專利名稱：參與由細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)至可育的蛋白質(zhì)及編碼該蛋白質(zhì)的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及參與由細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)至可育的基因。更具體地說，本發(fā)明涉及參與為開發(fā)第一代雜交品種(以下略稱為F1)所用的細胞質(zhì)雄性不育特性(以下有時略稱為cms)恢復(fù)的基因、含有該基因的載體以及性狀轉(zhuǎn)化體。
背景技術(shù)：
谷類、蔬菜等農(nóng)作物具有以下特征(1)因雜種優(yōu)勢而形成優(yōu)異的農(nóng)業(yè)遺傳特性；(2)收獲物的均一性；(3)為了在下一代分離遺傳特性，保護育種者的利益等，因而F1品種的開發(fā)很活躍，而且在很多主要作物中已實際應(yīng)用。
作為生產(chǎn)F1品種的種子的方法之一，有由細胞質(zhì)雄性不育(cms)系統(tǒng)及恢復(fù)該雄性不育(以下有時略稱為Rf)的系統(tǒng)組成的cms/Rf采種系統(tǒng)，例如已在稻子、高粱、玉米等谷類以及葵花籽等油類作物中進行開發(fā)，但是這些都是采用交配和細胞融合技術(shù)開發(fā)得到的。
另一方面，對于油菜科，利用自身不相容性的F1采種系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用，但對油菜籽，因其不具有穩(wěn)定的自身不相容性，需要利用cms系統(tǒng)和Rf系統(tǒng)的F1采種系統(tǒng)。
與此相對，近年來正在進行在油菜籽中利用來源于Kosena蘿卜的細胞質(zhì)雄性不育(Kosena cms)系統(tǒng)和來源于Ogura蘿卜的細胞質(zhì)雄性不育(Ogura cms)系統(tǒng)的研究。兩種cms基因都在細胞質(zhì)小器官線粒體的基因組中編碼，而且其堿基序列也已知，但對蘿卜的分子生物學(xué)研究沒有進展，對于分離基因所必要的標(biāo)記也處于幾乎不知道的現(xiàn)狀，所以很難從核分離基因，只能由蘿卜的可育性恢復(fù)系統(tǒng)，使用交配或細胞融合技術(shù)將Rf基因引入油菜籽。
此外，關(guān)于Rf基因，根據(jù)植物的各cms系統(tǒng)，存在1種或多種恢復(fù)基因。對于蘿卜，在恢復(fù)可育性時Rf1基因和Rf2基因必需同時存在。此外，已知Rf1基因能夠大幅度減少作為蘿卜的cms原因蛋白質(zhì)已知的線粒體內(nèi)ORF125蛋白質(zhì)(M.Iwabuchi等，Plant Mol.Biol.39183-188，1999)的積蓄量。(育種學(xué)雜志47(分冊1)P186，1997；育種學(xué)雜志48(分冊1)P197，1998)。
關(guān)于油菜籽，根據(jù)遺傳解析試驗還可知道，通過交配或細胞融合導(dǎo)入的蘿卜的Rf1基因能夠減少作為cms原因蛋白質(zhì)已知的ORF125或ORF138蛋白質(zhì)(M.Grelon等，Mol.Gen.Genet.243540-547)的蓄積量，這些ORF125或ORF138蛋白質(zhì)的積蓄量減少與可育性恢復(fù)的現(xiàn)象完全一致(N.Koizuka等，Theor Appl Gene，100949-955，2000)。亦即，在油菜籽雄性不育系統(tǒng)中恢復(fù)可育性，必須減少ORF125或ORF138蛋白質(zhì)的積蓄量，因此，Rf1基因是重要的基因。
但是，關(guān)于Rf基因的堿基序列，只鑒定和分離出Rf2基因，Rf2基因是玉米cms之一的T細胞質(zhì)的恢復(fù)基因之一，而對其他植物的Rf基因的堿基序列則是完全未知的。

發(fā)明內(nèi)容
已知通過交配或細胞融合導(dǎo)入了來源于Ogura蘿卜的Rf1基因的油菜籽恢復(fù)系統(tǒng)和以該系統(tǒng)作為父本產(chǎn)生的F1品種中，葡萄糖異硫氰酸鹽(glucosinolate)(以下簡稱為GSL)的含量比規(guī)定值高，實際應(yīng)用上存在問題。認為這是由于與GSL生物合成有關(guān)的來源于蘿卜的基因存在于Rf1基因附近，從而形成強的遺傳連鎖，因此使油菜籽的恢復(fù)系統(tǒng)(Rf系統(tǒng))的GSL含量上升。GSL包含在油菜榨油后的渣滓中，已知將其作為飼料喂給動物時，會造成甲狀腺肥大，因此，在北美要求在育種階段油菜種子的GSL含量控制在18μmole/g以下，在歐洲要求控制在20μmole/g以下。
此外，近年來，通過基因重組添加除草劑耐性等功能的植物開發(fā)蓬勃開展，為了有效地創(chuàng)造出這些植物，僅有通過交配或細胞融合得到的油菜籽恢復(fù)系統(tǒng)是不夠的，因此，希望分離Rf基因，尤其是來源于蘿卜的Rf1基因。
亦即，本發(fā)明所要解決的問題在于分離Rf基因，特別是來源于蘿卜的Rf1基因并鑒定其結(jié)構(gòu)。而且，本發(fā)明所要解決的問題還在于提供利用分離的Rf基因建立油菜籽恢復(fù)系統(tǒng)的方法。
本發(fā)明者為了解決上述問題而進行了努力的研究，結(jié)果從蘿卜和油菜籽成功地克隆了Rf1基因，解決了本課題的問題。
亦即，按照本發(fā)明，提供一種與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)為可育有關(guān)的蛋白質(zhì)，其特征在于，具有PentatricopeptideRepeat(以下簡稱為PPR)基序14個以上，該PPR基序群分為3個以上的模序，每個模序至少有2個以上的PPR基序，而且，在羧基末端(C末端)一側(cè)的模序有4個PPR基序。
根據(jù)上述蛋白質(zhì)的優(yōu)選方式提供PPR基序數(shù)為14-16個的蛋白質(zhì)；PPR基序群分為3個模序，自氨基末端(N末端)一側(cè)起，各模序依次有5個、7個及4個PPR基序的蛋白質(zhì)；從氨基末端(N末端)一側(cè)起第2個PPR基序中存在的第4個氨基酸為絲氨酸、蘇氨酸或半胱氨酸以外的氨基酸的蛋白質(zhì)；從氨基末端(N末端)一側(cè)起第2個PPR基序中存在的第4個氨基酸為天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或組氨酸中任意一種的蛋白質(zhì)；以及，在氨基末端具有用于易位至線粒體的信號肽序列，或者羧基末端具有-LysAspGluLeu-序列的蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育性的蛋白質(zhì)，其特征在于，使其與細胞質(zhì)雄性不育基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物接觸后，使該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物發(fā)生凝膠移位。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供具有序列號26所述的氨基酸序列，參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育性的蛋白質(zhì)；具有序列號27所述的氨基酸序列，參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育性的蛋白質(zhì)；具有序列號28所述的氨基酸序列，參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育性的蛋白質(zhì)；以及具有序列號29所述的氨基酸序列，參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育性的蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供下述任何一種蛋白質(zhì)。
(1)具有序列號3所述氨基酸序列的第80-687的氨基酸序列、序列號17所述氨基酸序列的第80-687的氨基酸序列、或序列號19所述氨基酸序列的第82-690的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或(2)具有序列號3所述氨基酸序列的第80-687的氨基酸序列、序列號17所述氨基酸序列的第80-687的氨基酸序列、或序列號19所述氨基酸序列的第82-690的氨基酸序列中1個至多個氨基酸缺失、添加和/或置換的氨基酸序列，而且參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育性的蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供下述任何一種蛋白質(zhì)。
(1)具有序列號3、序列號17、或序列號19所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或(2)具有序列號3、序列號17、或序列號19所述氨基酸序列中1個至多個氨基酸缺失、添加和/或置換的氨基酸序列，而且參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育性的蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明中優(yōu)選細胞質(zhì)雄性不育個體含有Kosena蘿卜和/或Ogura蘿卜的細胞質(zhì)雄性不育基因或其同源物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供編碼上述本發(fā)明的任何一種蛋白的DNA。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供具有序列號22所述堿基序列的DNA；具有序列號23所述堿基序列的DNA；具有序列號24所述堿基序列的DNA；以及具有序列號25所述堿基序列的DNA。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供下述任何一種DNA。
(1)具有序列號2、序列號16、或序列號18所述堿基序列的DNA；或(2)具有序列號2、序列號16、或序列號18所述堿基序列中1至多個堿基缺失、添加和/或置換的堿基序列，而且參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育性的DNA；或(3)與具有序列號2、序列號16、或序列號18所述堿基序列的DNA在嚴(yán)格條件下雜交，而且參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育性的DNA；根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供下述任何一種DNA。
(1)具有序列號1所述堿基序列的第3754-第8553位堿基的序列，或序列號15所述堿基序列的第812-第3002位堿基的序列的DNA；(2)具有序列號1所述堿基序列的第3754-第8553位堿基的序列，或序列號15所述堿基序列的第812-第3002位堿基的序列中1至多個堿基缺失、添加和/或置換的堿基序列，而且參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育性的DNA；或(3)與具有序列號1所述堿基序列的第3754-第8553位堿基的序列，或序列號15所述堿基序列的第812-第3002位堿基的序列的DNA在嚴(yán)格條件下雜交，而且參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育性的DNA。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供下述任何一種DNA。
(1)具有序列號1或序列號15所述堿基序列的DNA；或(2)具有序列號1或序列號15所述堿基序列中1至多個堿基缺失、添加和/或置換的堿基序列，而且參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育性的DNA；或(3)與具有序列號1或序列號15所述堿基序列的DNA在嚴(yán)格條件下雜交，而且參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育性的DNA。
在本發(fā)明中優(yōu)選細胞質(zhì)雄性不育個體含有Kosena蘿卜和/或Ogura蘿卜的細胞質(zhì)雄性不育基因或其同源物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供含有本發(fā)明DNA的載體。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供含有本發(fā)明DNA或本發(fā)明載體的性狀轉(zhuǎn)化體。性狀轉(zhuǎn)化體優(yōu)選為性狀轉(zhuǎn)化植物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種將細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)為可育的方法，其特征在于，使用本發(fā)明的DNA。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種性狀轉(zhuǎn)化體，該性狀轉(zhuǎn)化體含有細胞質(zhì)雄性不育基因，而且通過在含有本發(fā)明DNA的細胞中進一步導(dǎo)入本發(fā)明DNA的部分或全部以及誘導(dǎo)型啟動子，能夠調(diào)節(jié)雄性不育恢復(fù)基因表達。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種通過利用上述性狀轉(zhuǎn)化體維持細胞質(zhì)雄性不育系統(tǒng)的方法。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種參與細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)的基因的檢測方法，使用由上述本發(fā)明DNA任意設(shè)定的15-50mer低聚核苷酸引物，或由上述本發(fā)明DNA的全部或部分構(gòu)成的至少15mer以上的探針，通過確認在目的生物樣品中用該引物擴增的堿基序列的量，或用探針檢測的堿基序列的量在1個基因組中為1個基因以上，檢測參與細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)的基因。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供具有序列號1所述堿基序列的第3754-第5091位堿基的序列，或序列號15所述堿基序列的第1-第811位堿基的序列的啟動子DNA。
附圖的簡要說明

圖1表示Rf標(biāo)記基因圖譜。
圖2表示含有完整的序列號1所述堿基序列的lambda克隆CHI結(jié)構(gòu)的模式圖。
圖3表示用PCR法檢測性狀轉(zhuǎn)化體中導(dǎo)入的DNA的結(jié)果。
泳道1對照載體；泳道2性狀轉(zhuǎn)化油菜籽；泳道3細胞質(zhì)雄性不育油菜籽。
a3186bp-3753bp，長度568bpb4869bp-5112bp，長度244bpc7766bp-8250bp，長485bp圖4表示用Western印跡法解析性狀轉(zhuǎn)化體中CMS蛋白質(zhì)ORF125積畜量減少的結(jié)果。
