例也可以是優(yōu)選的。此外，對一個或多個優(yōu)選實(shí)例的表述并不暗示其他實(shí)例是不可用的，且并非意圖將其他實(shí)例排除在本發(fā)明范圍之外。當(dāng)術(shù)語“包括”和其變型出現(xiàn)在說明書和權(quán)利要求書中時，這些術(shù)語不具有限制性含義。本文所用的“一種(個)”、“所述(該)”、“至少一種(個)”以及“一種或多種(一個或多個)”可互換使用。因此，例如，一種微生物可以解釋為意指“一種或多種”微生物。術(shù)語“和/或”意指所列要素的一個或全部，或所列要素的任何兩個或兩個以上的組合。如本文所用，“生物活性”指與生物細(xì)胞相關(guān)的任何具體催化過程或過程組。生物活性的非限制性例子包括分解代謝酶活性、合成代謝酶活性、偶聯(lián)反應(yīng)(例如，代謝途徑)、生物分子介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)和生物發(fā)光反應(yīng)。如本文所用，“生物衍生物”指生物活性的任何產(chǎn)物。這包括例如酶反應(yīng)和生物電子傳遞系統(tǒng)的產(chǎn)物。

如本文所用，“生物細(xì)胞”指單細(xì)胞生物(例如細(xì)菌、酵母、絲狀真菌、原蟲、藻類)或其衍生物和來自多細(xì)胞生物的細(xì)胞(例如，各種類型的源自植物、動物或多細(xì)胞真菌的細(xì)胞)或其衍生物兩者。生物細(xì)胞的衍生物包括休眠狀態(tài)(例如，孢子)、遺傳工程改造的變體、多倍體細(xì)胞和雜交細(xì)胞(例如雜交瘤)。生物細(xì)胞包括天然環(huán)境中存在的細(xì)胞以及體外培養(yǎng)的細(xì)胞。另外,本文通過端點(diǎn)表述的數(shù)值范圍包括所述范圍內(nèi)包含的所有數(shù)值(例如，1到5 包括 1,1.5、2、2.75,3,3.80、4、5 等)。本發(fā)明的上述發(fā)明內(nèi)容并不意圖描述本發(fā)明的每個公開的實(shí)例或每種實(shí)施方式。以下描述更具體地舉例說明了示例性實(shí)例。在整個申請的若干地方，通過例子的清單提供了指導(dǎo)，所述例子可以按多種組合方式來使用。在每種情形下，所列舉的清單僅僅作為代表性群組，而不應(yīng)被理解為排他性清單。由具體實(shí)施方式
和附圖，本發(fā)明的其它特征和方面將變得顯而易見。


圖1是根據(jù)本發(fā)明的檢測生物活性的方法的一個實(shí)施例的框圖。圖2是根據(jù)本發(fā)明的包含多個粒子的含水液體的一個實(shí)施例的橫截面?zhèn)纫晥D。圖3是根據(jù)本發(fā)明的包含水凝膠的制品的一個實(shí)施例的橫截面?zhèn)纫晥D，所述水凝膠具有布置于其上的多個粒子。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及檢測樣品中的微生物的組合物、制品和快速方法。本發(fā)明的組合物和制品包含多個粒子，所述粒子被設(shè)置成接受并保持生物活性的發(fā)熒光產(chǎn)物。因而，發(fā)熒光分子可以從含水介質(zhì)分配(例如，濃縮)到粒子上和/或粒子中。有利地，使發(fā)熒光分子分配到粒子上或粒子中，可使得粒子中的發(fā)熒光分子局部濃度比周圍含水介質(zhì)中更高。這種濃縮作用可以提供顯著集中的熒光信號，所述熒光信號可以在背景熒光上更易于檢測到。在一個方面，本發(fā)明提供一種檢測樣品中的微生物的方法。圖1顯示本發(fā)明方法的一個實(shí)施例的框圖。該方法包括步驟180:提供樣品、第一指示試劑和多個粒子。該樣品可以是本文所述的任何合適樣品。該第一指示試劑可以由生物活性轉(zhuǎn)化成第一生物衍生物。所述粒子可以包含接受并保持該第一生物衍生物的有機(jī)聚合物。該方法還可以包括形成含水分散體的步驟185，該水分散體包含該第一指示試劑和該多個粒子；使該樣品與該含水分散體處于流體連通的步驟190 ;和檢測由粒子保持的該第一生物衍生物的存在或不存在的步驟195。本發(fā)明的方法涉及檢測樣品中的生物活性。該樣品可以是任何包含如本文定義的生物活性的樣品。合適樣品的非限制性例子包括細(xì)胞(例如，哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞、絲狀真菌、細(xì)菌細(xì)胞)的懸液或培養(yǎng)物、環(huán)境樣品(例如，表面拭子)、食品(例如，原料、在線樣品和成品樣品)、飲料、臨床樣品(例如，血液、尿、痰、組織、黏液、糞便、傷口滲出液、膿)和水(例如，表面水、飲用水、工藝水)。微生物(例如，細(xì)菌、真菌、病毒)是生物活性的來源并且可以在測試樣品中進(jìn)行分析，所述測試樣品可以源自任何來源，如生理流體，例如血液、唾液、眼晶狀體液、滑液、腦脊液、膿、汗、滲出物、尿、黏液、泌乳等。此外，測試樣品可源自身體部位，例如傷口、皮膚、鼻孔、頭皮、指甲等。特別值得關(guān)注的樣品包括含黏液的樣品，如鼻樣品(來自例如前鼻孔、鼻咽腔、鼻腔、鼻前庭等)以及來自外耳、中耳、口、直腸、陰道或其他類似組織的樣品。特定黏膜組織的例子包括頰黏膜、齒齦黏膜、鼻黏膜、眼睛黏膜、氣管黏膜、支氣管黏膜、胃腸道黏膜、直腸黏膜、尿道黏膜、輸尿管黏膜、陰道黏膜、子宮頸黏膜和子宮黏膜。除了生理流體外，其他試驗(yàn)樣品可以包括其他液體以及溶于液體介質(zhì)中的固體。所關(guān)注的樣品可以包括工藝流、水、土壤、植物或其他植被、空氣、表面(例如被污染的表面)等。樣品還可包以括 經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞。樣品也可以包括在包含細(xì)胞、孢子或酶(例如，生物指示劑裝置)裝置上或該裝置中的樣品。固體樣品可以進(jìn)行分裂(例如，通過混合、超聲波處理、均化)并且可以懸浮在液體(例如，水、緩沖液、培養(yǎng)液)中。在一些實(shí)施例中，可以在該方法中使用含有樣品材料的樣品采集裝置(例如，拭子、海綿)。或者，可以從樣品采集裝置洗脫(elute)(例如，淋洗、刮取、表達(dá))樣品材料，然后再將樣品材料用于該方法中。在一些實(shí)施例中，液體或固體樣品可以稀釋于液體(例如，水、緩沖液、培養(yǎng)液)中。合適的樣品還有已經(jīng)暴露于滅菌劑的液體和/或固體樣品。這些樣品的非限制性例子包括孢子懸液、孢子試條和已經(jīng)向其施加孢子或營養(yǎng)性微生物細(xì)胞的懸液的多種材料的試樣(coupon)。合適的樣品也包括含有細(xì)胞或先前含有細(xì)胞的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基(例如，培養(yǎng)液、半固體細(xì)胞培養(yǎng)基和組織培養(yǎng)基、濾液)。合適的樣品也包括細(xì)胞裂解物。細(xì)胞裂解物可以通過化學(xué)手段(例如，去垢劑、酶)、機(jī)械手段(超聲振動、均化、弗氏壓碎器)或通過本領(lǐng)域已知的其他裂解細(xì)胞的手段產(chǎn)生。樣品可以包含第一微生物。第一微生物可以是靶微生物，所述靶微生物指示污染(例如，糞便污染)、感染(例如，致病微生物感染)或滅菌過程(例如，生物滅菌指示劑)失敗。特別值得關(guān)注的微生物包括原核和真核生物，尤其革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌、原蟲、支原體、酵母、病毒和甚至脂質(zhì)包覆的病毒。特別相關(guān)的生物包括腸桿菌科(Enterobacteriaceae)或微球菌科(Micrococcaceae)或葡萄球菌屬(Staphylococcusspp.)、鏈球菌屬(Streptococcus spp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)、腸球菌屬(Enterococcus spp.)、沙門氏菌屬(Salmonella spp.)、軍團(tuán)菌屬(Legionella spp.)、志賀氏菌屬(Shigella spp.))、耶爾森菌屬(Yersinia spp.)、腸桿菌屬(Enterobacterspp.)、埃希氏菌屬(Escherichia spp.)、芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)、李斯特氏菌屬(Listeria spp.)、弧菌屬(Vibrio spp.)、棒狀桿菌屬(Corynebacteria spp.)以及皰疫病毒、曲霉屬(Aspergillus spp.)、鐮刀菌屬(Fusarium spp.)和假絲酵母屬(Candidaspp.)的成員。毒力特別強(qiáng)的生物包括金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，包括耐藥性菌株如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA))、表皮葡萄球菌(S.epidermidis).肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、無乳鏈球菌(S.agalactiae)、化胺性鏈球菌(S.pyogenes)、類腸球菌(Enterococcus faecalis)、耐萬古霉素腸球菌(VancomycinResistant Enterococcus (VRE))、耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(Vancomycin ResistantStaphylococcus aureus (VRSA))、中等耐受萬古霉素的金黃色葡萄球菌(VancomycinIntermediate-resistant Staphylococcus aureus (VISA))、炭疽芽抱桿菌(Bacillusanthracis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大腸桿菌(Escherichia coli)、黑曲霉(Aspergillus niger)、煙曲霉(A.fumigatus)、棒曲霉(A.clavatus)、煎病鐮刀菌(Fusarium solani)、尖抱德刀菌(F.0xysporum)、厚垣德刀菌(F.chIamydosporum)、單核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、伊氏李斯特氏菌(Listeria ivanovii)、霍亂弧菌(Vibrio cholera)、副溶血性弧菌(V.parahemolyticus)、豬霍亂沙氏桿菌(Salmonellacholerasuis)、傷寒沙氏桿菌(S.typhi)、鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)、白假絲酵母(Candida albicans)、光滑假絲酵母(C.glabrata)、克柔假絲酵母(C.krusei)、阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)、大腸桿菌0157和多藥耐藥性革蘭氏陰性桿菌(MDR)。革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌特別值得關(guān)注。甚至更值得關(guān)注的是革蘭氏陽性細(xì)菌，例如金黃色葡萄球菌。而且，特別關(guān)注的是包括11^八、￥1 八、￥13八、￥1 和^)1 在內(nèi)的抗生素耐藥性微生物。本發(fā)明的方法包括使用第一指示試劑。第一指示試劑可以是本文所述的任何合適的指示試劑。第一指示試劑可以由生物活性轉(zhuǎn)化成第一生物衍生物。在一些實(shí)施例中，第一指示試劑可以是由生物活性(例如，酶活性)轉(zhuǎn)化成第一生物衍生物的酶底物。合適的生物活性的非限制性例子包括糖苷酶、酯酶、磷酸酶、硫酸酯酶、蛋白酶、酰胺酶等。在一些實(shí)施例中，第一指示試劑包括生生熒光指示試劑(例如，生熒光酶底物)?？梢岳斫猓鸁晒庵甘驹噭┍旧硎菬o熒光的或以與相應(yīng)生物衍生物截然不同的方式發(fā)熒光，例如，在強(qiáng)度或發(fā)射光譜方面不同。生熒光指示試劑包含具有特征性熒光發(fā)射光譜的發(fā)熒光組分(熒光團(tuán))。 在一些實(shí)施例中，生熒光指示試劑可以是生熒光酶底物?？梢栽诒景l(fā)明的第一指示試劑中使用的熒光團(tuán)的非限制性例子包括傘形酮、7-氨基香豆素、β_萘胺、
3-萘酚、熒光素、試鹵靈、9!1-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮)、羅丹明110、任何前述熒光團(tuán)的衍生物和任何前述熒光團(tuán)的組合。如本文所用，任何上述熒光團(tuán)的“衍生物”指包含該熒光團(tuán)的共軛環(huán)結(jié)構(gòu)的發(fā)熒光分子。示例性衍生物例如包含其中原始熒光團(tuán)中的一個或多個氫原子被官能團(tuán)(如鹵素、鏈烷、酸、胺、羥基、硝基、硫酸鹽等)取代的熒光團(tuán)；前提是這種取代實(shí)質(zhì)上不消除該熒光團(tuán)發(fā)熒光的能力和/或?qū)嵸|(zhì)上防止生物活性與包含該熒光團(tuán)衍生物的指示試劑反應(yīng)。熒光團(tuán)可以偶聯(lián)于多種糖苷、酰胺、肽、磷酸酯、硫酸鹽或脂肪酸，例如以產(chǎn)生可以作為如本文所述的第一指示試劑使用的生熒光衍生物?，F(xiàn)有技術(shù)包括起源多樣的許多生熒光化合物(例如，生熒光酶底物)，所述熒光化合物是已知的、可商業(yè)獲得的、已經(jīng)用于酶學(xué)方法中并且適合用作本發(fā)明的第一指示試劑?？捎玫纳鸁晒饷傅孜锇ㄉ鸁晒饷傅孜锏乃苄喳}。生熒光酶底物包括多種生熒光4-甲基傘形酮基化合物(可水解成4-甲基傘形酮)；7-酰氨基-4-甲基-香豆素的生熒光衍生物，例如，如英國專利N0.1, 547，747和歐洲專利N0.0, 000, 06 3中所公開，所述專利各自以引用方式完整地并入本文；生熒光二乙酰熒光素化合物；和突光胺?？捎玫纳鸁晒?-甲基傘形酮基化合物包括例如:4-甲基傘形酮基-2-乙酰氨基-4，6-0-亞芐基-2-脫氧-β -D-吡喃葡糖苷；乙酸-4-甲基傘形酮酯；4_甲基傘形酮基-N-乙醜β -D-氨基半乳糖苷；4-甲基傘形酮基-N-乙酰-a -D-氨基葡糖苷；4_甲基傘形酮基-N-乙醜β-D-氨基葡糖苷；2' -(4-甲基傘形酮基)_α-D-N-乙酰神經(jīng)氨酸；
4-甲基傘形酮基a -L-呋喃阿拉伯糖苷；4_甲基傘形酮基a -L-阿拉伯糖苷；丁酸_4_甲基傘形酮酯；4-甲基傘形酮基β-D-纖維二糖苷；甲基傘形酮基i3-D_N，N' 二乙酰殼二糖苷；反油酸-4-甲基傘形酮酯；4_甲基傘形酮基β -D-巖藻糖苷；4_甲基傘形酮基a -L-巖藻糖苷；4_甲基傘形酮基β -L-巖藻糖苷；4_甲基傘形酮基a -D-半乳糖苷；4_甲基傘形酮基β -D-半乳糖苷；4_甲基傘形酮基a-D-葡糖苷；4_甲基傘形酮基β -D-葡糖苷；4_甲基傘形酮基β -D-葡糖苷酸；對胍基苯甲酸-4-甲基傘形酮酯；庚酸-4-甲基傘形酮酯；
4-甲基傘形酮基a -D-吡喃甘露糖苷；4_甲基傘形酮基β -D-吡喃甘露糖苷；油酸-4-甲基傘形酮酯；棕櫚酸-4-甲基傘形酮酯；磷酸-4-甲基傘形酮酯；丙酸-4-甲基傘形酮酯；硬脂酸-4-甲基傘形酮酯；硫酸-4-甲基傘形酮酯；4_甲基傘形酮基i3-D-N，N'，N"-三乙酰殼三糖；4_甲基傘形酮基2，3，5-三-鄰-苯甲?；?a -L-呋喃阿拉伯糖苷；4_甲基傘形酮基-對-三甲基氯化銨肉桂酸酯；和4-甲基傘形酮基β-D-木糖苷?？捎玫纳鸁晒?-酰氨基-4-甲基香豆素化合物包括例如:L_丙氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素；L-脯氨酸7-酰氨基-4-甲基香豆素；L-酪氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素；L-亮氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素；L-苯丙氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素；和7-戊二酰苯丙氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素?？捎玫纳鸁晒猞?-萘酰胺化合物包括例如Ala-Ala-2-萘酰胺、Ala-Arg-2-萘酰胺、Glu-His-2-萘酰胺、Gly-Arg-2-萘酰胺、Gly-Arg-4-甲氧基-2-萘酰胺、Gly-Phe-2-萘酰胺、His-Ser-2-萘酰胺、Phe_Arg-2-萘酰胺、PiO-Arg-2-萘酰胺、a -Asp-Arg-2-萘酰胺和Gly-Trp-2-萘酰胺。可用的生熒光β -萘酚化合物包括例如乙酸-2-萘酯、2-萘基-a -D-吡喃葡糖苷、磷酸-2-萘酯、2-萘基-β -D-吡喃葡糖苷和2-萘基- a -L-吡喃巖藻糖苷。包含7-酰氨基-4-甲基香豆素的可用的生熒光肽化合物包括例如:N-t-BOC-1Ie-Glu-Gly-Arg 7-酸氨基-4-甲基香豆素；N-t-BOC-Leu-Ser-Thr-Arg 7-酸氨基-4-甲基香豆素；N-CBZ_Phe_Arg 7-酰氨基-4-甲基-香豆素；Pro-Phe_Arg 7-酰氨基-4-甲基香豆素；N-t-BOC-Val-Pro_Arg 7-酰氨基-4-甲基香豆素dPN-戍二酰-Gly-Arg 7-酰氨基-4-甲基香豆素?？捎玫纳鸁晒鉄晒馑鼗衔锇ɡ缍宜釤晒馑?、熒光素單_(β -D-吡喃半乳糖苷)、熒光素二 _(β-D-吡喃半乳糖苷)、熒光素二 _(β-D-吡喃葡糖苷)、熒光素二 _(β -D-葡糖苷酸)、二月桂酸熒光素、二磷酸熒光素和任何前述熒光素化合物的衍生物。 可用的生突光試齒靈化合物包括例如試齒靈-β -D-卩比喃半乳糖苷、試齒靈_β -D-葡糖醛酸、試鹵靈- a -D-吡喃甘露糖苷、試鹵靈乙醚、試鹵靈甲醚、試鹵靈芐醚、磷酸試鹵靈和乙酸試鹵靈。可用的生熒光羅丹明化合物包括例如雙_(天冬氨酸酰氨基)羅丹明110、雙-(CBZ-精氨酸酰氨基)羅丹明110、雙-(對-甲苯磺?；?L-甘氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸酰氨基)羅丹明110、二鹽酸雙-(CBZ-L-異亮氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸酰氨基)羅丹明110、二鹽酸雙-(CBZ-L-丙氨酰-L-精氨酸酰氨基)羅丹明110、雙-(CBZ-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酸酰氨基)羅丹明110、雙-(N-CBZ-L-天冬氨酰-L-谷氨酰-L-纟顏氨酰-L-天冬氨酸酰氨基)羅丹明110、雙-(N-CBZ-L-異売氨酰L-谷氨酰-L-蘇氨酰-L-天冬氨酸酰氨基)羅丹明110。在待檢測的生物活性是α-D-葡糖苷酶、胰`凝乳蛋白酶或脂肪酸酯酶(例如，來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus))的情況下,合適的生突光酶底物是4-甲基傘形酮基-a -D-葡糖苷、7-戊二酰苯丙氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素或庚酸-4-甲基傘形酮酯。在待檢測的生物活性是a-L-呋喃阿拉伯糖苷酶(例如，衍生自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis))的情況下,合適的生突光酶底物是4-甲基傘形酮基-a-L-呋喃阿拉伯糖苷。在待檢測的生物活性是β-D-葡糖苷酶(例如，衍生自枯草芽孢桿菌)的情況下，合適的生熒光酶底物是4-甲基傘形酮基葡糖苷。其他適合作為第一指示試劑的化合物包括可以被作用(例如，水解、氧化或還原)以產(chǎn)生水溶性衍生物發(fā)色團(tuán)的生色化合物。應(yīng)理解,生色化合物本身是無色的或以與相應(yīng)的第一生物衍生物截然不同的方式顯色，例如，在顏色或強(qiáng)度方面不同。以比色儀器使用者熟知的方式使用適宜的檢測波長，將由第一生物衍生物產(chǎn)生有色信號與可能存在的任何其他顏色區(qū)分開來。已經(jīng)在酶學(xué)方法中使用許多生色底物?？捎玫纳孜锇ㄏ趸交苌锖头犹衔?。可用的硝基苯基化合物包括對硝基苯酚和鄰硝基苯酚衍生物。特別有用的對硝基苯酚包括磷酸二乙基對硝基苯酯；磷酸二對硝基苯酯；對硝基苯基-2-乙酰氨基_2_脫氧-3-0-β -批喃半乳糖基_β _批喃匍糖昔；對硝基苯基_2_乙酸氛基-2-脫氧-β -吡喃葡糖苷；乙酸對硝基苯酯；對硝基苯基-N-乙酰-β -D-氨基葡糖苷；對硝基苯基-β -D-N-N’ - 二乙酰基殼二糖苷；對硝基苯基- α -吡喃葡糖苷；對硝基苯基- α -麥芽糖苷；對硝基苯基-β -麥芽糖苷；對硝基苯基-α -吡喃甘露糖苷；對硝基苯基-β -吡喃甘露糖苷；肉豆蘧酸對硝基苯酯；棕櫚酸對硝基苯酯；磷酸對硝基苯酯；雙(對硝基苯基)磷酸酯；對硝基苯基_β -吡喃葡糖苷；對硝基苯基_β -葡糖苷酸；α -對硝基苯基甘油；對硝基苯基-α -批喃鼠李糖苷；胸苷一磷酸硝基苯酯；硬脂酸對硝基苯酯；硫酸對硝基苯酯；硫酸對硝基苯酯；對硝基苯基-2，3，4，6-四-O-乙酰基-β -氨基葡糖苷；胸苷一磷酸對硝基苯酯；對硝基苯基_2，3，4-三-O-乙?；?β -葡糖醛酸甲酯；和戊酸對硝基苯酯。特別可用的生色鄰硝基苯酚指示劑包括乙酸鄰硝基苯酯、鄰硝基苯基-b_葡糖苷和鄰硝基苯基β-D-吡喃葡糖苷。其他特別可用的生色硝基苯基化合物包括硝基苯基-β -吡喃巖藻糖苷、硝基苯基-α -吡喃半乳糖苷、硝基苯基-β -吡喃半乳糖苷、丁酸硝基苯酯、癸酸硝基苯酯、己酸硝基酯、辛酸硝基苯酯、月桂酸硝基苯酯和丙酸硝基苯酯。可用的含酚酞的生色指示劑包括:二丁酸酚酞；二磷酸酚酞；二硫酸酚酞；酚酞葡糖醛酸；酚酞單-β -葡糖苷酸；酚酞單-β -葡糖醛酸；和酚酞單磷酸。上述生色指示試劑全部都會與適宜的生物活性(例如，酶)直接反應(yīng)以產(chǎn)生發(fā)色團(tuán)。如果酶反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)一步與生色試劑(如重氮化染料，例如，1-重氮基-4-苯甲酰氨基-2, 5-二乙氧基苯(可從Sigma Chemical作為“固藍(lán)BB鹽(Fast Blue BB Salt) ”商業(yè)獲得)、1_重氣基_4-苯甲酸氣基-2,5- _.乙氧基苯、對_重氣基-2,5- _.乙氧基N-苯甲酰丙氨酸、4-氯-2-甲基苯氯化重氮和鄰氨基偶氮甲苯重氮鹽反應(yīng))以產(chǎn)生發(fā)色團(tuán)，則有用地使用含有1-萘基、2-萘基和萘酚-ASBI化合物的另外的生色酶底物。特別可用的生色1-萘基化合物包括1-萘基-N-乙酰-β-D-氨基葡糖苷。特別可用 的生色2-萘基化合物包括磷酸-2-萘酯；丁酸-2-萘酯；辛酸-2-萘酯；肉S.蘧酸_2_萘酯；L_売氨酰-2-萘酰胺；L_纟顏氨酰-2-萘酰胺；L_半胱氨酰-2-萘酰胺；N_苯甲?；?DL-精氨酸-2-萘酰胺；N_戍二酰-苯丙氨酸-2-萘胺；磷酸-2-萘酯；6-溴-2-萘基- a -D-吡喃半乳糖苷；2_萘基-β -D-吡喃半乳糖苷；2_萘基_2_D_吡喃葡糖苷；6_溴-2-萘酚-β -D-吡喃葡糖苷；6_溴-2-萘基-2-D-吡喃甘露糖苷；和2-萘基-a -L-卩比喃巖操糖苷。特別可用的生色萘酚-ABI化合物包括萘酚-ASB1-磷酸酯和萘酚-ASB1- β -D-葡糖苷酸。在其中待檢測的生物活性是α-D-葡糖苷酶(例如，來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌)一些實(shí)施例中，生色酶底物優(yōu)選為對硝基苯基_a-吡喃葡糖苷。在其中待檢測的生物活性是a-L-呋喃阿拉伯糖苷酶(例如，衍生自枯草芽孢桿菌)的一些實(shí)施例中，優(yōu)選的生色酶底物是對硝基苯-a -L-呋喃阿拉伯糖苷。在其中待檢測的生物活性是β -D-葡糖苷酶(例如，衍生自枯草芽孢桿菌)的一些實(shí)施例中，優(yōu)選的生色酶底物是對硝基苯基-D-吡喃葡糖苷。為了在檢測包含酶的生物活性時實(shí)施本發(fā)明的方法，操作員應(yīng)當(dāng)熟知待檢測的酶活性和將與該酶反應(yīng)從而產(chǎn)生產(chǎn)物的酶底物，所述產(chǎn)物可以通過其熒光、顏色等來檢測(見 Μ.Roth, Methods of Biochemical Analysis (生物化學(xué)分析方法)，第 7 卷，D.Glock編著，Interscience Publishers, New York, NY, 1969,所述文獻(xiàn)以引用方式完整地并入本文)。待采用的適宜酶底物將取決于待檢測的生物活性。本發(fā)明的方法包括使用多個包含有機(jī)聚合物材料的粒子。在一些實(shí)施例中，所述粒子是水可分散性粒子，有機(jī)聚合物材料具有相對親水的官能團(tuán)。在一些實(shí)施例中，可以將表面活性劑添加至粒子或添加至包含粒子的組合物(例如，含水組合物)。在這些實(shí)施例中，表面活性劑可以促進(jìn)較不親水的粒子的水分散性。將粒子構(gòu)造成接受并保持如本文所述的第一生物衍生物。如本文所述，“構(gòu)造成接受并保持”生物衍生物意指這種生物衍生物優(yōu)先地從含水液體或水凝膠分配到聚合物粒子上(例如，到其上和/或入其內(nèi))。該分配因而降低第一生物衍生物在含水液體或水凝膠本體中的濃度并且相應(yīng)地增加由粒子保持的第一生物衍生物的量。在其中粒子包含表面活性劑和/或?qū)⒈砻婊钚詣┨砑又涟Ｗ拥慕M合物的實(shí)施例中，表面活性劑可以促進(jìn)第一生物衍生物由粒子接受和/或保持。不受理論約束，生物衍生物積累到基材材料上和/或積累入基材材料中可以借助多種化學(xué)吸引力(包括例如但不限于離子相互作用、疏水相互作用、范德瓦爾斯力和氫鍵)中的一者或多者而發(fā)生。合適粒子的非限制性例子包括包含丙烯酸酯聚合物、聚苯乙烯聚合物、纖維素聚合物、葡聚糖聚合物和任何前述聚合物的組合或衍生物的粒子。市售的粒子適用于本發(fā)明的方法中。這些粒子包括例如Soken MX、MR和MP系列、Soken SGP系列和Soken SX-500系列(均可從日本大阪綜研化學(xué)株式會社(Soken Chemical and Engineering)獲得)；Eudragit RLPO和S-100系列(可從特拉華州紐瓦克贏創(chuàng)工業(yè)(Evonik Industries)獲得)；AmberliteTM非離子吸收劑和Amberlite 離子交換樹脂(可從密蘇里州圣路易斯西格瑪化學(xué)有限公司(Sigma Chemical C0.)獲得)；AmberlystTM離子交換樹脂(可從馬薩諸塞州 Ward Hill 阿法埃莎公司(Alfa Aesar)獲得)；Whatman QA 52 和 Whatman DE 53(可從新澤西州皮斯卡塔韋通用電氣醫(yī)療集團(tuán)(GE Healthcare)獲得);和Sephadex 粒子(可從西格瑪化學(xué)有限公司(Sigma Chemical C0.)獲得)。有多種粒度適合本發(fā)明的用途。在一些實(shí)施例中，粒子可以具有約0.4微米、約
1.0微米、約1.8微米、約2.0微米、約5.0微米、約10.0微米、或約20.0微米的平均粒徑。在一些實(shí)施例中，粒子可以優(yōu)選地在約0.01微米和約I毫米之間、更優(yōu)選地在約0.05微米和約20微米之間、甚至更優(yōu)選地在約0.1微米和約5微米之間、甚至更優(yōu)選地在約0.2微米和約2微米之間。