泳道1細胞質(zhì)雄性不育油菜籽 -1- 15μg泳道2可育性恢復(fù)油菜籽15μg泳道3細胞質(zhì)雄性不育油菜籽 -2- 15μg泳道4-7細胞質(zhì)雄性不育油菜籽 -2-15/2μg、15/4μg、15/8μg、15/16μg稀釋系列泳道8性狀轉(zhuǎn)化油菜籽15μg圖5表示由性狀轉(zhuǎn)化油菜籽的開花體取出花粉，在顯微鏡下觀察的結(jié)果。
圖6表示pSTV125-5′#LA6和pSTV125-5′#LA12的堿基序列。
發(fā)明的最佳實施方式以下，就本發(fā)明的實施方式進行詳細說明。
(1)本發(fā)明蛋白質(zhì)的實施方案本發(fā)明的蛋白質(zhì)涉及下述(i)至(v)的任何一種蛋白質(zhì)。
(i)參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的蛋白質(zhì)，其特征在于，具有14個以上的Pentatricopeptide Repeat(以下略稱為PPR)基序，該PPR基序群分為3個以上的模序，每個模序分別具有至少2個以上的PPR基序，而且，羧基末端(C末端)一側(cè)的模序有4個PPR基序；(ii)一種蛋白質(zhì)，其特征在于，與細胞質(zhì)雄性不育基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物接觸后，使該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物發(fā)生凝膠移位；(iii)參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的蛋白質(zhì)，其具有序列號26-29中任何一個序列所述的氨基酸序列；(iv)下述任何一種蛋白質(zhì)(1)具有序列號3所述氨基酸序列的第80-687位的氨基酸序列、序列號17所述氨基酸序列的第80-687位的氨基酸序列、或序列號19所述氨基酸序列的第82-690位的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或(2)具有序列號3所述氨基酸序列的第80-687位的氨基酸序列、序列號17所述氨基酸序列的第80-687位的氨基酸序列、或序列號19所述氨基酸序列的第82-690位的氨基酸序列中1個至多個氨基酸缺失、添加和/或置換的氨基酸序列，而且參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育性的蛋白質(zhì)；以及(v)下述任何一種蛋白質(zhì)(1)具有序列號3、序列號17、或序列號19所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或(2)具有序列號3、序列號17、或序列號19所述氨基酸序列中1個至多個氨基酸缺失、添加和/或置換的氨基酸序列，而且參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育性的蛋白質(zhì)。
本說明書中，PPR基序是指“Pentatricopeptide Repeat”基序。該PPR基序是在進行擬南芥屬基因組課題研究中發(fā)現(xiàn)的一種新型蛋白質(zhì)的基序結(jié)構(gòu)。其基本基序是35個簡并(degenerate)的氨基酸序列在其蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)上串聯(lián)重復(fù)。PPR基序具有下述序列所代表的氨基酸共有序列氨基末端(N末端)-“VTYNTLISGYCKNGKLEEALELFEEMKEKGIKPDV”-羧基末端(C末端)。該基序是由Small和Peeters(文獻Trens Biochem Sci 2000，25 46-47)提出的，在該參考文獻出版的當(dāng)時，擬南芥屬基因組中約有200個含有此基序的基因已在GeneBank(http//WWW.ncbi.nlm.nih.gov/Genebank/index.html)等基因Bank中登記?，F(xiàn)在，通過英國Sanger研究所內(nèi)的Proteinfamilies database of alignments and HMNs(以下簡稱為Pfam，http//WWW.Sanger.ac.uk/Software/Pfam/search.shtml)中的程序，很容易對某種任意蛋白質(zhì)是否具有此基序結(jié)構(gòu)作出判斷。
到目前為止，含有PPR基序的蛋白質(zhì)的功能已清楚的例子有1)易位至線粒體的蛋白質(zhì)，即酵母的PET309和粗糙脈孢菌的CYA-5，與線粒體基因coxl mRNA相互作用，在轉(zhuǎn)錄后加工或翻譯水平上調(diào)節(jié)coxl的表達(Manthey and McEwen EMBO J 1995 14 4031-4043，Coffin等，Curr Genet 1997 32 273-280)，以及2)易位至葉綠體的PPR基序蛋白質(zhì)，即玉米的CRP1，是葉綠體基因petA和petD基因的翻譯所必須的，而且也是petDmRNA的加工步驟所必須的(Fisk等，EMBO J1999 18 2621-2630)等，因此，可以推測含有PPR基序的蛋白質(zhì)以某種方式參與翻譯調(diào)控的可能性很大。
這次，本發(fā)明者在分離參與Kosena蘿卜細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的基因時，發(fā)現(xiàn)由該基因編碼的蛋白質(zhì)具有14個以上的Pentatricopeptide Repeat(以下簡稱為PPR)基序，此外該PPR基序群分為3個以上的模序，每個模序分別具有至少2個以上的PPR基序，而且，羧基最末端(C末端)一側(cè)的模序有4個PPR基序。
作為上述參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的蛋白質(zhì)，優(yōu)選PPR基序數(shù)為14-16個的蛋白質(zhì)，更優(yōu)選PPR基序群分為3個模序，從氨基末端(N末端)一側(cè)起各模序依次有5個、7個及4個PPR基序。
具體是由以下(1)、(2)、(3)構(gòu)成的蛋白質(zhì)PPR簇#1自N末端起第1個PPR基序至第5個PPR基序連續(xù)175個殘基構(gòu)成的PPR簇；PPR簇#2自N末端起第6個PPR基序至第12個PPR基序連續(xù)245個殘基構(gòu)成的PPR簇；PPR簇#3自N末端起第13個PPR基序至第16個PPR基序連續(xù)140個殘基。
更優(yōu)選自氨基末端(N末端)一側(cè)起第2個PPR基序中存在的第4個氨基酸是絲氨酸、蘇氨酸或半胱氨酸以外的氨基酸；更優(yōu)選自氨基末端(N末端)一側(cè)起第2個PPR基序中存在的第4個氨基酸是天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或組氨酸中的任何一種；特別優(yōu)選自氨基末端(N末端)一側(cè)起第2個PPR基序中存在的第4個氨基酸是天冬酰胺。
已知通?？捎曰謴?fù)基因存在于核基因組中，細胞質(zhì)雄性不育基因存在線粒體中，因此優(yōu)選參與上述細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育性的蛋白質(zhì)，在其氨基末端進一步具有用于易位至線粒體的信號肽序列，或者在羧基末端進一步具有“LysAspGluLeu”構(gòu)成的序列。
作為用于易位至線粒體的N末端的信號肽，可以例舉通過以O(shè).Emanuelsson等(J.Mol.Biol.300，1005-1016(2000))的算法為基礎(chǔ)的預(yù)測程序“TargetP”(http//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)或預(yù)測程序“Psort”(http//psort.nibb.ac.jp/)確認的物質(zhì)，另外，作為該信號肽的具體例子，可以例舉擬南芥(Arabidopsis thaliana)AtOXA1基因的信號肽(W.Sakamoto等，Plant Cell Physiol，411157-1163)(MetAlaPheArgGlnThrLeuSerIleArgSerArgLeuPheAlaArgArgAsnGlnProValTyrHisIleIleProArgGluSerAspHisGluArgAsp)序列。其中優(yōu)選例舉序列號3所述氨基酸序列中1-79位的氨基酸序列，特別優(yōu)選例舉序列號3所述氨基酸序列中1-34位的氨基酸序列。
另外，本發(fā)明的參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的蛋白質(zhì)，通過與細胞質(zhì)雄性不育基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)合，對其細胞質(zhì)雄性不育基因的翻譯產(chǎn)生抑制作用，從而使細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育。
作為細胞質(zhì)雄性不育基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，可以例舉造成Kosena細胞質(zhì)雄性不育的原因蛋白質(zhì)ORF125，或造成Ogure細胞質(zhì)雄性不育的原因蛋白質(zhì)ORF138的各自基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(mRNA)，優(yōu)選例舉該基因的5-UTR(Bonhome等，Mol Gen Genet，235340-348，1992)區(qū)域。
作為確定是否與細胞質(zhì)雄性不育基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)合的方法，可以例舉在體外人工轉(zhuǎn)錄的orf125或orf138的mRNA中加入本發(fā)明的蛋白質(zhì)，然后進行電泳的方法，即所謂的凝膠移位法。作為具體的操作方法，例如凝膠移位法，可以在通常所用的條件下進行。
此外，還可以例舉使ORF125或ORF138的基因與β-半乳糖苷酶或熒光素酶等可檢測的報道基因的融合基因在大腸桿菌等中表達，再在表達產(chǎn)物中加入本發(fā)明的蛋白質(zhì)，確認表達是否得到抑制的方法。
具體而言，將序列號2的堿基序列所示的可育性恢復(fù)基因整合到大腸桿菌表達載體中，同時將orf125的5′-UTR區(qū)域和25個氨基酸的編碼部分與LacZ基因融合成載體，然后將該載體整合到大腸桿菌中，經(jīng)過誘導(dǎo)表達，只有與整合了可育性恢復(fù)基因的表達載體共存的場合，LacZ基因的表達才得到抑制，在X-Gal存在下，蘭色的大腸桿菌菌落變成白色。這樣利用編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的基因進行上述確認，也可以通過對細胞質(zhì)雄性不育基因的翻譯產(chǎn)生抑制作用，確認其具有使細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的功能。
作為本發(fā)明的參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的蛋白質(zhì)中最優(yōu)選的蛋白質(zhì)，可以例舉具有與共有序列，即序列號26-29所述的氨基酸序列具有70％以上，優(yōu)選80％以上，更優(yōu)選90％以上，進一步優(yōu)選92％以上，進一步優(yōu)選95％以上，特別優(yōu)選97％以上的同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。作為共有序列，可以例舉序列號26所述的氨基酸序列，優(yōu)選例舉序列號27或序列號28所述的氨基酸序列，特別優(yōu)選例舉序列號29所述的氨基酸序列。
此外，作為上述蛋白質(zhì)的優(yōu)選具體實例，可以例舉(1)具有序列號3所述氨基酸序列的第80-687位的氨基酸序列、序列號17所述氨基酸序列的第80-687位的氨基酸序列、或序列號19所述氨基酸序列的第82-690位的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或(2)具有序列號3所述氨基酸序列的第80-687位的氨基酸序列、序列號17所述氨基酸序列的第80-687位的氨基酸序列、或序列號19所述氨基酸序列的第82-690位的氨基酸序列中1個至多個氨基酸缺失、添加和/或置換的氨基酸序列，而且參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的蛋白質(zhì)。
此外，作為該序列中含有線粒體易位序列的蛋白質(zhì)，可以例舉(1)具有序列號3、序列號17、或序列號19所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或(2)具有序列號3、序列號17、或序列號19所述氨基酸序列中1個至多個氨基酸缺失、添加和/或置換的氨基酸序列，而且參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)是能夠參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的蛋白質(zhì)。更具體地說，使導(dǎo)入了編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA的性狀轉(zhuǎn)化植物(Rf系統(tǒng))與細胞質(zhì)雄性不育系統(tǒng)(cms系統(tǒng))的個體交配時，可以獲得恢復(fù)了可育性的F1種子。作為上述cms系統(tǒng)的個體，優(yōu)選例如導(dǎo)入了Kosena蘿卜和/或Ogura蘿卜的細胞質(zhì)雄性不育基因的個體。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以利用上述的凝膠移位法進行篩選、分離，也可以利用以下說明的本發(fā)明DNA進行分離或合成。本發(fā)明蛋白質(zhì)的獲得方法在后面敘述。
(2)本發(fā)明DNA的方式本發(fā)明的DNA涉及下述(i)至(iv)中任意一種DNA。
(i)編碼上述本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA。
(ii)具有序列號22-序列號25中任意一個所述的堿基序列的DNA。
(iii)下述任何一種DNA(1)具有序列號2、序列號16、或序列號18所述堿基序列的DNA；或(2)具有序列號2、序列號16、或序列號18所述堿基序列中1個至多個堿基缺失、添加和/或置換的堿基序列，而且參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的DNA；或(3)與具有序列號2、序列號16、或序列號18所述堿基序列的DNA在嚴(yán)格條件下雜交，而且參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的DNA。