本發(fā)明的方法包括形成含水分散體，所述含水分散體包含該第一指示試劑和該多個接受并保持第一生物衍生物的粒子。在一些實(shí)施例中，粒子和/或第一指示試劑可以以實(shí)質(zhì)上干的形式提供并且可以分別或同時與含水液體(例如，水、含水緩沖液、營養(yǎng)培養(yǎng)液、含水樣品)或水凝膠混合，其中所述粒子實(shí)質(zhì)上分散于含水液體中。在某些優(yōu)選的實(shí)施例中，粒子實(shí)質(zhì)上均勻地分散于含水液體或水凝膠中。在一些實(shí)施例中，可以將表面活性劑添加至含水混合物以促進(jìn)粒子的水分散性。通常，形成含水分散體包括混合含水液體和粒子(例如，通過攪動、攪拌等進(jìn)行混合)。 在該方法的一些實(shí)施例中，含水液體還可以包含膠凝劑。在一些實(shí)施例中，膠凝劑可以包含瓊脂。在一些實(shí)施例中，膠凝劑可以包含冷水可溶性膠凝劑。合適的冷水可溶性膠凝劑包括在室溫下于水中形成溶液或水凝膠的天然膠凝劑和合成膠凝劑。合適膠凝劑的非限制性例子包括羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、聚丙烯酰胺、刺槐豆膠、瓜耳膠、黃原膠和褐藻膠，以及高吸收性材料，包括二醇改性的多糖和淀粉接枝的聚(丙烯酸鈉-共-丙烯酰胺)如WATER LOCK高吸收劑(伊利諾伊州Geneseo的SNISolutions公司)在內(nèi)。在一個優(yōu)選實(shí)施例中，瓜耳膠和黃原膠按1: 2重量比組合。在這些實(shí)施例中，形成包含該第一指示試劑和該多個粒子的含水混合物可以包括形成第一指示試劑溶解和/或懸浮于其中以及粒子分散(例如，懸浮)于其中的水凝膠。在一些實(shí)施例中，水凝膠組合物還可以包含表面活性劑。本發(fā)明的方法包括使可能包含第一微生物的樣品與本文所述的包含該第一指示試劑和該多個粒子的含水分散體處于流體連通。在一些實(shí)施例中，使樣品與含水分散體處于流體連通包括將樣品與含水分散體混合。例如，如果樣品包括液體，則可將樣品與含水分散體在器皿(例如，燒瓶、燒杯、管、微孔)中組合。例如，如果樣品是固體，則可將樣品在液體中懸浮和任選地均化，并且隨后將懸液或勻漿與含水分散體組合?；蛘撸蓪⒐腆w樣品在包含該第一指示試劑和該多個粒子的含水分散體中直接懸浮并且任選地均化。在一些實(shí)施例中，可將樣品捕獲并保持在多孔膜(例如，濾膜)上，并且可將該膜與含水分散體接觸，其中所述樣品留在膜的一側(cè)上而含水分散體留在膜的對側(cè)面上，其中所述含水液體可以穿過該膜，從而樣品和含水分散體處于流體連通。使樣品與含水分散體處于流體連通，可以使與第一微生物(如果存在的話)相關(guān)的生物活性與第 一生物指示劑相互作用以形成第一生物衍生物。同時和/或依次地，第一生物衍生物與多個粒子中的至少一個結(jié)合。在該方法的任何實(shí)施例中，使樣品與含水分散體處于流體連通還可以包括在樣品和含水分散體處于流體連通的同時，將它們孵育一段時間。如本文所用，“溫育”意指提供有利于與第一微生物相關(guān)的一種或多種生物活性的條件。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會確認(rèn)出有利于與微生物(例如，靶微生物)相關(guān)的生物活性的條件。這類條件的非限制性例子包括溫度；氣體(如氧和/或二氧化碳)的存在或量；營養(yǎng)物質(zhì)、維生素和/或輔因子的存在或量；pH ;氧化-還原電位；和溫育時間。通常，較長的溫育時間能使生物活性產(chǎn)生出更大數(shù)量的第一生物衍生物。本發(fā)明的方法包括檢測第一生物衍生物的存在或不存在，其中所述第一生物衍生物由所述多個粒子中的一個或多個保持。在一些實(shí)施例中，第一生物衍生物可以包含發(fā)色團(tuán)，并且因此可以通過檢測由一個或多個所述粒子保持的顏色(例如，發(fā)色團(tuán)的特征性顏色)來檢測到?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的檢測有色粒子的任何手段(例如，通過吸光度、反射比)來檢測顏色。在一些實(shí)施例中，第一生物衍生物可以包含熒光團(tuán)，并且因此可以通過檢測由一個或多個所述粒子保持的熒光來檢測到?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的檢測熒光粒子的任何手段來檢測熒光。在一些實(shí)施例中，檢測由一個或多個粒子保持的生物衍生物的存在或不存在可以包括使用儀器或儀器組合(例如，顯微鏡、照相機(jī))來檢測由一個或多個粒子保持的生物衍生物。在一些實(shí)施例中，檢測由一個或多個粒子保持的生物衍生物的存在或不存在可以包括以目視方式檢測由多個粒子保持的生物衍生物。圖示將有助于說明本發(fā)明的某些方面。圖2顯示含水液體210的截面視圖，所述含水液體210包含分散于其中的多個粒子220。粒子210可以是如本文所述的任何接受并保持第一生物衍生物的適合粒子。含水液體210可以是在用于容納液體的合適器皿(例如，管、燒瓶、燒杯、培養(yǎng)皿、微孔等)(未顯示)中的液體。含水液體210包含溶解和/或懸浮在液體中的第一指不試劑(未顯不)。在一些實(shí)施例中，含水液體210可以包含支持微生物生長的營養(yǎng)物質(zhì)。圖2中還顯示生物物質(zhì)230。生物物質(zhì)230是生物活性(例如，酶活性)的來源(例如，細(xì)胞、組織、菌落、菌絲體等)。隨著生物物質(zhì)230與第一指示試劑反應(yīng)，它產(chǎn)生游離的第一生物衍生物(“f”)。游離的第一生物衍生物“f”可以是略微水溶至極端水溶的，因此可以從生物物質(zhì)230擴(kuò)散遍及含水液體210。隨著游離的第一生物衍生物“f”接觸粒子220，游離的第一生物衍生物“f”被粒子220接受并保持，其中它變成被保持的第一生物衍生物(“F”)。如可以在圖2中見到，被保持的第一生物衍生物“F”的局部濃度可以在粒子220中比在周圍水介質(zhì)210中更高。有利地，被保持的第一生物衍生物“F”的這個較高局部濃度可以使第一生物衍生物比游離的第一生物衍生物“ f ”更容易地可檢測。在一些實(shí)施例中，使游離的第一生物衍生物“ f”轉(zhuǎn)化成被保持的第一生物衍生物“F”可以進(jìn)一步增強(qiáng)對第一生物衍生物的檢測。例如，在一些實(shí)施例中，微弱發(fā)熒光的游離第一生物衍生物“f”和粒子的相互作用可以通過例如減少含水液體的熒光猝滅作用來加強(qiáng)被保持的第一生物衍生物“F”的熒光。例如，在一些實(shí)施例中，首先顯色的游離第一生物衍生物“f”和粒子的相互作用可以導(dǎo)致被保持的第一生物衍生物“F”的顏色和/或顏色強(qiáng)度的變化。要認(rèn)識到，該圖示實(shí)施例中描述的優(yōu)點(diǎn)也可以在包含水凝膠(未顯示)的含水液體210中實(shí)現(xiàn)。例如，水凝膠可能是培養(yǎng)裝置(例如，培養(yǎng)皿、薄膜培養(yǎng)裝置例如PETRIFILM培養(yǎng)裝置)中的水凝膠。另外，可以在包含水凝膠的組合物中獲得額外的優(yōu)點(diǎn)。具體地講，水凝膠可以限制懸浮于其中或布置于其上的粒子220的運(yùn)動。因此，當(dāng)游離的第一生物衍生物“f”被接受并保持(從而變成被保持的第一生物衍生物“F”)時，它不再能夠在水凝膠中自由地?cái)U(kuò)散。通常，當(dāng)生物物質(zhì)隨時間推移釋放可自由擴(kuò)散的產(chǎn)物到水凝膠時，這類產(chǎn)物可以從生物物質(zhì)擴(kuò)散開并且以包圍生物物質(zhì)的極巨大區(qū)域的形式積累。這種現(xiàn)象例如在美國專利N0.5，601，998中描述；該專利以引用方式完整地并入本文。有利地，本發(fā)明的方法和組合物提供限制水溶性生物衍生物擴(kuò)散的手段。當(dāng)試圖計(jì)數(shù)水凝膠上或水凝膠中可能相對靠近的多個生物活性來源(例如，菌落形成單位)時，這可以是特別有利的。圖3顯示本發(fā)明的診 斷裝置300的橫截面?zhèn)纫晥D。診斷裝置300包含防水基材305。防水基材305可以例如是培養(yǎng)皿或薄膜培養(yǎng)裝置，如在例如美國專利N0.4，565，783 ；5，089，413 ;5，232，838 ;5，601，998 ;5，681，712 ;7，141，387 ;中和在美國專利申請?zhí)朜0.61/360, 166中描述的薄膜培養(yǎng)裝置；這些專利的每一篇以引用方式全文并入。裝置300還包含水凝膠315。水凝膠315包含第一指示試劑(未顯示)。第一指示試劑可以是如本文所述的任何適合的第一指示試劑。在一些實(shí)施例中，水凝膠315可以包含支持微生物生長的營養(yǎng)物質(zhì)。多個粒子320在水凝膠315的主表面上布置。粒子320可以是任何如本文所述的接受并保持第一生物衍生物的適合粒子。圖3中還顯示生物物質(zhì)330 (例如，如上文所述的生物活性來源)。生物物質(zhì)330可以布置在水凝膠315的主表面(例如,如在微生物學(xué)表面鋪板技術(shù)中)，如圖3中所示，或可以懸浮于水凝膠中(例如，如在微生物學(xué)傾倒鋪板技術(shù)中)，如圖2中所示和上文描述。再參考圖3，如上文所述，當(dāng)生物物質(zhì)330與第一指示試劑反應(yīng)時，它產(chǎn)生游離的第一生物衍生物(“f”)。如上文所述，游離的第一生物衍生物擴(kuò)散遍及包圍生物物質(zhì)330的含水液體(例如，水凝膠315)。如上文所述，一旦與多個粒子320中的一個接觸，則游離的第一生物衍生物“f”被粒子320接受并保持從而變成被保持的第一生物衍生物(“F”)。在圖3中所示的實(shí)施例中，可以使生物物質(zhì)330(其最初可以是待檢驗(yàn)樣品的一部分)、多個粒子320和第一指示試劑(未顯示)單獨(dú)地或以任何組合與水凝膠315處于流體接觸。在一些實(shí)施例中，水凝膠315可以使用包含第一指示試劑的含水液體和/或包含生物物質(zhì)330的樣品來形成。在一些實(shí)施例中，生物物質(zhì)330可以與包含第一指示試劑的水凝膠315處于流體接觸達(dá)一段時間，之后，使多個粒子320與水凝膠315處于流體接觸。在這些實(shí)施例的任一項(xiàng)中，該方法還可以包括提供可以由第二生物活性轉(zhuǎn)化成第二生物衍生物的第二指示試劑。在這些實(shí)施例中，形成包含第一指示試劑和多個粒子的含水分散體包括形成包含第二指示試劑的含水分散體。在這些實(shí)施例中，該方法還包括檢測第二生物衍生物的存在或不存在。在一些實(shí)施例中，第二生物衍生物的存在表示存在第一微生物。因此，在這些實(shí)施例中，可以檢測第一生物衍生物的存在和與第一微生物在樣品中存在相關(guān)的第二生物衍生物的存在。有利地，在這些實(shí)施例中，第二生物指示劑可以起到獨(dú)立地證實(shí)使用第一指示試劑所獲得的結(jié)果的作用。在一些實(shí)施例中，第二指示試劑可以包含熒光團(tuán)。