(iv)下述任何一種DNA(1)具有序列號1所述堿基序列的第3754-8553位的堿基序列，或序列號15所述堿基序列的第812-3002位的堿基序列的DNA；或(2)具有序列號1所述堿基序列的第3754-8553位的堿基序列或序列號15所述堿基序列的第812-3002位的堿基序列中1個至多個堿基缺失、添加和/或置換的堿基序列，而且參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的DNA；或(3)與具有序列號1所述堿基序列的第3754-8553位的堿基序列或序列號15所述堿基序列的第812-3002位的堿基序列的DNA在嚴(yán)格條件下雜交，而且參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的DNA。
(v)下述任何一種DNA(1)具有序列號1或序列號15所述堿基序列的DNA；或(2)具有序列號1或序列號15所述堿基序列中1個至多個堿基缺失、添加和/或置換的堿基序列，而且參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的DNA；或(3)與具有序列號1或序列號15所述堿基序列的DNA在嚴(yán)格條件下雜交，而且參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的DNA。
在本說明書中，有時將本發(fā)明的DNA稱為本發(fā)明的基因。
序列號1所示的堿基序列是由8553個堿基構(gòu)成的基因組DNA堿基序列；序列號2所示的堿基序列是由序列號1得到的編碼序列。序列號3是序列號2所述堿基序列編碼的氨基酸序列。
序列號15所示的堿基序列是由3306個堿基構(gòu)成的基因組DNA堿基序列；序列號16所示的堿基序列是由序列號15得到的編碼序列。序列號17是序列號16所述的堿基序列編碼的氨基酸序列。
在本說明書中，“1個至多個堿基缺失、添加和/或置換的堿基序列”是指，例如1-20個，優(yōu)選1-15個，更優(yōu)選1-10個，進一步優(yōu)選1-5個的任意數(shù)目的堿基缺失、添加和/或置換的堿基序列。
在本說明書中，“1個至多個氨基酸缺失、添加和/或置換的氨基序列”是指，例如1-20個，優(yōu)選1-15個，更優(yōu)選1-10個，進一步優(yōu)選1-5個的任意數(shù)目的氨基酸缺失、添加和/或置換的氨基酸序列。
在本說明書中，“在嚴(yán)格條件下雜交的DNA”是指，使用DNA作為探針，用菌落雜交法、噬斑雜交法、或Southern印跡雜交法等得到的DNA的堿基序列，例如，通過使用固定了來源于菌落或噬斑的DNA或該DNA片段的濾器，在0.7-1.0M的NaCl存在下，65℃下進行雜交后，用0.1-2×SSC溶液(1×SSC的組成為150mM氯化鈉、15mM枸緣酸鈉)在65℃條件下洗滌濾器，能夠進行鑒定的DNA。
雜交可以按Molecular CloningA laboratory Mannual，2ndEd.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY.，1989.(以后簡稱為“分子克隆第2版”)等所述的方法進行。
作為在嚴(yán)格條件下雜交的DNA，可以例舉與作為探針使用的DNA的堿基序列具有一定程度以上的同源性的DNA。這里所說的一定程度以上的同源性，例如為70％以上，優(yōu)選80％以上，更優(yōu)選90％以上，進一步優(yōu)選93％以上，特別優(yōu)選95％以上，最優(yōu)選97％以上。另外，作為這里所說的具有一定程度以上的同源性的DNA，包括上述具有同源性的多核苷酸，及其互補鏈多核苷酸兩者。
本發(fā)明的DNA是能夠參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的DNA。更具體地說，通過使導(dǎo)入了本發(fā)明DNA的性狀轉(zhuǎn)化植物(Rf系統(tǒng))與細胞質(zhì)雄性不育系統(tǒng)(cms系統(tǒng))的個體交配，可以獲得恢復(fù)了可育性的F1種子。作為上述cms系統(tǒng)的個體，優(yōu)選例舉導(dǎo)入了Kosena蘿卜和/或Ogura蘿卜的細胞質(zhì)雄性不育基因的個體。
(3)本發(fā)明DNA的獲得方法對本發(fā)明DNA的獲得方法沒有特別的限定。根據(jù)本說明書中公開的序列號1或序列號2所述的堿基序列、以及序列號3所述的氨基酸序列或者以序列號3所述氨基酸序列的信息得到的PPR基序、或組合線粒體易位序列得到的氨基酸序列的信息，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的一般育種方法以及一般基因工程方法，可以分離或合成本發(fā)明的DNA。
具體而言，可以由能夠表達本發(fā)明基因的適當(dāng)植物來源獲得，具體是包括蘿卜品種或近緣種的Raphanus屬植物，或者通過交配或細胞融合技術(shù)，引入了這些植物的含有細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的基因組DNA的其他植物，更具體是Kosena蘿卜、Ogura蘿卜、園紅蘿卜或這些蘿卜品種或者近緣種等的Raphanus屬植物，或者通過交配或細胞融合技術(shù)，引入了這些植物的含有細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的基因組DNA的油菜屬植物。例如，分離位于Rf基因附近的DNA標(biāo)記，制作表明該DNA標(biāo)記和Rf基因的遺傳距離關(guān)系的基因組圖譜，然后以基因組圖譜作為出發(fā)點，利用Rf區(qū)域的定位克隆法(亦稱為染色體浸游)，可以分離并獲得本發(fā)明的基因。
這種技術(shù)首先是在基因組DNA上找出合適的DNA標(biāo)記，通過測定Rf基因和DNA標(biāo)記的遺傳距離，制作基因組圖譜。DNA標(biāo)記必須能識別來源于父本的基因組和來源于母本的基因組，一般長度為數(shù)百bp。此外，DNA標(biāo)記必須與基因位于同一染色體上，由于與基因的距離很近，其遺傳模式幾乎相同，也就是說要求是遺傳上強連鎖的標(biāo)記。
關(guān)于DNA標(biāo)記的分離方法，以前一直利用RFLP法，近年來則利用使用PCR的簡便方法，即RAPD法和AFLP(Amplified fragment lengthpolymophism)法(Nucleic Acid Research，1995，Vol.23，No.21，4407-4414)。特別是AFLP法是獲得遺傳上強連鎖的標(biāo)記的有效方法。作為測定與標(biāo)記的遺傳距離的材料，通?？梢圆捎靡韵碌娜后w使不攜帶Rf1基因的隱性純合個體與攜帶純合Rf1基因的顯性純合個體交配所得的F1世代通過自身授粉而得到的F2群體；使F1世代與其不帶目的基因的隱性純合個體的親本交配得到的BC1群體。
作為上述隱性純合個體，可以使用包括細胞質(zhì)雄性不育系統(tǒng)的蘿卜的品種、近緣種的Raphanus屬植物；更具體是細胞質(zhì)雄性不育系統(tǒng)的Kosena蘿卜和Ogura蘿卜、或引入了來源于Kosena蘿卜的細胞質(zhì)雄性不育(Kosena cms)和來源于Ogura蘿卜的細胞質(zhì)雄性不育(Oguracms)的油菜屬植物，更具體是cms油菜籽。
作為上述顯性純合個體，可以使用包括Rf系統(tǒng)的蘿卜的品種、近緣種的Raphanus屬植物，更具體是細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系統(tǒng)的Kosena蘿卜、Ogura蘿卜、園紅蘿卜、或通過交配或細胞融合技術(shù)引入了包括這些蘿卜品種和近緣種的Raphanus屬植物的含有細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的基因組DNA的油菜屬植物，更具體是Rf油菜籽。
對于這些使兩種親本交配所得的F1世代經(jīng)自身授粉而得到的F2群體、F1世代與隱性純合個體交配所得的BC1群體，通常要求對100個以上的個體，更優(yōu)選1000個以上的個體進行解析，個體數(shù)越多，基因組圖譜的精度越高，從DNA標(biāo)記至目的基因的物理距離變短。Rf基因的場合也同樣可能得到物理距離更短的DNA標(biāo)記。
作為測定DNA標(biāo)記與Rf基因的遺傳距離的材料，例如可以使用按照N.Koizuka等，Theor Appl Genet，100949-955，2000中所述的方法，使cms系統(tǒng)Kosena蘿卜(Raphanus sativus cv.Kosena)和Rf系統(tǒng)的園紅蘿卜(Raphanus sativus cv.Yuanhong)交配得到的蘿卜F1世代經(jīng)自身授粉所得到的數(shù)千個F2群體。根據(jù)對這些群體的解析，可以分離出以夾持Rf基因的形態(tài)，分別在兩側(cè)遺傳距離為0.2cM的位置連鎖的DNA標(biāo)記，由此可以制成圖1所示的表示標(biāo)記和Rf基因的遺傳距離的基因組圖譜。
基因組的圖譜制成后，有必要對與其位置對應(yīng)的基因組DNA進行克隆，使夾持目的基因的DNA標(biāo)記間連接起來。通常，DNA標(biāo)記與目的基因的物理距離較大，因此通過將多個含有基因組DNA片段的無性系連接起來，從而復(fù)蓋DNA標(biāo)記到目的基因區(qū)域。這種用含有基因組DNA片段的無性系將DNA標(biāo)記間連接起來的過程稱為重疊群的制備。Rf基因的場合同樣也可以通過使用多個含有基因組DNA片段的無性系將距離Rf基因更近的位置上存在的DNA標(biāo)記間連接，使之覆蓋Rf基因區(qū)域，制備重疊群。
含有基因組DNA片段的無性系的集合體可以通過制作基因組文庫來獲得。通常，根據(jù)能克隆的基因組DNA的長度，使用幾種載體，例如利用能克隆約20kb片段的λ噬菌體載體、能克隆比較長的片段(~40kb)的粘粒載體、能克隆更長的100kb以上片段的BAC(Bacterialartificial chromosome)載體等得到的文庫。
無論哪一種文庫，被克隆的片段的平均長度乘以文庫中群體數(shù)所得的數(shù)值應(yīng)為供于文庫的基因組的全長(基因組大小)的4-5倍，這一點很重要。認為蘿卜的基因組大小為約500Mbp，因此在使用λ噬菌體載體克隆平均長度20kb的場合，群體數(shù)為1.0×105個至1.25×105個；在粘粒文庫平均長度為40kb的場合，群體數(shù)為5.0×104至6.25×104個。認為油菜籽的基因組大小為約1000Mbp，因此在使用λ噬菌體載體克隆平均長度20kb的場合，群體數(shù)為2.0×105個至2.5×105個；在粘粒文庫平均長度為40kb的場合，群體數(shù)為1.0×105至1.25×105個。
供于文庫的基因組DNA可以采用常規(guī)方法從含目的基因的生物中提取基因組DNA。在Rf基因的場合，可以使用包括Rf系統(tǒng)的蘿卜品種、近緣種的Raphanus屬植物，更具體是通過交配或細胞融合技術(shù)引入了包括細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系統(tǒng)的Kosena蘿卜、Ogura蘿卜、園紅蘿卜或這些蘿卜品種和近緣種的Raphanus屬植物的含有細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的基因組DNA的油菜屬植物，更具體是Rf油菜籽。一般來說，認為最好從與制備F2群體和BC1群體時所用的親本植物相同的Rf系統(tǒng)的植物提取基因組DNA，制備基因組文庫?；蚪MDNA可以按照CTAB法(Murray，M.G.和Thompson，W.F.(1980)Nucleic AcidRes.，8，4321)等常規(guī)方法進行制備。
關(guān)于重疊群的制備，首先是分離含有位于Rf基因兩側(cè)的DNA標(biāo)記的無性系。由基因組文庫按照常規(guī)方法進行分離，在λ噬菌體文庫的場合，采用噬菌斑雜交法進行分離，在粘粒文庫和BAC文庫的場合，采用菌落雜交法進行分離。然后，用該分離的無性系的末端區(qū)域作為指標(biāo)，通過分離與該無性系鄰接的無性系，制備重疊群。制成后，通過常規(guī)方法確定重疊群的堿基序列。
近年來，由于基因組計劃的進展，根據(jù)基因組DNA的堿基序列推測功能性基因的技術(shù)也發(fā)展了起來。以“Genscan”為代表的基因發(fā)現(xiàn)程序能夠以相當(dāng)高的概率推定基因。此外，以“BLAST”為代表的同源性檢索程序能夠推定其他基因或蛋白質(zhì)的類似性。利用這些分析軟件進行目的基因的推定和分離。Rf基因的場合同樣也可以利用相同的分析軟件，對重疊群的基因組DNA序列進行分離、鑒定。另外，分析明確指出了基因組DNA堿基序列上的啟動子區(qū)域、含有內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)基因區(qū)域、終止子區(qū)域。同時，對于含有內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)基因，還指明了除去內(nèi)含子可翻譯為蛋白質(zhì)的形式的基因，以及相應(yīng)于該基因的氨基酸序列。用這樣的方式，能夠以相當(dāng)高的概率推測出重疊群上的Rf基因。
此外，為了以利用上述分析軟件推定的基因序列為基礎(chǔ)，確認實際上目的基因組在生物體內(nèi)以何種形式表達，可通過純化mRNA，分離與之互補的DNA(cDNA)來證明。另外，關(guān)于轉(zhuǎn)錄的起始點，作為一種簡便方法，可以采用被稱為5′-RACE法的利用PCR的方法、或更可靠的引物延伸法和SI圖譜法等進行分析來證明。
以上的方法在Molecular CloningAlaboratory Mannual，2ndEd.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY.，1989.等中有描述。
根據(jù)由上述技術(shù)推定的堿基序列而分離得到的本發(fā)明的基因，具體可以例舉序列號2、序列號16、或序列號18所示的DNA。這樣，以該DNA為基礎(chǔ)，通過一般的基因工程技術(shù)，也可能容易地從其他植物來源等分離出cDNA。
具體而言，通過由能夠表達本發(fā)明基因的適當(dāng)植物來源，具體是包括蘿卜品種或近緣種的Raphanus屬植物，或者通過交配或細胞融合技術(shù)，有這些植物引入了含有細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的基因組DNA的其他植物，更具體是Kosena蘿卜、Ogura蘿卜、園紅蘿卜或這些蘿卜品種或者近緣種等的Raphanus屬植物，或者通過交配或細胞融合技術(shù)，引入了這些植物的含有細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的基因組DNA的油菜屬植物，按照常規(guī)方法制作cDNA文庫，以本發(fā)明基因特有的適當(dāng)DNA片段作為探針，或者使用抗本發(fā)明基因的翻譯產(chǎn)物的抗體，由該文庫篩選所需的無性系，可以分離出相當(dāng)于本發(fā)明基因的cDNA。
作為上述的cDNA的來源，可以例舉表達本發(fā)明基因的各種細胞、組織和來源于這些細胞和組織的培養(yǎng)細胞。此外，由這些細胞、組織分離全長RNA、分離和純化mRNA、獲得cDNA及其克隆等都可以按照常規(guī)方法進行。
從cDNA文庫篩選本發(fā)明基因的方法也沒有特別的限制，可以按照常規(guī)方法進行。
作為這里所用的探針，一般可以使用以本發(fā)明基因的堿基序列的有關(guān)信息為基礎(chǔ)化學(xué)合成的DNA等，但是已經(jīng)獲得的本發(fā)明基因或其片段也可以很好地使用。此外，也可以使用根據(jù)本發(fā)明基因的堿基序列信息設(shè)定的有義引物、反義引物作為篩選用探針。