在一些實(shí)施例中，其發(fā)熒光第二生物衍生物可以在熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)反應(yīng)中與發(fā)熒光第一生物衍生物反應(yīng)。FRET反應(yīng)是本領(lǐng)域已知的，并且根據(jù)本發(fā)明，可以指示第一和第二生物活性二者的存在。在一些實(shí)施例中，第二生物指示劑的存在表示存在第二微生物。因此，在這些實(shí)施例中，可以通過檢測第一生物衍生物的存在而檢測第一微生物的存在并且通過檢測第二生物衍生物的存在而檢測第二微生物的存在。有利地，在這些實(shí)施例中，第二生物指示劑可以起到指示多于一種微生物在樣品中的存在的作用。第二指示試劑可以是任何如本文所述的可以與生物活性反應(yīng)以形成第二生物衍生物的生色或生熒光指示試劑，其中所述第二生物衍生物是可與第一生物衍生物分開檢測的(即，可區(qū)分的)，并且其中第二生物指示劑和第二生物衍生物二者均實(shí)質(zhì)上不干擾第一指示劑向第一生物衍生物的轉(zhuǎn)化，也實(shí)質(zhì)上不干擾由多個粒子中的至少一個所保持的第一生物衍生物的檢測。在這些實(shí)施例的任一項(xiàng)中，該方法還可以包括從含水分散體分離多個粒子中的至少一部分。通常，該分離是在已經(jīng)使樣品與包含第一指示試劑和多個粒子的含水分散體接觸后進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，分離多個粒子中的至少一部分可以包括從含水液體的至少一部分中分離一個或多個粒子。在一些實(shí)施例中，從含水液體的至少一部分中分離多個粒子中的至少一部分是在含水液體的原始體積中形成(例如，通過沉降、絮凝或離心)分離粒子的局部濃度的過程。另外或者作為另一種選擇，在一些實(shí)施例中，從含水液體的至少一部分中分離多個粒子中的至少一部分是在更小體積的含水液體中濃縮分離的粒子或從這個部分中實(shí)質(zhì)上移除含水液體(例如，通過借助潷析、抽吸或借助過濾而移除含水液體的至少一部分)的過程。在一些實(shí)施例中，分離步驟可以用來使所述粒子中的一個或多個定位于檢測儀器(例如，熒光細(xì)胞分選器)中的光路內(nèi)。如上文所述，本發(fā)明方法可以包括形成含水分散體，所述水分散體包含第一指示試劑、多個接受并保持第一生物衍生物的粒子和膠凝劑。在一些實(shí)施例中，包含膠凝劑的含水分散體還可以包含樣品(例如，如在 瓊脂傾倒平板技術(shù)中或在使用可從3M公司(明尼蘇達(dá)州圣路易斯)獲得的PETRIFILM培養(yǎng)基的某些常見技術(shù)中，樣品分布在所形成的凝膠中)。在一些可選性實(shí)施例中，可以形成含水分散體，其包含多個粒子、膠凝劑和任選地包含第一指示試劑。在凝膠形成后，樣品和(如果已經(jīng)不存在于水分散體中)第一指示試劑可以分布到凝膠的表面的至少一部分上(例如，如在隨瓊脂培養(yǎng)基一起使用的常見表面鋪板技術(shù)中)。任選地，如本文所述，可以將包含樣品的組合物溫育一段時間。觀察粒子以檢測第一生物衍生物的存在或不存在，其中所述第一生物衍生物被粒子保持。在這些實(shí)施例的任一項(xiàng)中，可以使如本文所述的第二指示試劑與含水分散體處于流體接觸(例如，通過在形成凝膠之前添加第二指示試劑至含水分散體或通過在形成凝膠之后使第二指示試劑分布到凝膠的表面上)。在一些可選性實(shí)施例中，可以形成含水凝膠(例如，包含瓊脂或本領(lǐng)域已知或本文所述的其他合適膠凝劑的含水凝膠)。任選地，含水凝膠可以包含第一指示試劑。在凝膠形成后，樣品、多個粒子和(如果已經(jīng)不存在于含水凝膠中)第一指示試劑可以分布到凝膠的表面的至少一部分上。任選地，如本文所述，可以將包含樣品的組合物溫育一段時間。觀察粒子以檢測第一生物衍生物的存在或不存在，其中所述第一生物衍生物被粒子保持。在這些實(shí)施例的任一項(xiàng)中，可以使如本文所述的第二指示試劑與含水分散體處于流體接觸(例如，通過在形成凝膠之前添加第二指示試劑至含水分散體或通過在形成凝膠之后使第二指示試劑分布到凝膠 的表面上)。本發(fā)明提供一種組合物。在一些實(shí)施例中，該組合物可以在如本文所述的檢測第一微生物的存在的方法中使用。該組合物包含水、可以由第一生物活性轉(zhuǎn)化成第一生物衍生物的第一指示試劑和多個粒子。如本文所述，粒子可以接受并保持來自含水液體的第一生物衍生物。在一些實(shí)施例中，該組合物還可以包含營養(yǎng)物質(zhì)。營養(yǎng)物質(zhì)可以促進(jìn)微生物(例如，如本文所述的第一微生物和/或第二微生物)的生長和/或代謝。在這些實(shí)施例的任一項(xiàng)中，該組合物還可以包含膠凝劑。在一些實(shí)施例中，膠凝劑可以包含冷水可溶性膠凝劑。在一些實(shí)施例中，膠凝劑可以選自羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、聚丙烯酰胺、刺槐豆膠、瓜耳膠、黃原膠和褐藻膠，以及高吸收性材料，包括二醇改性的多糖和淀粉接枝的聚(丙烯酸鈉-共-丙烯酰胺)。膠凝劑可以與水反應(yīng)以形成水凝膠。在該組合物的這些實(shí)施例的任一項(xiàng)中，多個粒子中的至少一部分可以分散(例如，懸浮)于水凝膠中。在該組合物的這些實(shí)施例的任一項(xiàng)中，多個粒子中的至少一部分可以布置在水凝膠的主表面上。在這些實(shí)施例的任一項(xiàng)中，該組合物還可以包含表面活性劑。有利地，表面活性劑可以促進(jìn)粒子在該組合物中的水分散性。表面活性劑可以是陰離子表面活性劑、非離子表面活性劑或陽離子表面活性劑。表面活性劑可以選自硫酸鹽、十二烷基硫酸鈉、磺酸酯、十二烷基苯磺酸鈉、長鏈羧酸鹽、磷酸酯、季銨鹽、十二烷基三甲基氯化銨、聚山梨醇酯、Tween 表面活性劑(例如，TWeen20TM)、Span 表面活性劑、脂肪醇乙氧基化物、Triton X-100、聚環(huán)氧乙烷衍生物和包含聚環(huán)氧丙烷的共聚物(例如:Plur0nicTM或Tergitol 表面活性劑)。在這些實(shí)施例的任一項(xiàng)中，該組合物還可以包含可以由生物活性轉(zhuǎn)化成第二生物衍生物的第二指示試劑。第二指示試劑可以是任何如本文所述的可以與生物活性反應(yīng)以形成第二生物衍生物的生色或生熒光指示試劑，其中所述第二生物衍生物是可與第一生物衍生物分開檢測的(即，可區(qū)分的)，并且其中第二生物指示劑和第二生物衍生物二者均實(shí)質(zhì)上不干擾第一指示劑向第一生物衍生物的轉(zhuǎn)化，也實(shí)質(zhì)上不干擾由多個粒子中的至少一個所保持的第一生物衍生物的檢測。在另一方面，本發(fā)明提供一種制品。該制品可以用來檢測第一微生物(例如，診斷試驗(yàn)中的靶微生物)。在一些實(shí)施例中，該制品可以是包含干培養(yǎng)基的制品，例如在美國專利 N0.4，565，783 ;5，089，413 ;5，232，838 ;5，601，998 ;5，681，712 ;7，141，387 ;中和在美國專利申請?zhí)朜0.61/360, 166中描述的培養(yǎng)裝置。該制品可以包括含有自支承防水基材的本體件，所述基材具有第一主表面和第二主表面；和粘附于第一主表面的至少一部分的涂層。該涂層包含膠凝劑和多個粒子。所述粒子接受并保持來自水凝膠的第一指示試劑的第一生物衍生物并且可以包含任何如本文所述的合適粒子。在一些實(shí)施例中，粒子包含有機(jī)聚合物，所述有機(jī)聚合物選自丙烯酸酯聚合物、聚苯乙烯聚合物、纖維素聚合物、葡聚糖聚合物、任何前述聚合物的組合或衍生物。市售的粒子適用于本發(fā)明的方法中。這些粒子包括例如Soken MX、MR和MP系列、SokenSGP系列和Soken SX-500系列(均可從日本大阪綜研化學(xué)株式會社(Soken Chemicaland Engineering)獲得)；Eudragit RLP0和S-100系列(可從特拉華州紐瓦克贏創(chuàng)工業(yè)(Evonik Industries)獲得)；Amberlite 非離子吸收劑和Amberlite 離子交換樹脂(可從密蘇里州圣路易斯西格瑪化學(xué)有限公司(Sigma Chemical C0.)獲得)；AmberlystTM離子交換樹脂(可從馬薩諸塞州Ward Hill阿法埃莎公司(Alfa Aesar)獲得)；Whatman QA 52和Whatman DE 53 (可從新澤西州皮斯卡塔韋通用電氣醫(yī)療集團(tuán)(GE Healthcare)獲得)；和Sephadex 粒子(可從西格瑪化學(xué)有限公司(Sigma Chemical C0.)獲得)。在一些實(shí)施例中，粒子是單分散性粒子。在一些實(shí)施例中，平均粒徑優(yōu)選地在約0.01微米和約I毫米之間、更優(yōu)選地在約0.05微米和約20微米之間、甚至更優(yōu)選地在約0.1微米和約5微米之間、甚至更優(yōu)選地在約0.2微米和約2微米之間。在一些實(shí)施例中，涂層可以包含冷水可重構(gòu)的脫水涂層，所述脫水涂層包含其中分散有多個粒子的膠凝劑并且可以如美國專利N0.4，565，783中和本文實(shí)例中所描述來制備。在任何實(shí)施例中，該制品還可以包含布置在基層(base layer)的第一主表面和涂層之間并且粘結(jié)性地與該 第一主表面和該涂層結(jié)合的粘合劑層。在一些實(shí)施例中，涂層包含干粉末涂層，所述干粉末涂層包含膠凝劑和多個粒子并且可以如美國專利N0.4，565，783中所描述來制備。在該制品的任何實(shí)施例中，涂層和/或粘合劑層還可以包含第一指示試劑。第一指示試劑可以是任何如本文所述的適合的第一指示試劑。在該制品的任何實(shí)施例中，涂層或粘合劑層可以包含第二指示試劑。第二指示試劑可以是任何如本文所述的適合的第二指示試劑。在該制品的任何實(shí)施例中，涂層可以包含表面活性劑。表面活性劑可以包括陰離子表面活性劑、非離子表面活性劑或陽離子表面活性劑。表面活性劑可以選自硫酸鹽、十二烷基硫酸鈉、磺酸酯、十二烷基苯磺酸鈉、長鏈羧酸鹽、磷酸酯、季銨鹽、十二烷基三甲基氯化銨、聚山梨醇酯、Tween 表面活性劑(例如，Tween 20 ) ,Span 表面活性劑、脂肪醇乙氧基化物、Triton X-100、聚環(huán)氧乙烷衍生物和包含聚環(huán)氧丙烷的共聚物(例如:Pluronic 或Tergi to I 表面活性劑)。實(shí)施例實(shí)施例1是一種檢測生物活性的方法，所述方法包括:
提供:可能包含第一生物活性的樣品；可以由第一生物活性轉(zhuǎn)化成第一生物衍生物的第一指示試劑，其中所述第一指示試劑包含具有熒光團(tuán)的生熒光酶底物，所述熒光團(tuán)選自傘形酮、7-氨基香豆素、β_萘胺、β -萘酚、熒光素、試鹵靈、9Η- (I，3- 二氯-9，9- 二甲基吖啶-2-酮)、羅丹明110、任何前述熒光團(tuán)的衍生物和任何前述熒光團(tuán)的組合；和多個粒子，每個粒子包含接受并保持所述第一生物衍生物的有機(jī)聚合物；形成含水分散體，其包含所述第一指示試劑和所述多個粒子；使所述樣品與所述含水分散體處于流體連通；和檢測所述第一生物衍生物的存在或不存在，其中所述第一生物衍生物被粒子保持。實(shí)施例2是實(shí)施例1的方法，其中檢測所述第一生物衍生物的存在或不存在包括檢測發(fā)熒光第一生物衍生物。實(shí)施例3是實(shí)施例1的方法，其中檢測所述生物衍生物的存在或不存在包括檢測有色生物衍生物。實(shí)施例4是實(shí)施例1或?qū)嵤├?的方法，還包括提供膠凝劑并且其中形成含水分 散體包括形成水凝膠，其中所述多個粒子中的至少一部分分散在所述水凝膠中。實(shí)施例5是實(shí)施例4的方法，其中提供膠凝劑包括提供冷水可溶性膠凝劑。實(shí)施例6是實(shí)施例5的方法，其中冷水可溶性膠凝劑選自羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、聚丙烯酰胺、刺槐豆膠、瓜耳膠、黃原膠和褐藻膠、二醇改性的多糖和淀粉接枝的聚(丙烯酸鈉-共-丙烯酰胺)。實(shí)施例7是前述實(shí)施例中任一項(xiàng)的方法，還包括:提供可以由第二生物活性轉(zhuǎn)化成第二生物衍生物的第二指示試劑；和檢測第二生物衍生物的存在或不存在；其中形成含水分散體包括形成包含第二指示試劑的含水分散體；其中，當(dāng)?shù)诙甘驹噭┌鸁晒饷傅孜飼r，第二指示試劑具有熒光團(tuán)，所述熒光團(tuán)選自傘形酮、7-氨基香豆素、β -萘胺、β -萘酚、熒光素、試鹵靈、9Η- (1，3- 二氯-9，9- 二甲基吖啶-2-酮)、羅丹明110、任何前述熒光團(tuán)的衍生物和任何前述熒光團(tuán)的組合。實(shí)施例8是實(shí)施例4至7中任一項(xiàng)的方法,還包括:提供可以由第二生物活性轉(zhuǎn)化成第二生物衍生物的第二指示試劑； 使所述第二指示試劑與所述水凝膠處于流體連通；和檢測第二生物衍生物的存在或不存在。實(shí)施例9是前述實(shí)施例中任一項(xiàng)的方法，其中使所述樣品與所述含水分散體處于流體接觸包括形成包含所述樣品、所述第一指示試劑和所述多個粒子的含水分散體。實(shí)施例10是前述實(shí)施例中任一項(xiàng)的方法，其中，在使所述樣品與所述含水分散體處于流體連通后，所述方法還包括分離來自含水分散體或在含水分散體內(nèi)部的所述多個粒子的一部分。實(shí)施例11是實(shí)施例10的方法，其中分離所述部分包括通過沉降、離心、絮凝或過濾來分離所述部分。實(shí)施例12是一種檢測生物活性的方法，所述方法包括:提供:可能包含第一生物活性的樣品；可以通過所述生物活性轉(zhuǎn)化成第一生物衍生物的第一指示試劑，其中所述第一指示試劑包含具有熒光團(tuán)的生熒光酶底物，所述熒光團(tuán)選自傘形酮、7-氨基香豆素、β -萘胺、β _萘酌■、突光素、試齒靈、9Η-(1,3_ 二氯-9,9-二甲基B丫唳-2-酮)、羅丹明110、任何前述熒光團(tuán)的衍生物和任何前述熒光團(tuán)的組合；多個粒子，每個粒子包含接受并保持所述第一生物衍生物的有機(jī)聚合物；和膠凝劑；形成水凝膠，其包含所述第一指示試劑和所述膠凝劑；使所述粒子分布在所述水凝膠的主表面的至少一部分上；使所述樣品 與所述水凝膠的一部分處于流體連通；和檢測第一生物衍生物的存在或不存在，其中所述第一生物衍生物被粒子保持，其中第一生物衍生物的存在表示存在第一生物活性。實(shí)施例13是實(shí)施例12的方法，其中檢測第一生物衍生物的存在或不存在包括檢測發(fā)熒光第一生物衍生物或有色第一生物衍生物。實(shí)施例14是實(shí)施例12或?qū)嵤├?3的方法，其中提供所述膠凝劑包括提供冷水可溶性膠凝劑。實(shí)施例15是實(shí)施例14的方法，其中所述冷水可溶性膠凝劑選自羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、聚丙烯酰胺、刺槐豆膠、瓜耳膠、黃原膠和褐藻膠、二醇改性的多糖和淀粉接枝的聚(丙烯酸鈉-共-丙烯酰胺)。實(shí)施例16是實(shí)施例12至15中任一項(xiàng)的方法，還包括:提供可以由第二生物活性轉(zhuǎn)化成第二生物衍生物的第二指示試劑；使所述第二指示劑與所述水凝膠處于流體連通；和檢測第二生物衍生物的存在或不存在；其中第二生物衍生物的存在表示存在第一生物活性。實(shí)施例17是實(shí)施例16的方法，其中使粒子分布在水凝膠的主表面的至少一部分上還包括使第二指示試劑與水凝膠處于流體連通。實(shí)施例18是實(shí)施例16的方法，其中使所述樣品與所述水凝膠的主表面的至少一部分處于流體連通還包括使第二指示試劑與所述水凝膠處于流體連通。實(shí)施例19是實(shí)施例16的方法，其中形成水凝膠還包括形成包含第二指示試劑的水凝膠。實(shí)施例20是實(shí)施例12至15中任一項(xiàng)的方法，還包括:提供可以由第二生物活性轉(zhuǎn)化成第二生物衍生物的第二指示試劑；使所述第二指示劑與所述水凝膠處于流體連通；和檢測第二生物衍生物的存在或不存在。實(shí)施例21是實(shí)施例20的方法，其中使粒子分布在所述水凝膠的主表面的至少一部分上還包括使第二指示試劑與水凝膠處于流體連通。
實(shí)施例22是實(shí)施例20的方法，其中使所述樣品與所述水凝膠的主表面的至少一部分處于流體連通還包括使第二指示試劑與所述水凝膠處于流體連通。實(shí)施例23是實(shí)施例20的方法，其中形成所述水凝膠還包括形成包含第二指示試劑的水凝膠。實(shí)施例24是實(shí)施例12至23中任一項(xiàng)的方法，其中檢測所述第一生物衍生物的存在或不存在包括檢測分立的發(fā)熒光區(qū)域。實(shí)施例25是實(shí)施例24的方法，其中檢測分立的發(fā)熒光區(qū)域進(jìn)一步包括計(jì)數(shù)分立的發(fā)熒光區(qū)域的數(shù)量。實(shí)施例26是實(shí)施例12至23中任一項(xiàng)的方法，其中檢測所述第一生物衍生物的存在或不存在包括檢測分立的有色區(qū)域。實(shí)施例27是實(shí)施例26的方法，其中檢測分立的發(fā)熒光區(qū)域進(jìn)一步包括計(jì)數(shù)分立的有色區(qū)域的數(shù)量。實(shí)施例28是一種組合物，其包含:水；可以由第一生物活性轉(zhuǎn)化成第一生物衍生物的第一指示試劑；和多個顆粒；其中所述第一指示試劑包含具有熒光團(tuán)的生熒光酶底物，所述熒光團(tuán)選自傘形酮、7-氨基香丑素、萘胺、β _萘酌■、突光素、試齒靈、9Η_(1, 3-二氯-9,9-二甲基口丫啶-2-酮)、羅丹明110、任何前述熒光團(tuán)的衍生物和任何前述熒光團(tuán)的組合；其中所述粒子能夠接受并保持來自含水液體的第一生物衍生物。實(shí)施例29是實(shí)施例28的組合物，所述組合物還包含促進(jìn)微生物生長的營養(yǎng)物質(zhì)。實(shí)施例30是實(shí)施例28或?qū)嵤├?9的組合物，所述組合物還包含膠凝劑。實(shí)施例31是實(shí)施例30的組合物，其中所述膠凝劑與水反應(yīng)以形成水凝膠。實(shí)施例32是實(shí)施例30或?qū)嵤├?1的組合物，其中所述膠凝劑包含冷水可溶性膠凝劑。實(shí)施例33是實(shí)施例32的組合物，其中所述冷水可溶性膠凝劑選自羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、聚丙烯酰胺、刺槐豆膠、瓜耳膠、黃原膠和褐藻膠、二醇改性的多糖和淀粉接枝的聚(丙烯酸鈉-共-丙烯酰胺)。實(shí)施例34是實(shí)施例31至33中任一項(xiàng)的組合物，其中所述多個粒子中的至少一部分分散在所述水凝膠中。實(shí)施例35是實(shí)施例31至34中任一項(xiàng)的組合物，其中所述多個粒子中的至少一部分布置在所述水凝膠的主表面上。實(shí)施例36是實(shí)施例28至35中任一項(xiàng)的組合物，所述組合物還包含表面活性劑。實(shí)施例37是實(shí)施例28至36中任一項(xiàng)的組合物，其中所述粒子包含有機(jī)聚合物，所述有機(jī)聚合物選自丙烯酸酯聚合物、聚苯乙烯聚合物、纖維素聚合物、葡聚糖聚合物、任何前述聚合物的組合和任何前述聚合物的衍生物。實(shí)施例38是一種制品，其包括:
包含自支承防水基材的本體件，所述基材具有第一主表面和第二主表面；和粘附于第一主表面的至少一部分的涂層，其中所述涂層包含膠凝劑和多個粒子；