上述作為探針使用的有義引物和反義引物的核苷酸序列，可以例舉與編碼序列號3、序列號17或序列號19所示氨基酸序列的DNA相對應(yīng)的部分核苷酸序列中，至少具有15-50個連續(xù)的堿基，優(yōu)選20-30個連續(xù)的堿基的序列?；蛘咭部梢允褂煤猩鲜鲂蛄械年栃钥寺”旧碜鳛樘结?。
在獲得本發(fā)明基因的過程中，可以將利用PCR法的DNA/RNA擴增法、以5′-RACE法等為代表的RACE法等通常用于基因分離的技術(shù)組合起來進行。
采用上述PCR法時使用的引物，能夠以通過本發(fā)明明確的本發(fā)明基因的序列信息為基礎(chǔ)適當(dāng)?shù)卦O(shè)計，并可按常規(guī)方法合成。此外，擴增的DNA/RNA片段的分離純化可以按照上述常規(guī)方法，例如凝膠電泳法等進行。
此外，上述所得的本發(fā)明基因或各種DNA片段可以按照常規(guī)方法確定其堿基序列。
根據(jù)這樣所得的本發(fā)明基因，例如通過利用該基因的部分或全部堿基序列，能夠從特征上檢測本發(fā)明基因在個體或各種組織中是否存在和表達。
如上所述，作為本發(fā)明的基因，可以例舉編碼序列號3、序列號17、或序列號19所示氨基酸序列的DNA，但不限于這些，也包括該基因的同源物。
這里所說的基因的同源物是指與本發(fā)明基因(或其基因產(chǎn)物)有序列相同性，根據(jù)上述結(jié)構(gòu)特征以及上述其生物學(xué)功能的相似性，可認為是一個基因家族的一系列相關(guān)基因，當(dāng)然也包括該基因的等位基因。
例如，本發(fā)明的基因不限于具有序列號1或序列號2所示特定堿基序列的基因，也可以具有將對應(yīng)于序列號3所示各氨基酸殘基的任意密碼子組合而選擇的堿基序列。同樣，不限于具有序列號15或序列號16所示特定堿基序列的基因，也可以具有將對應(yīng)于序列號17所示各氨基酸殘基的任意密碼子組合而選擇的堿基序列；不限于具有序列號18所示特定堿基序列的基因，也可以具有將對應(yīng)于序列號19所示各氨基酸殘基的任意密碼子組合而選擇的堿基序列。密碼子的選擇可以按常規(guī)方法進行，例如可以從所用的宿主的密碼子使用頻率等來考慮。
此外，如上所述，本發(fā)明的基因也包括與具有序列號1、序列號2、序列號15、序列號16、序列號18或它們的一部分所示的堿基序列的DNA在嚴(yán)格條件下雜交的DNA。這樣的DNA是與具有序列號1、序列號2、序列號15、序列號16、序列號18或它們的一部分所示的堿基序列的DNA具有一定程度以上同源性的DNA。
上述有一定程度以上同源性的DNA是指與序列號1、序列號2、序列號15、序列號16、序列號18所示堿基序列或其一部分，或者與編碼序列號3、序列號17或序列號19所示氨基酸序列或其一部分的堿基序列至少有70％的同源性，優(yōu)選至少有90％的同源性，更優(yōu)選至少有95％的同源性，最優(yōu)選至少有97的同源性的多核苷酸及其互補多核苷酸。
更具體地說，可以例舉具有下述堿基序列的DNA，所述堿基序列為在含有0.1％SDS的0.2×SSC中50℃或者含有0.1％SDS的1×SSC中60℃的嚴(yán)格條件下，與具有序列號1、序列號2、序列號15、序列號16或序列號18所示的堿基序列或其部分堿基序列的DNA雜交的堿基序列。
此外，本發(fā)明的DNA中，特別是下述DNA，可以通過化學(xué)合成、基因工程技術(shù)、誘發(fā)突變等本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何一種方法制備。例如，利用具有序列號1、2、15、16或18所述的堿基序列或其部分堿基序列的DNA，通過將變異引入這些DNA，即可獲得變異基因具有序列號1或序列號15所述堿基序列或其一部分中1個至多個堿基缺失、添加和/或置換的堿基序列，并參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的DNA；具有序列號2、序列號16或序列號18所述堿基序列或其一部分中1個至多個堿基缺失、添加和/或置換的堿基序列，并參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的DNA；以及編碼具有序列號3、序列號17或序列號19所述氨基酸序列或其一部分中1個至多個氨基酸缺失、添加和/或置換的氨基酸序列，并參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的蛋白質(zhì)的DNA。
作為獲得變異基因的方法，可以采用公知的方法，例如使用隨機突變體、有靶突變體、合成基因的方法等(參照新基因工程學(xué)實驗指南，實驗醫(yī)學(xué)分冊，羊土社，1996)。
具體地說，對于具有序列號1或序列號2的堿基序列或其部分堿基序列的DNA，可以采用使之與作為變異原的藥劑接觸的方法、紫外照射的方法、基因工程技術(shù)等方法進行。基因工程技術(shù)之一的定點誘變法是能夠在特定位點引入特定變異的技術(shù)，因此是有用的技術(shù)，可以按照分子克隆第2版等所述的方法進行。
(4)含有本發(fā)明DNA的載體本發(fā)明的DNA可以整合到適當(dāng)?shù)妮d體中作為重組載體使用。載體的種類可以是表達載體，也可以是非表達載體，可以根據(jù)目的選擇。
作為克隆載體，優(yōu)選大腸桿菌K12菌株中能自主復(fù)制的載體，噬菌體載體、質(zhì)粒載體等都可使用，也可以將大腸桿菌的表達用載體用作克隆載體。具體可以例舉ZAP Express[Strata Gene公司生產(chǎn)，Strategies，5，58(1992)]、pBluescrlpt II SK(+)[Nuclelc AcidsResearch，17，9494(1989)]、Lambda ZAP II(Strata Gene公司生產(chǎn))、λgt10、λgt11[DNA Cloning，A Pract ical APPRoach，1，49(1985)]、λTripl Ex(Clonetec公司生產(chǎn))、λExCell(Pharmacia公司生產(chǎn))、pT7T318U(Pharmacia公司生產(chǎn))、pcD2〔Mol.Gen.Biol.，3，280(1983)〕、pMW218(和光純藥公司生產(chǎn))、pUC118(寶酒造公司生產(chǎn))、pEG400〔J.Bac.，172，2392(1990)]、pQE-30(QIAGEN公司生產(chǎn))等。
表達載體可以考慮與宿主的組合進行選擇，優(yōu)選采用可以在宿主細胞內(nèi)自主復(fù)制或可整合到染色體中，而且在能轉(zhuǎn)錄本發(fā)明基因的位置含有啟動子的表達載體。
用細菌作為宿主細胞時，優(yōu)選用于使DNA表達的表達載體在該細菌中可自主復(fù)制，同時由啟動子、核糖體結(jié)合序列、上述DNA和轉(zhuǎn)錄終止序列構(gòu)成的重組載體。也可以含有調(diào)控啟動子的基因。
作為細菌用的表達載體，可以例舉pBTrP2、pBTac1、pBTac2(都由Boheringer Manheimde公司市售)、pKK233-2(Pharmacia公司生產(chǎn))、pSE280(Invitrogen公司生產(chǎn))、pGEMEX-1(Promega公司生產(chǎn))、pQE-8(QIAGEN公司生產(chǎn))、pQE-30(QIAGEN公司生產(chǎn))、pKYP10(特開昭58-110600)、pKY200(Agrc.Biol.Chem.，48，669(1984))、PLSA1(Agrc.Blol.Chem.，53，277(1989))、pGEL1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，4306(1985))、pBluecrlptII SK+、pBluescriptII SK(-)(Stratagene公司生產(chǎn))、pTrS30(FERMBP-5407)、pTrS32(FERM BP-5408)、pGEX(Pharmacia公司生產(chǎn))、pET-3(Novagen公司生產(chǎn))、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pUC18(Gene，33，103(1985))、pUC19(Gene，33，103(1985))、pSTV28(寶酒造公司生產(chǎn))、pSTV29(寶酒造公司生產(chǎn))、pUC118(寶酒造公司生產(chǎn))、pPA1(特開昭63-233798)、pEG400[J.Bacteriol.，172，2392(1990)]、pQE-30(QIAGEN公司生產(chǎn))等。作為細菌用的啟動子，可例舉trp啟動子(Ptrp)、lac啟動子(Plac)、PL啟動子、PR啟動子、PSE啟動子等來源于大腸桿菌或噬菌體的啟動子、SP01啟動子、SP02啟動子、penP啟動子等。
作為酵母用的表達載體，可例舉YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、Ycp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等。作為酵母用的啟動子，可以例舉PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子、ga11啟動子、ga110啟動子、熱激蛋白質(zhì)啟動子、MFa1啟動子、CUP1啟動子等啟動子。
作為動物細胞用的表達載體，可以例舉pcDNAI、pcDM8(由Funakoshi公司市售)、pAGE107(特開平3-22979；Cytotechnology，3，133，(1990))、pAS3-3(特開平2-227075)、pCDM8〔Nature，329，840，(1987)〕、pcDNAI/AmP(Invitrogen公司生產(chǎn))、pREP4(Invitrogen公司生產(chǎn))、pAGE103〔J.Biochem.，101，1307(1978)]、pAGE210等。作為動物細胞用的啟動子，可舉出巨細胞病毒(人CMV)的IE(立即早期，immediate early)基因的啟動子、SV40的初期啟動子、逆轉(zhuǎn)錄病毒的啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱激蛋白啟動子、SRα啟動子等。
作為植物細胞用的表達載體，可以例舉pIG121-Hm[Plant CellReport，15，809-814(1995)]、pBI121[EMBO J.6，3901-3907(1987)]、pLAN411和pLAN421(Plant Cell Report，10(1991)286-290)。此外，特別是將10kb以上的長DNA片段導(dǎo)入植物時，要求使用能使長鏈DNA穩(wěn)定保持并導(dǎo)入的改良載體。例如，pBIBAC2(Gene200(1997)107-116)、pYLTAC7(PNAS96(1999)6535-6540)和pBIGRZ2(Bioscience and Industry 55(1997)37-39)。
作為植物細胞用的啟動子，可以例舉花椰菜花葉病毒35S啟動子[Mol.Gen.Genet(1990)220，389-392]等。此外，關(guān)于植物性狀轉(zhuǎn)化的詳細情況在后面另述。
(5)含有本發(fā)明DNA的性狀轉(zhuǎn)化體含有本發(fā)明DNA的性狀轉(zhuǎn)化體可通過將上述重組載體(優(yōu)選表達載體)導(dǎo)入宿主中而制成。
作為細菌的宿主細胞的具體例子，可以例舉屬于埃希氏屬(Escherichia)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、微桿菌屬(Microbacterium)、沙雷氏菌屬(Serratia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、脂環(huán)酸桿菌屬(Alicyclobacillus)、魚腥藍細菌屬(Anabaena)、組襄藍細菌屬(Anacystis)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、固氮菌屬(Azobacter)、著色菌屬(Chromatium)、歐文氏菌屬(Erwinia)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、席藍細菌屬(Phormidium)、紅細菌屬(Rhodobacter)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、紅螺菌屬(Rhodospirillum)、Scenedesmun菌屬、鏈霉菌屬(Streptomyces)、聚球藍細菌屬(Synnecoccus)、發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)等的微生物。作為將重組載體導(dǎo)入細菌宿主的方法，可以例舉利用鈣的方法和原生質(zhì)體法等。
作為酵母宿主的具體例子，可以例舉啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisae)、粟灑裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳克魯維氏酵母(Kluyveromyces lactis)、茁芽絲孢酵母(Trichoaporonpullulans)、河岸許旺氏酵母(Schwanniomyces alluvius)等。
作為將重組載體導(dǎo)入酵母宿主的方法，只要是將DNA導(dǎo)入酵母的方法，任何一種均可使用，例如電穿孔法、原生質(zhì)球法、醋酸鋰法等。
作為動物細胞宿主，可以例舉Namalva細胞、COS1細胞、COS7細胞、CHO細胞等。
作為將重組載體導(dǎo)入動物細胞的方法，可以使用能夠?qū)NA導(dǎo)入動物細胞的任何一種方法，例如電穿孔法、磷酸鈣法、脂轉(zhuǎn)染法等。
使用植物細胞的性狀轉(zhuǎn)化體將在后面敘述。
(6)本發(fā)明蛋白質(zhì)的獲得方法對本發(fā)明蛋白質(zhì)的獲得方法沒有特別限定。將本說明書公開的序列號3、序列號17或序列號19所述的氨基酸序列，或根據(jù)序列號3、序列號17或序列號19所述氨基酸序列的信息得到的PPR基序和線粒體易位序列組合起來，獲得氨基酸序列的信息，根據(jù)由此所得的信息，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以利用一般的基因工程技術(shù)，分離、表達或合成本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
例如，分離或合成編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA，通過將其導(dǎo)入細胞，可以使其表達。
本發(fā)明蛋白質(zhì)例如可以用下述方法獲得培養(yǎng)含有本發(fā)明基因的性狀轉(zhuǎn)化體，使本發(fā)明蛋白質(zhì)在培養(yǎng)物中產(chǎn)生和蓄積，然后由該培養(yǎng)物收集該蛋白質(zhì)。
含有本發(fā)明基因的性狀轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)方法可以按照培養(yǎng)宿主所用的常規(guī)方法進行。