其中所述粒子接受并保持來自水凝膠的第一指示試劑的第一生物衍生物；其中所述第一指示試劑包含具有熒光團(tuán)的生熒光酶底物，所述熒光團(tuán)選自傘形酮、7-氨基香丑素、萘胺、β _萘酌■、突光素、試齒靈、9Η_(1, 3-二氯-9,9-二甲基口丫啶-2-酮)、羅丹明110、任何前述熒光團(tuán)的衍生物和任何前述熒光團(tuán)的組合。實(shí)施例39是實(shí)施例38的制品，其中所述膠凝劑包含干的、冷水可溶性膠凝劑。實(shí)施例40是實(shí)施例39的制品，其中所述膠凝劑選自羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、聚丙烯酰胺、刺槐豆膠、瓜耳膠、黃原膠和褐藻膠、二醇改性的多糖和淀粉接枝的聚(丙烯酸鈉_共-丙烯酰胺)。實(shí)施例41是實(shí)施例38至40中任一項(xiàng)的制品，其中所述第一生物衍生物是發(fā)熒光化合物。實(shí)施例42是實(shí)施例38至41中任一項(xiàng)的制品，其中所述制品還包含第一指示試劑。實(shí)施例43是實(shí)施例38至42中任一項(xiàng)的制品，所述制品還包含布置在所述涂層和所述第一主表面之間的粘合劑層，其中所述粘合劑層布置在所述第一主表面和所述涂層之間并且粘結(jié)性地與所述第一主表面和所述涂層結(jié)合。實(shí)施例44是實(shí)施例38至43中任一項(xiàng)的制品，其中所述涂層還包含營養(yǎng)物質(zhì)。實(shí)施例45是實(shí)施例38至44中任一項(xiàng)的制品,其中所述涂層或所述粘合劑層包含第二指示試劑。實(shí)施例46是實(shí)施例38至45中任一項(xiàng)的制品,其中所述涂層或所述粘合劑層還包含選擇劑。實(shí)施例47是實(shí)施例38至46中任一項(xiàng)的制品，其中所述粒子包含有機(jī)聚合物，所述有機(jī)聚合物選自丙烯酸酯聚合物、聚苯乙烯聚合物、纖維素聚合物、葡聚糖聚合物、任何前述聚合物的組合和任何前述聚合物的衍生物。實(shí)施例48是實(shí)施例38至47中任一項(xiàng)的制品，其中所述涂層還包含表面活性劑。實(shí)施例49是實(shí)施例48的制品,其中所述表面活性劑包括陰離子表面活性劑、非離子表面活性劑或陽離子表面活性劑。實(shí)施例50是實(shí)施例49的制品，其中所述表面活性劑選自硫酸鹽、十二烷基硫酸鈉、磺酸酯、十二烷基苯磺酸鈉、長鏈羧酸鹽、磷酸酯、季銨鹽、十二烷基三甲基氯化銨、聚山梨醇酯、Tween 表面活性劑(例如，Tween 20 )、Span 表面活性劑、脂肪醇乙氧基化物、Triton X-100、聚環(huán)氧乙烷衍生物和包含聚環(huán)氧丙烷的共聚物(例如:Pluronic 或Tergitol 表面活性劑)。實(shí)施例51是實(shí)施例1至27中任一項(xiàng)的方法、實(shí)施例28至37中任一項(xiàng)的組合物或?qū)嵤├?8至50中任一項(xiàng)的制品，其中所述粒子的直徑為約0.01 μ m至約1000 μ m。實(shí)施例52是實(shí)施例1至27或?qū)嵤├?1中任一項(xiàng)的方法、實(shí)施例28至37或?qū)嵤├?1中任一項(xiàng)的組合物或?qū)嵤├?8至51中任一項(xiàng)的制品，其中所述粒子是水可分散的。實(shí)施例53是 實(shí)施例1至27中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一生物活性是存在第一微生物的指示。實(shí)施例54是實(shí)施例7至13和實(shí)施例18至27中任一項(xiàng)的方法，其中第二指示試劑是存在第一微生物的指示。
實(shí)施例55是實(shí)施例7至13、實(shí)施例18至27或?qū)嵤├?4中任一項(xiàng)的方法，其中第二指示試劑是存在第二微生物的指示。實(shí)施例56是前述實(shí)施例中任一項(xiàng)的方法，其中第二指示試劑，如果存在的，包含生色指示試劑。通過以下實(shí)例說明本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解,特定實(shí)例、材料、量和程序應(yīng)根據(jù)如本文中所闡述的本發(fā)明的范圍和精神進(jìn)行廣義地解釋。SM實(shí)例中使用的材料.PBS-從Sigma-Aldrich (圣路易斯,密蘇里州)獲得的磷酸鹽緩沖鹽水 從3M公司(圣保羅，明尼蘇達(dá)州)獲得的Butterfields緩沖液 從EMD Biosciences (拉荷亞,加利福尼亞州)獲得的β _D_半乳糖苷酶(目錄號 #345788)
從Sigma-Aldrich (圣路易斯，密蘇里州)獲得的豬肝臟酯酶(#E3019).DMSO-從 EMD Chemicals (Gibbstown,新澤西州)獲得的二甲基亞諷.TSB-胰蛋白胨大豆肉湯-從Becton Dickinson獲得的BD#211822 黃原膠-可從CP Kelco (亞特蘭大，佐治亞州)獲得的KELTR0L黃原膠 刺槐豆膠-從CP Kelco (亞特蘭大，佐治亞州)獲得的Genu Gum表面活性劑.Triton X-lOO -從Sigma-Aldrich (圣路易斯,密蘇里州)獲得的非離子表面活性劑.Tween-20 -從Sigma-Aldrich (圣路易斯，密蘇里州)獲得的聚山梨醇酯表面活性劑.SDBS-從TCI America(波特蘭，俄勒岡州)獲得的十二烷基苯磺酸鈉.DTAC-從K&K實(shí)驗(yàn)室(普萊恩維尤，紐約州)獲得的十二烷基三甲基氯化銨.SDS-從Alfa Aesar (Ward Hill，馬薩諸塞州)獲得的十二烷基硫酸鈉熒光閉:.MHCgal-如 Chilvers 等人,J.Appl.Microbiology (應(yīng)用微生物雜志)2001,91,1118-1130中所述制備的甲基-7-羥基香豆素-3-羧酸半乳糖苷.TUacetate-如美國專利N0.6, 556, 508中所述制備的3_噻吩基傘形酮乙酸酯.TUgal-如美國專利N0.6，556，508中所述制備的3_噻吩基傘形酮半乳糖苷粒子: 從綜研化學(xué)株式會社(Soken Chemical and Engineering)(大阪，日本)獲得的聚丙烯酸酯粒子:O MX-180-單分散性丙烯酸酯粒子(1.8微米平均直徑)O MX-2000-單分散性丙烯酸酯粒子(20.0微米平均直徑)O MX-500-單分散性丙烯酸酯粒子(5.0微米平均直徑)O MR-10HG-多分散性丙烯酸酯粒子(10.0微米平均直徑)O MR-7HG-多分散性丙烯酸酯粒子(6.0微米平均直徑)O MR-2HG-多分散性丙烯酸酯粒子(2.0微米平均直徑)
O MR-2G-多分散性丙烯酸酯粒子(1.0微米平均直徑)O MP-1000-單分散性丙烯酸酯粒子(0.40微米平均直徑)O SGP-70C-多分散性聚苯乙烯粒子(20.0微米平均直徑)O SX-500H-單分散性聚苯乙烯粒子(5.0微米平均直徑).QA 52-ffhatman QA 52 (GE Healthcare (皮斯卡塔韋，新澤西州))獲得的基于強(qiáng)堿陰離子交換纖維素的樹脂.DE 53-ffhatman DE 53 (GE Healthcare (皮斯卡塔韋，新澤西州))獲得的基于弱堿陰離子交換纖維素的樹脂# XAD-16-Amberlite XAD-16-從 Sigma-Aldrich 獲得的基于聚苯乙烯的非離子吸收劑# G-75-50-Sephadex G-75-40 從 Sigma-Aldrich 獲得的交聯(lián)葡聚糖# S-300-Sephacryl S-300-從 GE Healthcare 獲得的烯丙基葡聚糖粒子.IR-45CP-Amberlite IR-45CP-從 Mallinckrodt (帕里斯，肯塔基州)獲得的弱堿性大孔網(wǎng)狀聚苯乙烯陰離子交換樹脂.IRA-400CP-Amberlite IRA-400CP-從 Mallinckrodt (帕里斯，肯塔基州)獲得的強(qiáng)堿性聚苯乙烯陰離子交換樹脂#A-21-Amberlyst A-21-從 Alfa Aesar (Ward Hill，馬薩諸塞州)獲得的弱堿性大孔網(wǎng)狀聚苯乙烯陰離子交換樹脂
`