本發(fā)明的性狀轉(zhuǎn)化體是大腸桿菌等原核生物、酵母菌等真核生物的場合，培養(yǎng)這些微生物的培養(yǎng)基可以是天然培養(yǎng)基，也可以是合成培養(yǎng)基，只要該培養(yǎng)基含有該微生物能夠利用的碳源、氮源、無機鹽類等，而且能有效地培養(yǎng)性狀轉(zhuǎn)化體即可。培養(yǎng)優(yōu)選在振蕩培養(yǎng)或深部通氣攪拌培養(yǎng)等需氧條件下進行，培養(yǎng)溫度通常為15-40℃，培養(yǎng)時間通常為16小時-7天。培養(yǎng)過程中的pH保持在3.0-9.0。pH的調(diào)整采用無機或有機酸、堿溶液、尿素、碳酸鈣、氨等進行。此外，在培養(yǎng)過程中根據(jù)需要也可以在培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素或四環(huán)素等抗生素。
培養(yǎng)以動物細胞為宿主細胞得到的性狀轉(zhuǎn)化體時，采用的培養(yǎng)基是通常使用的RPM11640培養(yǎng)基[The Journal of the AmericanMedical Association，199，519(1967)]、Eagle的MEM培養(yǎng)基[Science，122，501(1952)]、DMEM培養(yǎng)基[Virology，8，396(1959)]、199培養(yǎng)基[Proceeding of the Society for theBiological Medicine，73，1(1950)]或在這些培養(yǎng)基中添加胎牛血清等得到的培養(yǎng)基等。通常在pH6-8、30-40℃、5％CO2存在的條件下培養(yǎng)1-7天。此外，在培養(yǎng)過程中根據(jù)需要也可以在培養(yǎng)基中添加卡那霉素、青霉素等抗生素。
培養(yǎng)以植物細胞為宿主細胞得到的性狀轉(zhuǎn)化體時，培養(yǎng)基可以使用MS培養(yǎng)基、R2P培養(yǎng)基等通常根據(jù)其植物種類使用的培養(yǎng)基。通常在pH6-8、15-35℃等條件下培養(yǎng)1-21天。另外，在培養(yǎng)過程中根據(jù)需要也可以在培養(yǎng)基中添加卡那霉素、潮霉素等抗生素。
由性狀轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物分離、純化參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的本發(fā)明蛋白質(zhì)時，可以采用通常的蛋白質(zhì)分離、純化方法。
例如，本發(fā)明的蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)以溶解狀態(tài)表達時，培養(yǎng)結(jié)束后，通過離心分離回收細胞，懸浮于水性緩沖液中，用超聲波破碎機、法蘭西壓榨機、Manton Gaulin均化器、Dynomill碾磨機等將細胞破碎，得到無細胞提取液。由離心分離該無細胞提取液得到的上清液，采用通常的蛋白質(zhì)分離純化法，即單獨或組合使用溶劑提取法、利用硫銨等的鹽析法、脫鹽法、利用有機溶劑的沉淀法、使用二乙氨基乙基(DEAE)瓊脂糖或DIAION HPA-75(三菱化學(xué)公司生產(chǎn))等樹脂的陰離子交換層析法、使用S-Sepharose FF(Pharmacia公司生產(chǎn))等樹脂的陽離子交換層析法、使用丁基瓊脂糖或苯基瓊脂糖等樹脂的疏水層析法、使用分子篩的凝膠過濾法、親和層析法、層析聚焦法、等電點電泳等電泳法等技術(shù)，可以得到純化的標(biāo)準(zhǔn)品。
此外，該蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的形成不溶物進行表達時，同樣，將細胞回收后破碎，通過離心分離得到沉淀級分，按照常規(guī)方法由沉淀級分回收該蛋白質(zhì)后，用蛋白質(zhì)改性劑將該蛋白質(zhì)的不溶物溶解。將該溶解液稀釋或透析成不含蛋白質(zhì)改性劑的溶液，或蛋白質(zhì)改性劑的濃度達到不會使蛋白質(zhì)變性的程度的稀薄溶液，使該蛋白質(zhì)構(gòu)成正常的立體結(jié)構(gòu)后，采用與上述同樣的分離純化方法，可以得到純化的標(biāo)準(zhǔn)品。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其糖修飾體等衍生物分泌到細胞外時，可以從培養(yǎng)上清液中回收該蛋白質(zhì)或其糖鏈加成體等衍生物。亦即，采用與上述同樣的離心分離等方法處理該培養(yǎng)物，得到可溶性級分，采用與上述同樣的分離純化方法，可以由該可溶性級分得到純化的標(biāo)準(zhǔn)品。
此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可以通過Fmoc法(芴基甲氧基羰基法)或tBoc法(叔丁氧基羰基法)等化學(xué)合成法制造?；蛘?，也可以使用桑和貿(mào)易(美國Advanced Chem Tech公司生產(chǎn))、Perkin Elmer Japan(美國Perkin Elmer公司生產(chǎn))、Amersham Pharmacia Biotech(Amersham Pharmacia Biotech公司生產(chǎn))、Aroca(美國ProteinTeghnology Instrument公司生產(chǎn))、Kurabou(美國Synthecell-Vega公司生產(chǎn))、日本PerSeptive(美國PerSeptive公司生產(chǎn))、島津制作所等的肽合成儀進行合成。
(7)含有本發(fā)明DNA的植物轉(zhuǎn)化體序列號1和序列號15所述的堿基序列是由植物基因組原來的堿基序列分離出來的堿基序列形式。該堿基序列含有基因表達所必需的可操作形式的啟動子和終止子。導(dǎo)入的載體在直接導(dǎo)入法的場合，可以將該基因克隆到一般的克隆載體，例如粘粒pWE15(STRATAGENE公司生產(chǎn))等中。利用土壤桿菌時，可以克隆到一般的植物性狀轉(zhuǎn)化用載體，例如pBI121(Clonetec公司生產(chǎn))。
此外，也可以將由該序列(基因組序列)抽出一部分內(nèi)含子得到的堿基序列的DNA、幾乎抽出全部內(nèi)含子得到的堿基序列的DNA、序列號2或其第238-2064位堿基所示的DNA、序列號16或其第238-2064位堿基所示的DNA、序列號18或其第244-2073位堿基所示的DNA、或者編碼序列號3或相當(dāng)于其第80-687位殘基的區(qū)域、或序列號17或相當(dāng)于其80-687位殘基的區(qū)域、或序列號19或相當(dāng)于其第82-690位殘基的區(qū)域表示的蛋白質(zhì)的DNA，導(dǎo)入植物細胞內(nèi)。
這里，含有序列號1所述堿基序列的第3754-5091位的堿基序列、或序列號15所述堿基序列的第1-811位的堿基序列的DNA是，具有在花藥中轉(zhuǎn)錄mRNA能力的啟動子，優(yōu)選用于恢復(fù)雄性不育性。
此外，啟動子和終止子區(qū)域也可以用已知植物細胞中的功能啟動子和終止子取代。
另外，將上述序列號2或其第238-2064位堿基所示的DNA、序列號16或其第238-2064位堿基所示的DNA、序列號18或其第244-2073位堿基所示的DNA、或者編碼序列號3或相當(dāng)于其80-687位殘基的區(qū)域，序列號17或相當(dāng)于其第80-687位殘基的區(qū)域，或序列號19或相當(dāng)于其第82-690位殘基的區(qū)域所示的蛋白質(zhì)的DNA導(dǎo)入植物細胞時，除了該DNA之外，還必須有啟動子和終止子。作為常用的一般表達載體，可以例舉pBI121(Clonetec公司生產(chǎn))，該載體使用花椰菜花葉病毒的35S啟動子作為啟動子，使用存在于A.tumefacience的Ti質(zhì)粒中存在的胭脂氨酸合成酶的終止子作為終止子。此外，作為表達所必要的啟動子，并不限于上述的花椰菜花葉病毒的35S啟動子，也可使用植物中廣泛存在的rbcS啟動子等，更優(yōu)選花粉的發(fā)育期間表達的種類的啟動子，例如TA29啟動子，進一步優(yōu)選位于該基因上游的原來的啟動子。對于終止子也不限于上述胭脂氨酸合成酶的終止子，可以用花椰菜花葉病毒的35S終止子等，更優(yōu)選用位于該基因下游的原來的終止子。
此外，使用上述序列號2或其第238-2064位的堿基所示的DNA、序列號16或其第238-2064位的堿基所示的DNA、序列號18或其第244-2073位的堿基所示的DNA、或者編碼序列號3或相當(dāng)于其第80-687位殘基的區(qū)域、序列號17或相當(dāng)于其第80-687位殘基的區(qū)域、或序列號19或相當(dāng)于其第82-690位殘基的區(qū)域所示的蛋白質(zhì)的DNA，用于使細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的目的時，除了該序列以外，還必須要有線粒體易位序列。
作為該線粒體易位序列，可以利用上述序列號2的第1-237位的堿基所示的DNA或編碼序列號3的第1-79位的氨基酸序列的DNA、上述序列號16的第1-237位的堿基所示的DNA或編碼上述序列號17的第1-79位的氨基酸序列的DNA、或者上述序列18號的第1-243位的堿基所示的DNA或編碼上述序列號19的第1-81位的氨基酸序列的DNA、其他上述公知的易位序列等。
在以下的實施例中，本發(fā)明者制備了植物性狀轉(zhuǎn)化用載體，以便將含有內(nèi)含子的Rf基因的DNA，按本來的形式導(dǎo)入植物中，其中所說的內(nèi)含子包含序列號1所示的基因組中存在的本來的啟動子至終止子之間的內(nèi)含子。用限制性酶從構(gòu)成一部分重疊群的無性系切出序列號1所示的堿基序列后，亞克隆到適當(dāng)?shù)目寺≥d體中，然后將亞克隆的片段導(dǎo)入植物性狀轉(zhuǎn)化用載體pKM424、pBIGRZ2中，得到能夠?qū)⒃撈螌?dǎo)入植物中的載體。將此載體導(dǎo)入植物性狀轉(zhuǎn)化用土壤桿菌中。通過使植物感染攜帶該載體的土壤桿菌，該DNA片段即可整合到植物基因組中。
本發(fā)明基因適用的植物可以例舉油菜籽、向日葵、大豆、棕櫚椰子等油料作物；稻米、玉米、小麥等谷類作物；煙草、喇叭花等花卉類植物；西紅柿、花椰菜、卷心菜、白菜、胡蘿卜等蔬菜類。
其中，優(yōu)選油菜籽、卷心菜、白菜、花椰菜等芥屬植物和西紅柿等，特別優(yōu)選油菜籽、卷心菜、白菜、花椰菜；最優(yōu)選油菜籽。
本說明書中，作為性狀轉(zhuǎn)化植物源，可以例舉種子、胚芽、幼苗、愈傷組織、培養(yǎng)細胞、植物體等。例如，對于油菜籽，選用胚芽或原生質(zhì)體；對于大豆，選用胚芽、愈傷組織或培養(yǎng)細胞；對于向日葵，選用胚芽；對于棕櫚椰子，選用愈傷組織或培養(yǎng)細胞；對于稻米，選用胚芽、愈傷組織、培養(yǎng)細胞或原生質(zhì)體；對于玉米，選用胚芽、幼苗、愈傷組織、培養(yǎng)細胞或原生質(zhì)體；對于小麥，選用胚芽、愈傷組織或培養(yǎng)細胞；對于卷心菜、花椰菜，選用胚芽、愈傷組織、培養(yǎng)細胞或原生質(zhì)體；對于胡蘿卜，選用胚芽、愈傷組織、培養(yǎng)細胞或原生質(zhì)體等，如上所述可以按本領(lǐng)域的技術(shù)人員通常的做法，根據(jù)對象植物適當(dāng)?shù)剡x擇合適的部位。
植物的性狀轉(zhuǎn)化可以按照常規(guī)方法進行，例如將載體一度導(dǎo)入土壤桿菌后，用該土壤桿菌感染植物細胞，從而將載體導(dǎo)入植物的方法；或者電穿孔法、DEAE葡聚糖法、磷酸鈣法、聚乙二醇法、粒子槍法等將載體直接導(dǎo)入細胞的方法等。
例如，對于油菜籽來說，作為優(yōu)選的基因?qū)敕椒ǎ梢岳e下述記載的方法。
在含有蔗糖等糖類作為碳源的MS培養(yǎng)基上使油菜品種無菌發(fā)芽，然后將其下胚軸在含2，4-二氯苯氧乙酸和蔗糖的培養(yǎng)基上進行前培養(yǎng)。離心收集在YEB培養(yǎng)基上生長的土壤桿菌，再懸浮于含蔗糖的MS培養(yǎng)基中。將上述的油菜籽下胚軸加入該懸浮液中，振蕩后，將取出的下胚軸放回原來的前培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)3天，然后轉(zhuǎn)移至含有玉米素、苯甲氨基嘌呤等植物激素、羧芐青霉素和卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上進行篩選。通過將這樣得到的綠色再生芽，在任選含有苯甲氨基嘌呤等植物激素的生長培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后在任選含有萘乙酸、苯甲氨基嘌呤等植物激素的發(fā)根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，可以得到再生個體，將此個體與cms系統(tǒng)的個體交配，即可得到恢復(fù)了可育性的F1雜種。
通過這樣將本發(fā)明的DNA導(dǎo)入植物中，可以使細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育。
此外，上述再生個體通過與cms系統(tǒng)的油菜籽交配，檢查其后代的可育性，可以確認其表達。以具有cms細胞質(zhì)的油菜籽作為材料進行性狀轉(zhuǎn)化時，將上述形成了根的性狀轉(zhuǎn)化體(再生個體)移至含有普通肥料的土壤中使其開花，即可以檢查花粉的可育性，從時間、操作上考慮都較簡便，因此優(yōu)選。
另外，在上述性狀轉(zhuǎn)化中，作為使用的細胞，利用含有cms細胞質(zhì)的油菜籽的細胞或組織，優(yōu)選胚軸、子葉、葉、花粉、培養(yǎng)細胞、愈傷組織、原生質(zhì)體，如上所述進行性狀轉(zhuǎn)化時，將按上述方法得到的植物體(再生個體)移至含有普通肥料的土壤中使其開花，可以得到恢復(fù)了花粉可育性的植物個體。
亦即，使用cms細胞，按照上述基因?qū)敕▽⒈景l(fā)明的DNA導(dǎo)入該cms細胞中，以卡那霉素等抗生素耐性或除草劑耐性篩選標(biāo)記為指標(biāo)，篩選該DNA整合到核內(nèi)的細胞，然后在上述生長培養(yǎng)基及發(fā)根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可以得到該DNA整合到核內(nèi)的植物體。該植物體由雄性不育性狀恢復(fù)至可育。
作為檢測參與細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)的基因的方法，可以通過使用由權(quán)利要求1至4中任何一項所述的DNA任意設(shè)定的15-50mer的低聚核苷酸引物，或由權(quán)利要求1至4中任何一項所述的DNA的全部或部分構(gòu)成的至少15mer以上的探針，確認在目的生物樣品中通過該引物擴增的堿基序列的量、或通過探針檢測出的堿基序列的量在1個基因組中有1個以上基因。
作為具體的確定方法，例如有PCR法、Southern雜交法等，其中優(yōu)選PCR法。這些方法可按照Molecular CloningA laboratoryMannual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY.，1989.(以后簡稱為“分子克隆第2版”)中所述的方法進行。
要確認在1個基因組中存在1個以上基因，按照PCR法，作為一種簡便方法，以同樣拷貝數(shù)的DNA作為模板，必須要確認同樣程度的擴增，更精確的是采用定量PCR法，用使已知1個基因組存在1個基因的已知基因擴增的任意引物作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，在相同量的生物樣品中，比較該已知基因的擴增量與通過該引物擴增的堿基序列的量，即可進行確認。按照Southern雜交法，已知該DNA在1個基因組中存在1個基因的可育性恢復(fù)系統(tǒng)植物個體的DNA與目的植物樣品的DNA等量比較，確認檢測的DNA的量相同或更多。
PCR法中所用的引物可以例舉與序列號1或序列號2所述DNA序列相同或互補的15-50mer的低聚核苷酸。
Southern雜交法所用的探針可以例舉與序列號1或序列號2所述DNA序列相同的雙鏈DNA的全部或其至少15mer以上的一部分，或者單鏈DNA或其互補鏈的全部或其至少15mer以上的一部分。此外，還可舉出與上述作為探針使用的DNA的堿基序列有一定程度以上的同源性的DNA。這里所說的一定程度以上的同源性是指例如70％以上，優(yōu)選80％以上，更優(yōu)選90％以上，進一步優(yōu)選93％以上，特別優(yōu)選95％以上，最優(yōu)選97％以上的同源性。另外，作為這里所說的有一定程度以上同源性的DNA，包括有上述同源性的多核苷酸及其互補鏈多核苷酸。
以上所述的檢測基因的方法不僅能確認該DNA是否整合到性狀轉(zhuǎn)化體中，而且也能確認在通過交配試圖導(dǎo)入Rf基因的個體中是否存在Rf基因。使用這種方法，在將Rf基因?qū)爰毎|(zhì)雄性不育個體中時，可以在開花之前確認Rf基因是否存在。此外，在將Rf基因?qū)刖哂型ǔ＜毎|(zhì)的個體中時，必須對開花時的花粉與細胞質(zhì)雄性不育個體交配所得的下一代個體的能育性進行確認，但使用這種方法，能夠確認該在此之前Rf基因是否存在。這種使用方法，一般稱為標(biāo)記DNA的利用或標(biāo)記DNA育種。Rf基因的場合，考慮可以用作Rf基因的標(biāo)記DNA(Rf標(biāo)記)。如上所述，Rf標(biāo)記在利用導(dǎo)入該DNA的重組個體、或通過交配導(dǎo)入Rf基因的非重組體植物作為母本培育實用品種方面很重要。
此外，為了確認導(dǎo)入的DNA是否發(fā)揮Rf基因的功能，可以通過如上所述證實性狀轉(zhuǎn)化體的可育性恢復(fù)來確認，此外，也可以按照下述方法進行。
如上所述，Rf基因通過減少cms原因蛋白質(zhì)ORF125或ORF138蛋白質(zhì)在線粒體內(nèi)的蓄積量，使植物體的可育性恢復(fù)。因此，通過確認性狀轉(zhuǎn)化個體的線粒體中ORF125或ORF138蛋白質(zhì)的蓄積量減少，可以確認導(dǎo)入的基因為Rf基因。
作為證實線粒體中ORF125或ORF138蛋白質(zhì)的蓄積量減少的方法，如下所述按照本說明書所述的條件，采用Western印跡法檢測出ORF125或ORF138蛋白質(zhì)時，證實用作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的來源于線粒體基因組的蛋白質(zhì)的抗體，例如在N.Koizuka等，Theor Appl Genet，100949-955，2000中所述的抗F1-F0ATPase(以下省略為ATPA)的信號量，在細胞質(zhì)雄性不育個體，以及可育性恢復(fù)個體或細胞質(zhì)雄性不育個體中導(dǎo)入了該DNA的性狀轉(zhuǎn)化體中是等量的，而且，與細胞質(zhì)雄性不育個體的ORF125或ORF138蛋白質(zhì)的蓄積量相比，可育性恢復(fù)個體或細胞質(zhì)雄性不育個體中導(dǎo)入了該DNA的性狀轉(zhuǎn)化體中的蓄積量減少了50％以上，優(yōu)選60％以上，更優(yōu)選減少80％以上。
實際上，對于含有ORF125的細胞質(zhì)雄性不育蘿卜的花蕾，一旦導(dǎo)入可育性回恢基因Rf，ORF125蛋白質(zhì)的蓄積量即大幅度減少，幾乎檢測不出。另外，對于油菜籽，在含有細胞質(zhì)ORF125的細胞質(zhì)雄性不育油菜籽中通過交配導(dǎo)入可育性恢復(fù)基因得到的可育性恢復(fù)油菜籽的花蕾中，可觀察到ORF125蛋白質(zhì)的蓄積量減少了80％以上。此外，在實施例中，在細胞質(zhì)雄性不育個體中導(dǎo)入該DNA得到的性狀轉(zhuǎn)化油菜籽的花蕾中，也可觀察到ORF125蛋白質(zhì)的蓄積量減少了80％以上。
另外，上述方法中ORF125和ORF138蛋白質(zhì)的抗體可以用下述的一般方法獲得。亦即，可以將這些蛋白質(zhì)作為抗原給動物免疫而得到抗血清，再用結(jié)合了蛋白A的親和層析柱，純化免疫球蛋白G抗體。所用的抗原可由正在表達的細胞質(zhì)雄性不育植物或其培養(yǎng)細胞，通過常規(guī)方法將蛋白純化而獲得。此外，也可以通過將ORF125和ORF138基因與表達載體連接，使其在大腸桿菌或酵母中表達，然后同樣進行純化而獲得。另外，也可以使用化學(xué)合成ORF125或ORF138的全長或一部分得到的肽作為抗原。ATPA的抗體也可以用同樣的方法獲得。
此外，在含有cms細胞質(zhì)且具有本發(fā)明DNA的細胞中，進一步導(dǎo)入誘導(dǎo)型啟動子與本發(fā)明基因的一部分或全部，通過對本發(fā)明DNA的表達進行特異且暫時的調(diào)控，可以制成不需要生產(chǎn)雜交種子所必須的雄性不育性維持系統(tǒng)(維持系統(tǒng))的新型雜交種子生產(chǎn)系統(tǒng)。
亦即，通常由于cms系統(tǒng)的油菜籽是不育的，為了使cms系統(tǒng)增殖和維持，必須另外有cms和Rf不參與的維持系統(tǒng)，以前為了生產(chǎn)雜交種子，必須要有Rf系統(tǒng)、cms系統(tǒng)、維持系統(tǒng)這3種系統(tǒng)的植物，但是由于本發(fā)明已分離、鑒定出Rf基因，因此在生產(chǎn)雜種時，采用由化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)啟動子從而調(diào)控恢復(fù)基因的表達的方法，可以構(gòu)建即使沒有維持系統(tǒng)也能增殖、維持的cms系統(tǒng)。
具體而言，將本發(fā)明基因的一部分或全長按反義或有義方向整合到含有外部誘導(dǎo)的啟動子，例如藥物敏感性的啟動子的載體中，然后用該載體，性狀轉(zhuǎn)化含有cms細胞質(zhì)且含有本發(fā)明DNA的細胞。
作為含有cms細胞質(zhì)且含有本發(fā)明DNA的細胞，不僅可以是按上述方法，用本發(fā)明DNA性狀轉(zhuǎn)化含有cms細胞質(zhì)的細胞得到的細胞，也可以是將cms系統(tǒng)與Rf系統(tǒng)等交配得到的細胞。
作為上述可以誘導(dǎo)的啟動子，例如可以通過特開平6-46697號公報得知；作為載體的制備以及性狀轉(zhuǎn)化方法，可以例舉與上述同樣的方法。
進一步將誘導(dǎo)型啟動子與本發(fā)明DNA的一部分或全長一起整合到由上述方法所得的含有cms細胞質(zhì)且含有本發(fā)明DNA的細胞中形成性狀轉(zhuǎn)化體，該性狀轉(zhuǎn)化體通常不能誘導(dǎo)啟動子，因此由于原來存在的Rf基因，植物表現(xiàn)出可育性，該系統(tǒng)的維持也可以通過自身授粉進行，但在生產(chǎn)雜種時，通過使具有誘導(dǎo)啟動子能力的化學(xué)物質(zhì)作用于該植物，誘導(dǎo)啟動子，可以抑制Rf基因的表達。這樣，該植物就變成雄性不育，因此可以在生產(chǎn)雜種時作為cms系統(tǒng)使用。
因此，通過采用該方法，即使是cms系統(tǒng)，也能通過自身授粉進行增殖、維持，因而雖然以前生產(chǎn)雜種時必須有3種系統(tǒng)，但是現(xiàn)在能夠不需要維持系統(tǒng)，從而能夠使生產(chǎn)成本大幅度降低。
此外，主張本申請優(yōu)先權(quán)的基礎(chǔ)，即特愿2001-128008號、特愿2001-202082號、以及特愿2002-20083號的各說明書中公開的內(nèi)容在此全文引用，作為本說明書中公開的內(nèi)容。
以下，對實施例作更詳細的說明，但本發(fā)明不受這些實施例的任何限定。
實施例實施例1與細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因連鎖的DNA標(biāo)記的分離以及基因組圖譜的制作為了分離可育性恢復(fù)基因(Rf基因)，首先，必須分離位于Rf基因附近的DNA標(biāo)記，制作表明該DNA和Rf基因的遺傳距離關(guān)系的基因組圖譜。作為其出發(fā)點，進行了Rf區(qū)域的定位克隆。
在DNA標(biāo)記分離方法中，按照AFLP(Ampified fragment lengthpolymorphism)法(Nucleic Acids Research，1995，Vol.23，No.214407-4414)，用GIBCO BRL公司的AFLP Analysis System I AFLPStarter Primer Kit進行AFLP。作為測定與標(biāo)記的遺傳距離的材料，采用約2100個體的F2群體，該F2群體是通過使cms系統(tǒng)Kosena蘿卜(Raphanus sativus cv.Kosena)的1個個體((KC2/KA1)-1)和Rf系統(tǒng)的圓紅蘿卜(Raphanus sativus cv.Yuanhong)的1個個體(Yuan10-3)，按照N.Koizuka等，Theor ApplGenet，100949-955 2000中所述的方法進行交配得到的蘿卜F1世代的8個個體，經(jīng)自身授粉后所得。結(jié)果，分離出以夾持Rf基因的形態(tài)，在離兩側(cè)遺傳距離分別為0.2～0.3cm的位置連鎖的5個標(biāo)記。表示各DNA標(biāo)記和Rf基因的遺傳距離的基因組圖譜如圖1所示。
實施例2以基因組圖譜為基礎(chǔ)的重疊群制作和Rf基因的解析基因組圖譜制成后，必須將該位置對應(yīng)的基因組DNA克隆化，將夾持Rf基因的DNA標(biāo)記連起來。其中，由于DNA標(biāo)記和Rf基因的距離是隔開的，通過將多個含有基因組DNA片段的無性系連接起來，制成復(fù)蓋DNA標(biāo)記間的Rf基因區(qū)域的重疊群。
含有基因組DNA片段的無性系的集合體稱為基因組文庫，我們制作了2種文庫。作為DNA供給體，由制作F2群體時利用的與恢復(fù)系統(tǒng)的親本同樣的園紅蘿卜，按常規(guī)方法，用CTAB法(Mur ray，M.G和Thompson，W.F.(1980)Nucleic Acids Res.，8，4321)制備基因組DNA。用λDASHII載體(STRATAGENE公司生產(chǎn))作為λ載體，制備平均長度為20kb，群體數(shù)1.5×105個的λ噬菌體文庫。此外，采用作為粘粒載體的pWEBTNC載體(EPICENTRE TECHNOLOGIES公司生產(chǎn))，制備平均長度為40kb，群體數(shù)5.5×104個的粘粒文庫。
制備重疊群時，首先以位于Rf基因兩側(cè)的DNA標(biāo)記為指標(biāo)，從上述制備的λ噬菌體文庫，采用噬斑雜交法，分離λ無性系。另外，從粘粒文庫，用菌落雜交法分離出粘粒無性系，完成圖1所示的復(fù)蓋兩端DNA標(biāo)記間的重疊群。按照常規(guī)方法，測定構(gòu)成部分重疊群的粘粒無性系NIT7/2和T03-2的堿基序列。
隨后，用“Genscan”(三菱Space/Software公司生產(chǎn))，將對擬南芥的參數(shù)考慮在內(nèi)，對上述構(gòu)成部分重疊群的粘粒無性系NIT7/2和TO3-2的堿基序列進行解析，擬南芥與蘿卜的基因組DNA序列很相似，最近其全部基因組序列的測定已完成。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)認為表達Rf基因的啟動子區(qū)、含有內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)基因區(qū)域、以及終止子區(qū)域。此外，還得到了除去了內(nèi)含子的翻譯為蛋白質(zhì)的形式的基因以及與該基因相應(yīng)的氨基酸序列。
實施例3基因組DNA區(qū)域的亞克隆通過使用片段回收用瓊脂糖(FMC公司生產(chǎn))的凝膠電泳，將序列號1所述的由第1-8553位堿基序列構(gòu)成的DNA的HpaI-SwaI片段(8546bp)與載體分離，該片段充分含有用“Gensca”推定的啟動子至終止子區(qū)域。用凝膠分解酶(Epicentre Technologies公司生產(chǎn))將含DNA片段的凝膠消化，回收DNA。再將所得的片段用限制酶BamHI切斷后得到克隆片段。將這些DNA片段亞克隆到pGEM-T easy載體(Promega公司生產(chǎn))中，得到cds6BT/pGEM-T easy。以下作詳細說明。
在100μl的1×K限制酶緩沖液(200mM Tris-HCl(pH8.5)，10mMMgCl2，1mM二硫蘇糖醇，100mM KCl)中，加入1μg的NIT7/2粘粒DNA和10unit的限制酶HpaI(寶酒造公司生產(chǎn))，37℃下加溫1小時。
加溫后，加入10μl的3M醋酸鈉(pH5.6)和250μl的乙醇，攪拌后，在-80℃下冷卻5分鐘，15000rpm、4℃下離心15分鐘。除去上清，再緩慢加入1ml的70％乙醇，15000rpm、4℃下離心5分鐘。除去上清液，用離心真空干燥機，將沉淀干燥5分鐘。在回收的DNA沉淀中加入89μl無菌水使其溶解。
在溶解的DNA溶液中，加入10μl的10×H限制酶緩沖液(500mMTris-HCl(pH7.5)，100mM MgCl2，10mM二硫蘇糖醇，1000mM NaCl)、1μl的10unit/μl限制性酶SwaI(寶酒造公司生產(chǎn))，25℃下加溫1小時。然后加入11μl的10×加樣(loading)緩沖液(1％SDS，50％甘油，0.05％溴酚蘭)。
將1.2g的低融點瓊脂糖SeaPlaqueGTG瓊脂糖(FMC公司生產(chǎn))和150ml的1×TAE(40mM Tris-醋酸鹽，1mM EDTA)緩沖液混和后，100℃下加熱使瓊脂糖溶解，邊攪拌邊冷卻至45℃。在14×15cm的膠盤中，放置30mm寬×1mm厚的梳，然后將冷卻的凝膠倒入盤中使其凝固。將加入了加樣染料(loading Dye)的DNA倒入凝膠梳中，并在1×TAE、30V/30cm的電壓下電泳18小時。
將電泳后的凝膠移入0.5μg/ml溴乙錠/1×TAE溶液中，染色30分鐘。然后將凝膠放在用365nm的長波紫外線照射的透射儀上，用無菌刀切出所需的8546bp的片段。再將凝膠切成邊長約1mm的小塊，然后轉(zhuǎn)移至預(yù)先稱量的2ml微量管中，稱量凝膠的重量。
對50mg重量的凝膠加入1μl的50×GELase緩沖液(2M Bis-Tris(pH6.0)，2M NaCl)。將加入了凝膠的管放在加溫至68℃的干熱裝置中，不時將管子翻轉(zhuǎn)進行攪拌，加溫10分鐘，使凝膠完全溶解。再將該管移至45℃的干熱裝置中，不時將管子翻轉(zhuǎn)進行攪拌，溫育5分鐘。在該管中按每200mg的凝膠重量加入1unit的GELase(EpicertreTechnologies公司生產(chǎn))，在45℃的干熱裝置中，將管子不時地翻轉(zhuǎn)進行攪拌，溫育30分鐘。