.MAPTAC-[3-(甲基丙烯酰氨基)丙基]三甲基氯化銨分散體，在水中按重量計(jì)約10%，根據(jù)美國專利N0.7，647，835制備培養(yǎng)平板的制備將50g黃原膠粉末和50g刺槐豆膠粉末的混合物置于500mL瓶中并且手動振搖約5分鐘。通過將該混合物撒布到壓敏膠粘涂層片材的粘性面(從3M公司(圣路易斯，明尼蘇達(dá)州)獲得的9795R高級密封帶)上，制備覆蓋薄膜。該膠的涂覆重量是大約85mg/24平方英寸。通過混合22.8份酪蛋白胰酶消化物、15.9份酵母膏、45.5份丙酮酸鈉、4.1份右旋糖、9.0份磷酸氫二鉀和2.8克磷酸二氫鉀，制備營養(yǎng)混合物。通過在燒杯中使用氣動混合器混合500mL去離子水與14.78克的以上營養(yǎng)混合物,制備營養(yǎng)培養(yǎng)液。隨后,將5克刺槐豆膠以小增量與培養(yǎng)液混合，隨后徹底混合幾分鐘。隨后將燒杯用箔覆蓋并且將混合物加熱至80°C并混合約6分鐘，然后在不加熱下混合的同時讓其冷卻約十分鐘。然后將培養(yǎng)液傾入經(jīng)滅菌的燒杯，用塑料袋覆蓋并冷藏。將冷卻的培養(yǎng)液用刮鏟小心攪拌以避免形成氣泡，隨后用刮刀涂布到9.5英寸寬、4密爾厚的聚對苯二甲酸乙二醇酯薄膜片材(可作為MELINEX 453從杜邦帝人薄膜公司(DuPont Teijin Films)(霍普韋爾，弗吉尼亞州)獲得)上至每24平方英寸約150mg(每平方厘米約Img)的干涂層重量。使涂布的膜在設(shè)定于210°C溫度的烘爐中干燥約10分鐘。通過將8英寸(20.3cm)寬4密爾厚的聚苯乙烯泡沫片材層合至襯墊上的壓敏轉(zhuǎn)移膠帶，制備層合材料。從這個層合材料沖切直徑為5厘米的圓盤以在該層合材料上形成居中于3英寸(7.6厘米)正方形內(nèi)的圓形切除盤，并且移除所述圓盤。將襯墊從剩余的層合材料移除并將聚苯乙烯泡沫的涂布粘合劑的表面粘附至涂布培養(yǎng)液的片材，以提供基礎(chǔ)件，所述基礎(chǔ)件具有涂布培養(yǎng)液的自支承基材和粘附于該支撐基材的涂布培養(yǎng)液的表面的疏水性間隔部件(即“泡沫擋板”)。從層合材料切下3英寸X4英寸(7.6厘米X10.16厘米)大小的矩形板，圓形切除開口自該4英寸長度的一個末端居中于3英寸(7.6厘米)正方形內(nèi)。將覆蓋薄膜置于板上，涂布粉末的側(cè)面朝向泡沫擋板并且用雙側(cè)壓敏膠帶連接以形成培養(yǎng)平板。實(shí)例1~7和1-TUacetate力口粒子和酶通過在ImL DMSO中溶解Img TUacetate制備染料溶液。通過在小瓶中將0.5mL的該染料溶液與表I中所示的大約IOOmg粒子混合，制備含水的顆粒物分散體。隨后將50 μ L豬肝臟酯酶(PBS中l(wèi)mg/ml)添加至每個小瓶以釋放熒光TU。在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室熒光燈(365nm)下觀察小瓶的熒光。熒光如下評級:一_或無；+(微弱)；++(中等微弱)；+++(中等)；++++(強(qiáng)烈)表I中顯示每種粒子或沒有粒子情況下的觀察結(jié)果。表1-TUacetate加粒子時的熒光
權(quán)利要求
1.一種檢測生物活性的方法，所述方法包括: 提供: 可能包含第一生物活性的樣品； 可以通過第一生物活性轉(zhuǎn)化成第一生物衍生物的第一指示試劑，其中所述第一指示試劑包含具有熒光團(tuán)的發(fā)熒光酶底物，所述熒光團(tuán)選自傘形酮、7-氨基香豆素、β-萘胺、β -萘酚、熒光素、試鹵靈、9Η- (I，3- 二氯-9，9- 二甲基吖啶-2-酮)、羅丹明110、任何前述熒光團(tuán)的衍生物和任何前述熒光團(tuán)的組合；和 多個粒子，每個粒子包含接受并保持所述第一生物衍生物的有機(jī)聚合物； 形成包含所述第一指示試劑和所述多個粒子的含水分散體； 使所述樣品與所述含水分散體處于流體連通；和 檢測所述第一生物衍生物的存在或不存在，其中所述第一生物衍生物被粒子保持。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中檢測所述第一生物衍生物的存在或不存在包括檢測發(fā)熒光第一生物衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中檢測所述生物衍生物的存在或不存在包括檢測有色生物衍生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，所述方法還包括提供膠凝劑，并且其中形成所述含水分散體包括形成水凝膠，其中所述多個粒子中的至少一部分分散在所述水凝膠中。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括: 提供可以由第二生物活性轉(zhuǎn)化成第二生物衍生物的第二指示試劑；和 檢測所述第二生物衍生物的存在或不存在； 其中形成所述含水分散體包括形成包含所述第二指示試劑的含水分散體； 其中，當(dāng)所述第二指示試劑包含生熒光酶底物時，所述第二指示試劑具有熒光團(tuán)，所述熒光團(tuán)選自傘形酮、7-氨基香豆素、β -萘胺、β -萘酚、熒光素、試鹵靈、9Η-(1，3- 二氯-9，9- 二甲基吖啶-2-酮)、羅丹明110、任何前述熒光團(tuán)的衍生物和任何前述熒光團(tuán)的組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或權(quán)利要求5中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括: 提供可以由第二生物活性轉(zhuǎn)化成第二生物衍生物的第二指示試劑； 使所述第二指示試劑與所述水凝膠處于流體連通；和 檢測所述第二生物衍生物的存在或不存在； 其中，當(dāng)所述第二指示試劑包含生熒光酶底物時，所述第二指示試劑具有熒光團(tuán)，所述熒光團(tuán)選自傘形酮、7-氨基香豆素、β -萘胺、β -萘酚、熒光素、試鹵靈、9Η-(1，3- 二氯-9，9- 二甲基吖啶-2-酮)、羅丹明110、任何前述熒光團(tuán)的衍生物和任何前述熒光團(tuán)的組合。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中使所述樣品與所述含水分散體處于流體接觸包括形成包含所述樣品、所述第一指示試劑和所述多個粒子的含水分散體。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在使所述樣品與所述含水分散體處于流體連通后，所述方法還包括分離來自所述含水分散體或在所述含水分散體內(nèi)部的所述多個粒子的一部分。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中分離所述部分包括通過沉降、離心、絮凝或過濾來分離所述部分。
10.一種檢測生物活性的方法，所述方法包括: 提供: 可能包含第一生物活性的樣品； 可以由所述生物活性轉(zhuǎn)化成第一生物衍生物的第一指示試劑，其中所述第一指示試劑包含具有熒光團(tuán)的生熒光酶底物，所述熒光團(tuán)選自傘形酮、7-氨基香豆素、β -萘胺、β -萘酚、熒光素、試鹵靈、9Η- (I，3- 二氯-9，9- 二甲基吖啶-2-酮)、羅丹明110、任何前述熒光團(tuán)的衍生物和任何前述熒光團(tuán)的組合； 多個粒子，每個粒子包含接受并保持所述第一生物衍生物的有機(jī)聚合物；和 膠凝劑； 形成包含所述第一指示試劑和所述膠凝劑的水凝膠； 使所述粒子分布在所述水凝膠的主表面的至少一部分上； 使所述樣品與所述水凝膠的一部分處于流體連通；和 檢測所述第一生物衍生物的存在或不存在，其中所述第一生物衍生物被粒子保持，其中所述第一生物衍生物的存在表示存在第一生物活性。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括: 提供可以由第二生物活性轉(zhuǎn)化 成第二生物衍生物的第二指示試劑； 使所述第二指示劑與所述水凝膠處于流體連通；和 檢測所述第二生物衍生物的存在或不存在； 其中所述第二生物衍生物的存在表示存在所述第一生物活性。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或權(quán)利要求11中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括: 提供可以由第二生物活性轉(zhuǎn)化成第二生物衍生物的第二指示試劑； 使所述第二指示劑與所述水凝膠處于流體連通；和 檢測所述第二生物衍生物的存在或不存在。
13.根據(jù)權(quán)利要求10至權(quán)利要求12中任一項(xiàng)所述的方法，其中檢測所述第一生物衍生物的存在或不存在包括檢測分立的發(fā)熒光區(qū)域。
14.一種組合物,所述組合物包含: 水； 可以由第一生物活性轉(zhuǎn)化成第一生物衍生物的第一指示試劑；和 多個顆粒； 其中所述第一指示試劑包含具有熒光團(tuán)的生熒光酶底物，所述熒光團(tuán)選自傘形酮、氨基香丑素、β_萘胺、β _萘酌■、突光素、試齒靈、9Η-(1,3_ 二氯-9,9-二甲基口丫啶-2-酮)、羅丹明110、任何前述熒光團(tuán)的衍生物和任何前述熒光團(tuán)的組合； 其中所述粒子能夠接受并保持來自含水液體的所述第一生物衍生物。
15.一種制品，包括: 包含自支承防水基材的本體件，所述基材具有第一主表面和第二主表面；和 粘附于所述第一主表面的至少一部分的涂層，其中所述涂層包含膠凝劑和多個粒子； 其中所述粒子接受并保持來自水凝膠的第一指示試劑的第一生物衍生物； 其中所述第一指示試劑包含具有熒光團(tuán)的生熒光酶底物，所述熒光團(tuán)選自傘形酮、 氨基香丑素、β_萘胺、β _萘酌■、突光素、試齒靈、9Η-(1,3_ 二氯-9,9-二甲基口丫啶-2-酮)、羅丹明110、 任何前述熒光團(tuán)的衍生物和任何前述熒光團(tuán)的組合。
全文摘要
本發(fā)明提供包含水、可以由第一生物活性轉(zhuǎn)化成第一生物衍生物的第一指示試劑和多個粒子的組合物。所述第一指示試劑可以包含具有熒光團(tuán)的生熒光酶底物，所述熒光團(tuán)選自傘形酮、7-氨基香豆素、β-萘胺、β-萘酚、熒光素、試鹵靈、9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮)、羅丹明110、任何前述熒光團(tuán)的衍生物和任何前述熒光團(tuán)的組合。所述粒子能夠接受并保持來自含水液體的第一生物衍生物。第一生物衍生物可以指示微生物。所述組合物還可以包含膠凝劑。本發(fā)明還提供使用所述組合物來檢測微生物在樣品中的存在或不存在的方法。
文檔編號C12Q1/04GK103228795SQ201180056542
公開日2013年7月31日 申請日期2011年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月24日
發(fā)明者S·B·羅斯科, K·J·霍爾沃森, J·D·米勒, S·J·莫勒, J·W·比約克 申請人:3M創(chuàng)新有限公司