根據(jù)凝膠的容量，加入1/3容量的10M醋酸銨(pH7.0)并攪拌，15000rpm下離心5分鐘。將上清移至新的2ml微量管中，加入2倍上清容量的乙醇。將管攪拌后，在15000rpm、4℃下離心20分鐘。除去上清，再緩慢加入1ml的70％乙醇，在15000rpm、4℃下離心5分鐘。除去上清，用離心真空干燥機，將沉淀干燥5分鐘。在沉淀中加入20μl的TE緩沖液(10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA)，使其完全溶解，回收DNA片段。
回收的20μl DNA溶液中，加入10μl的10×K限制酶緩沖液(200mM Tris-HCl(pH8.5)，100mM MgCl2，10mM二硫蘇糖醇，1000mMKCl)、68μl的dH2O、2μl的100unit/μl的限制酶BamHI(寶酒造公司生產(chǎn))，30℃下溫育1小時。溫育后，加入10μl的3M醋酸鈉(pH5.6)和250μl的乙醇攪拌后，-80℃下冷卻5分鐘，15000rpm、4℃下離心5分鐘。將上清除去，再緩慢加入1ml的70％乙醇，15000rpm、4℃下離心5分鐘。除去上清液，用離心真空干燥機，使沉淀干燥5分鐘。在回收的DNA沉淀中，加入滅菌水20μl使其溶解。加入55μl的滅菌水、10μl的10×PCR緩沖液(100mM Tris-HCl(pH8.3)，500mM KCl)、6μl的25mM MgCl2、8μl的2.5mM dNTP混合物、1ml的5unit/μl的rTaq DNA聚合酶(寶酒造公司生產(chǎn))并混合后，72℃下溫育30分鐘，在3’末端付加dATP。
將上述反應(yīng)液移至超濾裝置Microcon-50(Millipore公司生產(chǎn))中，5000rpm、4℃下離心20分鐘。棄去收集器中的水，再加入100μl的滅菌水，5000rpm、4℃下離心20分鐘。加入20μl的TE緩沖液(10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA)，取出過濾裝置，反向安裝于新的微量管中。3000rpm、4℃下離心5分鐘，回收過濾裝置上的DNA。
在按照上述方法得到的5μl純化DNA中，混合1μl的50ng/μlpGEM-T easy載體(Promega公司生產(chǎn))、6μl的DNA Ligation KitVer.2(寶酒造公司生產(chǎn))的I溶液后，16℃下溫育30分鐘。
將上述反應(yīng)液與100μl滅菌水一起移至超濾裝置Microcon-50(Millipore公司生產(chǎn))中，5000rpm、4℃下離心20分鐘。棄去收集器中的水，再加入100μl的滅菌水，5000rpm、4℃下離心20分鐘。卸下超濾裝置，反向安裝在新的微量管上。
3000rpm、4℃下離心5分鐘，回收超濾裝置上的DNA。
回收的DNA連管一起置于冰上冷卻。將30μl電穿孔用大腸桿菌DH10B(Gibco BRL公司生產(chǎn))放入管內(nèi)，輕輕混合。將和DNA混和后的大腸桿菌移至預(yù)先在冰上冷卻的電穿孔用(電極間隔1mm)小杯(USAScientific Plastics公司生產(chǎn))中。用Electro Cell Manipulator600(BTX公司生產(chǎn))，在1.25kv、129Ω、50μF的條件下進行電穿孔。然后將預(yù)熱到37℃的500μl SOC培養(yǎng)基(Gibco BRL公司生產(chǎn))立即加入小杯中。將大腸桿菌移至10ml的培養(yǎng)管中，37℃下振蕩培養(yǎng)1小時。將培養(yǎng)的大腸桿菌涂布在添加了100μg/ml的氨芐青霉素(和光純藥公司生產(chǎn))、200μg/ml的X-Gal(寶酒造公司生產(chǎn))、1mM的IPTG(寶酒造公司生產(chǎn))的LB瓊脂培養(yǎng)基(1％Bacto-Trypton，0.5％Bacto-Yeast Extract，1％NaCl，1.5％Bacto-Agar)中，37℃下培養(yǎng)18小時以上。
將在瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)的白色菌落，用添加了100μg/ml氨芐青霉素的2ml LB培養(yǎng)基，在37℃下培養(yǎng)18小時以上。由培養(yǎng)的大腸桿菌，按常規(guī)方法提取質(zhì)粒DNA。用限制酶EcoRI(寶酒造公司生產(chǎn))切斷，確認目的片段克隆到質(zhì)粒DNA中，從而得到cds6BT/pGEM-Teasy。
將按照上述方法得到的攜帶cds6BT/pGEM-T easy的每個大腸桿菌DH10B，用加入了100μg/ml氨芐青霉素的100ml LB培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)18小時以上。采用Qiagen Midikit(QIAGEN公司生產(chǎn))，按照堿性SDS法進行純化。
實施例4-1植物性狀轉(zhuǎn)化用載體的制備(1)將cds6BT/pGEM-Teasy用限制酶EcoRI切斷后，通過使用片段回收用瓊脂糖的凝膠電泳與載體分離，將回收的DNA片段克隆到植物性狀轉(zhuǎn)化用載體pKM424(在pKM424中加入CaMV35S啟動子GUS基因NOS終止子的片段得到的載體為pLAN421(Plant Cell Reports 10(1991)286-2900)載體)的EcoRI位點，制成植物性狀轉(zhuǎn)化用載體cds6BT/pKM424。詳細敘述如下。
在100μl的1×H限制酶緩沖液(50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mMMgCl2，1mM二硫蘇糖醇，100mM NaCl)中，加入1μg的cds6BT/pGEM-Teasy DNA和10unit的限制酶EcoRI(寶酒造公司生產(chǎn))，37℃下溫育1小時。
以下，按照與上述分離HpaI-SwaI片段同樣的方法，從cds6BT/pGEM-T easy中分離回收含有cds6BT的EcoRI片段。
在100μl的1×H限制酶緩沖液(50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mMMgCl2，1mM二硫蘇糖醇，100mM NaCl)中，加入1μg的植物性狀轉(zhuǎn)化用載體pKM424和10unit的限制酶EcoRI(寶酒造公司生產(chǎn))，37℃下溫育1小時。溫育后，加入100μl的1M Tris-HCl(pH8.0)和1 unit的細菌堿性磷酸酶(寶酒造公司生產(chǎn))并混和后，50℃下溫育1小時進行脫磷酸化。
加入用200μl的TE緩沖液(10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA)飽和的苯酚·氯仿，激烈攪拌。15000rpm離心5分鐘后，將上清移至新的管內(nèi)。重復(fù)一次同樣的操作，除去蛋白質(zhì)。加入20μl的3M醋酸鈉(pH5.6)和500μl的乙醇并攪拌后，在-80℃下冷卻5分鐘，15000rpm、4℃下離心15分鐘。除去上清，再緩慢加入1ml的70％乙醇，15000rpm、4℃下離心5分鐘。除去上清，用離心真空干燥機使沉淀干燥5分鐘。在沉淀中加入100tl的TE緩沖液(10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA)，使沉淀完全溶解，濃度達到10ng/μl。
將10μl的純化EcoRI片段、1μl的脫磷酸化pKM424載體、11μl的DAN Ligation Kit Ver.2(寶酒造公司生產(chǎn))I溶液混和后，16℃下溫育30分鐘。
將上述反應(yīng)液與100μl滅菌水一起移至超濾裝置Micorcon-50(Milipore公司生產(chǎn))中，5000rpm、4℃下離心20分鐘，棄去收集器的水，再加入100μl的滅菌水，5000rpm、4℃下離心20分鐘。卸下超濾裝置，反向安裝在新的微量管上。
3000rpm、4℃下離心5分鐘，回收超濾裝置中的DNA。
將回收的DNA連管一起置于冰上冷卻。將30μl的電穿孔用大腸桿菌DH10B(Gibco BRL公司生產(chǎn))放入管內(nèi)，輕輕混合。然后將與DNA混和后的大腸桿菌移至預(yù)先在冰上冷卻的電穿孔用(電極間隔1mm)小杯(USA Scientific Plastics公司生產(chǎn))中。用Electro CellManipulator 600(BTX公司生產(chǎn))，在1.25kv、129Ω、50μF的條件下進行電穿孔，然后立即將預(yù)熱至37℃的500μl SOC培養(yǎng)基(GibcoBRL公司生產(chǎn))加入小杯中。將大腸桿菌移至10ml的培養(yǎng)管中，37℃下振蕩培養(yǎng)1小時。將培養(yǎng)的大腸桿菌涂布在添加了50μg/ml的壯觀霉素(Sigma公司生產(chǎn))的LB培養(yǎng)基(1％Bacto-Tryptone，0.5％Bacto-Yeast Extract，1％NaCl，1.5％Bacto-Agar)上，37℃下培養(yǎng)18小時以上。
將瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)的菌落，用添加了50μg/ml壯觀霉素的2mlLB培養(yǎng)基，在37℃下培養(yǎng)18小時以上。由培養(yǎng)的大腸桿菌，按常規(guī)方法提取質(zhì)粒DNA。用限制酶HindIII(寶酒造公司生產(chǎn))切斷，證實BamHI位點至HpaI位點的區(qū)域被克隆到質(zhì)粒DNA中，得到cds6BT/pKM424。
將攜帶cds6BT/pKM424的大腸桿菌DH10B，用添加了50μg/ml壯觀霉素的250ml LB培養(yǎng)基，在37℃下培養(yǎng)18小時。用Qiagen MidiKit(Qiaqen公司)，按照堿性SDS法進行純化。
實施例4-2植物性狀轉(zhuǎn)化用載體的制備(2)將充分?jǐn)y帶序列號1所述堿基序列的λ無性系CHI(參照圖2，克隆片段長約17kb)，用多克隆位點上存在的限制酶NotI(寶酒造公司生產(chǎn))切斷后，用片段回收用瓊脂糖，通過凝膠電泳與載體分離，將回收的DNA片段克隆到植物性狀轉(zhuǎn)化用載體pBIGRZ2(Bioscience andIndustry 55(1997)37-39)的NotI位點，制成植物性狀轉(zhuǎn)化用載體CHI/pBIGRZ2。詳細敘述如下。
在100μl的1×H限制酶緩沖液(50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mMMgCl2，1mM二硫蘇糖醇，100mM NaCl，0.01％BSA，0.01％TritonX-100)中，加入1μg的λ無性系CHI DNA和10unit的限制酶NotI(寶酒造公司生產(chǎn))，37℃下溫育1小時。以下，按照與上述分離HpaI-SwaI片段同樣的方法，分離回收λ無性系CHI的NotI片段。
在100μl的1×H限制酶緩沖液(50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mMMgCl2，1mM二硫蘇糖醇，100mM NaCl，0.01％BSA，0.01％TritonX-100)中，加入1μg的植物性狀轉(zhuǎn)化用的載體pBIGRZ2和10unit的限制酶NotI(寶酒造公司生產(chǎn))，37℃下溫育1小時。溫育后，加入100μl的Tris-HCl(pH8.0)和1unit的細菌堿性磷酸酶(寶酒造公司生產(chǎn))并混和后，50℃下溫育1小時，進行脫磷酸化。
加入200μl用TE緩沖液(10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA)飽和的苯酚-氯仿，激烈攪拌。15000rpm下離心5分鐘后，將上清移至新的管內(nèi)。重復(fù)一次同樣的操作，除去蛋白質(zhì)。加入20μl的3M醋酸鈉(pH5.6)和500μl的乙醇并攪拌后，在-80℃下冷卻5分鐘，15000rpm、4℃下離心15分鐘。除去上清，再緩慢加入1ml的70％乙醇，15000rpm、4℃下離心5分鐘。除去上清，用離心真空干燥機將沉淀干燥5分鐘。在沉淀中加入100μl的TE緩沖液(10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA)使其完全溶解，濃度為10ng/μl。
將10μl的純化NotI片段、1μl的脫磷酸化pBI GRZ2載體、11μ1的DNA Ligation Kit Ver.2(寶酒造公司生產(chǎn))I溶液混和后，16℃下溫育30分鐘。
將上述反應(yīng)液與100μl滅菌水一起移至超濾裝置Microcon-50(Milipore公司生產(chǎn))中，5000rpm、4℃下離心20分鐘。棄去收集器中的水，再加入100μl的滅菌水，5000rpm、4℃下離心20分鐘。卸下超濾裝置，反向地安裝在新的微量管上。
3000rpm、4℃下離心5分鐘，回收超濾裝置上的DNA。
將回收的DNA連同管子一起置于冰上浴卻。管內(nèi)加入30μl的電穿孔用大腸桿菌DH10B(Gibco BRL公司生產(chǎn))，輕輕混合。然后將與DNA混合后的大腸桿菌移至預(yù)先在冰上冷卻的電穿孔用(電極間隔1mm)小杯(USA Scientific Plastics公司生產(chǎn))中，用Electro CellManipulator 600(BTX公司生產(chǎn))在1.25kv、129Ω、50μF的條件下進行電穿孔，然后立即將預(yù)熱至37℃的500μl SOC培養(yǎng)基(GibcoBRL公司生產(chǎn))加入小杯中。將大腸桿菌移至10ml的培養(yǎng)管中，37℃下振蕩培養(yǎng)1小時。將大腸桿菌涂于添加了25μg/ml的卡那酶素(和光純藥公司生產(chǎn))的LB瓊脂培養(yǎng)基(1％Bacto-Tryptone，0.5％Bacto-Yeast Extract，1％NaCl，1.5％Bacto-Agar)上，37℃下培養(yǎng)18小時以上。
將瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)的菌落，用添加了25μg/ml卡那霉素的2mlLB瓊脂培養(yǎng)基，在37℃下培養(yǎng)18小時以上。從培養(yǎng)的大腸桿菌用常規(guī)方法提取質(zhì)粒DNA。用限制酶HindIII(寶酒造公司生產(chǎn))切斷，確認在質(zhì)粒DNA中克隆了目的片段，得到CHI/pBIGRZ2。
將攜帶CHI/pBIGRZ2的大腸桿菌DH10B在添加了25μg/ml卡那霉素的250ml LB培養(yǎng)基中37℃下培養(yǎng)18小時。用Qiagen Midi Kit(Qiagen公司生產(chǎn))按照堿性SDS法進行純化。
實施例5植物性狀轉(zhuǎn)化用載體導(dǎo)入土壤桿菌制備土壤桿菌的感受態(tài)細胞，分別將實施例4-1和4-2所得的cds6BT/pKM424載體及CHT/pBIGRZ載體導(dǎo)入所制備的植物性狀轉(zhuǎn)化用土壤桿菌EHA101中。詳細說明如下。
用以下方法制備土壤桿菌EHA101的電穿孔用感受態(tài)細胞。將土壤桿菌EHA101在添加了50μg/ml卡那霉素(和光純藥公司生產(chǎn))、25μg/ml氯霉素(和光純藥公司生產(chǎn))的LB瓊脂培養(yǎng)基上劃線，28℃下培養(yǎng)24小時以上，得到單菌落。在50ml離心管中加入20ml添加了50μg/ml卡那霉素、25μg/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基，接種直徑約1mm的菌落，28℃下振蕩培養(yǎng)40小時。40小時后，將離心管的蓋子開閉一次，再同樣地培養(yǎng)4小時。將培養(yǎng)液在1500×g、4℃下離心，收集菌體。棄去上清，在內(nèi)加入40ml冰冷的滅菌10％甘油，使菌體再懸浮，1500×g、4℃下離心，收集菌體。重復(fù)上述操作2次。在所得菌體中，加入500μl冰冷的滅菌10％甘油，使菌體再懸浮。在每個滅菌的微量管中分別注入100μl的菌體，用液氮凍結(jié)后，置于-80℃下冷凍保存。
將土壤桿菌EHA101的電穿孔用感受態(tài)細胞放在冰水上溶化。在預(yù)先冷卻的1.5ml管內(nèi)加入40μl的電穿孔感受態(tài)細胞，分別加入100ng的cds6BT/pKM424或CHT/pBIGRZ的質(zhì)粒DNA，輕輕混合。
將與DNA混和后的土壤桿菌移至預(yù)先在冰上冷卻的電穿孔用(電極間隔1mm)小杯(USA Scientific Plastics公司生產(chǎn))中，用ElectroCell Manipulator 600(BTX公司生產(chǎn))，在1.44kv、129Ω、50μF的條件下進行電穿孔，然后立即將預(yù)熱至30℃的500μl SOC培養(yǎng)基(GibcoBRL公司生產(chǎn))加入小杯中。將土壤桿菌移至10ml的培養(yǎng)管中，30℃下振蕩培養(yǎng)1小時。
對于導(dǎo)入了cds6BT/pKM424載體的土壤桿菌，在添加了50μg/ml卡那霉素(和光純藥公司生產(chǎn))、25μg/ml氯霉素(和光純藥公司生產(chǎn))、50μg/ml壯觀霉素(Sigma公司生產(chǎn))、2.5μg/ml四環(huán)素(Sigma公司生產(chǎn))的LB瓊脂培養(yǎng)基(1％Bacto-Tryptone，0.55％Bacto-YeastExtract，1％NaCl，1.5％Bacto-Agar)上涂布培養(yǎng)后的土壤桿菌，28℃下培養(yǎng)24小時以上。
對于導(dǎo)入CHI/pBIGRZ2載體的土壤桿菌，在添加了50μg/ml卡那霉素(和光純藥公司生產(chǎn))、25μg/ml氯霉素(和光純藥公司生產(chǎn))、30μg/ml潮霉素(Sigma公司生產(chǎn))的LB瓊脂培養(yǎng)基上涂布培養(yǎng)后的土壤桿菌，28℃下培養(yǎng)24小時以上。
將瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)的菌落，在添加了適合于每種載體的上述抗生素的2ml LB培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)24小時以上。從培養(yǎng)的土壤桿菌用常規(guī)方法提取質(zhì)粒DNA。用限制酶HindIII(寶酒造公司生產(chǎn))切斷，確認cds 6BT/pKM424載體或CHT/pBIGRZ2載體已導(dǎo)入土壤桿菌中。對于確認的無性系，在培養(yǎng)24小時后的培養(yǎng)液中加入等量的滅菌80％甘油，混和后在-80℃下保存，用于油菜籽的性狀轉(zhuǎn)化。
實施例6油菜籽性狀轉(zhuǎn)化體的制備油菜籽的性狀轉(zhuǎn)化如下所述進行。用10％的次氯酸溶液對含有來源于蘿卜的cms原因基因orf125的CMS油菜籽(SW18)的種子進行滅菌處理，用不含激素的MS培養(yǎng)基(T.Murashige and F.Skoog Physiol.Plant.15485，1962)使其發(fā)芽。從發(fā)芽后7天-14天的幼嫩植物僅切出胚軸部分，再切成3-5mm長，用MS培養(yǎng)基(Sigma公司M5519)+蔗糖3％+2.4-D1mg/l、瓊脂糖(Sigma公司，typeI)0.4％，在23℃下前培養(yǎng)12-16小時。這時，為了進行保育培養(yǎng)，與來源于煙草的細胞系統(tǒng)BY-2進行共存培養(yǎng)。
另一方面，將含有CHI/pBIGRZ2的土壤桿菌在28℃下培養(yǎng)8-48小時，使其生長至OD600＝1.0左右。土壤桿菌的菌體懸浮于無激素的液體MS培養(yǎng)基中。使切碎的胚軸與該土壤桿菌溶液混合，約共存培養(yǎng)20分鐘。共培養(yǎng)后，用濾紙將土壤桿菌除去，得到的胚軸在MS基本培養(yǎng)基+維生素B5(Sigma公司，M0404)+蔗糖3％+2，4-D1mg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，使其感染。感染后，將胚軸移植至在MS基本培養(yǎng)基+維生素B5+3％蔗糖+1mg/L 2，4-D的培養(yǎng)基中以500mg/L的濃度添加了抗生素羧芐青霉素(Pfeizer公司，zeopen或GIBCO-BRL公司羧芐青霉素二鈉鹽)的除菌培養(yǎng)基中，除去土壤桿菌。
用上述除菌培養(yǎng)基培養(yǎng)5天至1周后，將胚軸用除MS基本培養(yǎng)基+維生素B5+1％蔗糖+3mg/L苯甲氨基嘌呤+500mg/L的羧芐青霉素以外，還添加了5mg/L硝酸銀、用于篩選的5-30mg/L卡那霉素(Nakalaitesk公司，卡那霉素硫酸鹽)的培養(yǎng)基培養(yǎng)14天-21天。這時，有時會出現(xiàn)綠色的愈傷組織，應(yīng)立即接種轉(zhuǎn)移至下一步的培養(yǎng)基中。
作為下一步的培養(yǎng)基，例如是含有MS培養(yǎng)基(Sigma公司，M5519)+1％蔗糖+3mg/L苯甲氨基嘌呤+1mg/L的玉米素+500mg/L的羧芐青霉素+5-30mg/L卡那霉素的篩選培養(yǎng)基。將由切口形成了愈傷組織的胚軸移植至上述培養(yǎng)基上，23℃下培養(yǎng)3周，此后至綠色的愈傷組織出現(xiàn)為止，每3周反復(fù)進行3-5次移植。
發(fā)現(xiàn)綠色的愈傷組織后立即從胚軸切下，移至同樣組成的培養(yǎng)基中。以后，只將綠色部分切下并進行培育，形成非正常芽的幾率為1-30％。非正常芽隨后移至B5基本培養(yǎng)基(Sigma公司，G5893)+3％蔗糖+1mg/L苯甲氨基嘌呤上培育后，在含有MS培養(yǎng)基(Sigma公司，M5519)+3％蔗糖+0.1mg/L萘乙酸+0.01mg/L苯甲氨基嘌呤的培養(yǎng)基上使其發(fā)根。
實施例7性狀轉(zhuǎn)化體的分析(檢測導(dǎo)入DNA)從實施例6所得形成了花蕾的性狀轉(zhuǎn)化體的1個個體取1片葉子，用Qiagen公司的DNA分離試劑盒(DNeasy plant mini)分離DNA。
用PCR法對導(dǎo)入DNA片段的3個部位(a，b，c部位)進行檢測(結(jié)果如圖3所示)。部位a是序列號1的堿基序列中3186bp至3753bp的568bp，正向引物使用“5’-GAAGCAAAAAAGAAAACGAGCAGAG-3’”(序列號4)、反向引物使用“5’-CCAAAAATCCGAAATCCGAATAGAC-3’”(序列號5)。部位b是序列號1的堿基序列中4869bp至5112bp的244bp，正向引物使用“5’-CTCGGCTCTGGGTTTAGTGA-3’”(序列號6)、反向引物使用“5’-TCCACAAACCCTAGCCAACA-3’”(序列號7)。部位c是序列號1的堿基序列中7766bp至8250bp的485bp，正向引物使用“5’-GCTTATGCTTCTCTGGTTCGCCTC-3’”(序列號8)、反向引物使用“5’-CTCAGTTTTCGTCACCTTACACAATGC-3’”(序列號9)。
在1μl的性狀轉(zhuǎn)化體DNA溶液(50ng/μl)中，加入12.1μl的滅菌水、2μl的10×PCR緩沖液(100Mm Tris-HCl(pH8.3)，500mMKCl)、1.2μl的25mM MgCl2、1.6μl的2.5mM dNTP混合物、1μl各部位的10μM正向引物溶液、1μl各部位的10μM反向引物溶液、0.1μl的5unit/μl的rTaq DNA聚合酶(寶酒造公司生產(chǎn))，混和后，進行重復(fù)94℃40秒、55℃30秒、72℃1分鐘的循環(huán)35次，擴增DNA。熱循環(huán)儀使用UNOII(Biometra公司生產(chǎn))。反應(yīng)結(jié)束后，通過4％Nusive3:1 Agarose(FMC公司生產(chǎn))/1×TBE(89mM Tris-硼酸鹽，89mM硼酸，2mM EDTA)緩沖液的凝膠電泳，確認擴增產(chǎn)物(參照圖3)。
由結(jié)果可知，部位a未導(dǎo)入該性狀轉(zhuǎn)化油菜籽中。其余2個部位(b，c部位)得到與陽性對照同樣大小的擴增產(chǎn)物，確認該DNA巳整合到性狀轉(zhuǎn)化油菜籽中。
實施例8性狀轉(zhuǎn)化體的分析(確認cms原因蛋白質(zhì)ORF125蓄積量的減少)取與實施例7同樣個體的1個花蕾，用Western印跡法分析CMS蛋白質(zhì)ORF125蓄積量的減少。結(jié)果如圖4所示。
(1)由性狀轉(zhuǎn)化個體提取蛋白質(zhì)關(guān)于蛋白質(zhì)的提取法、Western印跡法，按照N.Koizuka等(TheorAppl Genet(2000)100949-955)的方法進行。
具體而言，將所得性狀轉(zhuǎn)化油菜籽的花蕾(長1mm)1個與100μ1冰冷的蛋白質(zhì)提取緩沖液(50mM Tris-HCl(pH7.5)、2％(W/V)SDS)放入冰冷的乳缽中，用杵研磨。將此溶液移至微量離心管中，15000rpm、4℃下離心15分鐘。離心后，將上清液移至新的微量離心管中，100℃下加熱5分鐘。再次在15000rpm、4℃下離心15分鐘，將上清液移至新的微量離心管中，制得SDS可溶性蛋白質(zhì)溶液。用利用Bradford法的蛋白質(zhì)定量試劑盒(Bio-rad公司生產(chǎn))測定SDS可溶性蛋白質(zhì)溶液的濃度。與此平行，由細胞質(zhì)雄性不育系統(tǒng)的油菜籽和可育性恢復(fù)系統(tǒng)的油菜籽的花蕾，也同樣地提取SDS可溶性蛋白質(zhì)溶液，測定其濃度。
(2)用SDS-PAGE法分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至PVDF膜Western印跡用7×10cm矩形的10％的SDS聚丙烯酰胺凝膠，每1泳道加載15μg的SDS可溶性蛋白質(zhì)，通過電泳進行分離。此外，為了比較ORF125蛋白質(zhì)的蓄積量，也同樣加載細胞質(zhì)雄性不育系統(tǒng)的油菜籽的稀釋系列，進行分離。電泳的條件為10mA下1小時、15mA下1小時。電泳后用半干印跡裝置(日本泳動公司生產(chǎn))，將聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)在100mA、1小時的條件下轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Milipore公司生產(chǎn))上。
(3)用抗體檢測蛋白質(zhì)Western印跡將轉(zhuǎn)移了蛋白質(zhì)的PVDF膜分成上、下2張，轉(zhuǎn)移至10ml印跡溶液(20mM Tris-HCl(pH7.5)、500mM NaCl、0.05％Tween20、5％脫脂牛奶)中，振蕩1小時進行印跡。上面的PVDF膜，檢測作為線粒體蛋白質(zhì)量的對照的ATPA，下面的PVDF膜，檢測細胞質(zhì)雄性不育相關(guān)蛋白質(zhì)ORF125。將PVDF膜移至10ml的第一抗體反應(yīng)液(在10ml封閉溶液中加入用于檢測ATPA的100μl ATPA單克隆抗體，加入用于檢測ORF125的2μl抗ORF125的兔抗血清(M.Iwabuchi等，PlantMolecular Biology(1999)39183-188))中，振動18小時。將PVDF膜移入100ml的TTBS(20mM Tris-HCl(pH7.5)、500mM NaCl、0.05％ Tween20)中，振動10分鐘。重復(fù)該操作3次，將過剩的第一抗體洗去。將PVDF膜移至10ml的第二抗體反應(yīng)液(在10ml的封閉溶液中，加入用于檢測ATPA的10μl過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(Amersham公司生產(chǎn))、用于檢測ORF125的10μl堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(Bio-red公司生產(chǎn))(M.Iwabuchi等，Plant MolecularBiology(1999)39183-188))中，分別振蕩1小時。將PVDF膜移至100ml的TTBS(20mM Tris-HCl(pH7.5)、500mM NaCl、0.05％Tween20)中，振蕩10分鐘。該操作重復(fù)3次，洗去過剩的第二抗體。對于ATPA的檢測，采用針對過氧化物酶的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)“ECL+”(Amersham公司生產(chǎn))，曝光5秒鐘，進行檢測。對于ORF125的檢測，采用堿性磷酸酶的發(fā)色基質(zhì)BCIP/NBT(MOSS Inc.公司生產(chǎn))，發(fā)色5分鐘，進行檢測。
結(jié)果表明，2種系統(tǒng)的細胞質(zhì)雄性不育油菜籽的花蕾、可育性恢復(fù)油菜籽、細胞質(zhì)雄性不育系統(tǒng)中插入該DNA得到的性狀轉(zhuǎn)化體油菜籽的花蕾中，對照ATPA的蓄積量幾乎無變化，但性狀轉(zhuǎn)化體油菜籽的ORF125蛋白質(zhì)蓄積量明顯減少。該減少的程度與在細胞質(zhì)雄性不育系統(tǒng)中通過交配導(dǎo)入可育性恢復(fù)基因得到的可育性恢復(fù)系統(tǒng)同等(圖4及M.Iwabuchi等，Plant Molecular Biology(1999)39183-188))。此外，ORF125蛋白質(zhì)蓄積量的減少程度與稀釋系列相比，可育性恢復(fù)油菜籽為1/8-1/16；性狀轉(zhuǎn)化油菜籽為約1/8。如以上所述，油菜籽的可育性恢復(fù)和ORF125蛋白質(zhì)蓄積量的減少密切相關(guān)，具有同義的關(guān)系，因此，可以證明該DNA序列具有減少線粒體內(nèi)ORF125蛋白質(zhì)蓄積量的功能，是攜帶可育性恢復(fù)基因的基因組DNA序列。
進一步從開花體取出花粉在顯微鏡下觀察，證實形成了正常的花粉(圖5)。
實施例9cDNA的分離從制作基因圖譜時所用的F2群體中，選擇含有純合Rf1基因的花粉可育性F2個體作為RNA供體，由花蕾純化mRNA后，合成cDNA，然后用5’-RACE或3’-RACE法進行cDNA的分離。
(mRNA的純化)由含有純合Rf1基因的花粉可育性F2個體的花蕾，用常規(guī)的異硫氰酸胍法，采用RNeasy試劑盒(Qiagen公司生產(chǎn))提取全長RNA。由全長RNA采用利用寡脫氧胸苷酸(Origo(dT))纖維素柱的“mRNA純化試劑盒”(Amersham Pharmacia公司)純化PolyA+RNA，得到mRNA。
(用5’-RACE和3’-RACE法分離cDNA)用1μg純化的mRNA，采用“Marathon RACE system 5’RACE 3’RACE”試劑盒，按照5’-RACE和3’-RACE法分離cDNA。作為基因特異性引物，在5’-RACE中，使用5’-GATTCCTTTCTCTTGCATTTCAG-3’(序列號10)；在3’-RACE中，使用5’-ATCTCGTCCTTTACCTTCTGTGG-3’(序列號11)。確認所得無性系的堿基序列后，得到cDNA序列(序列號2)。
實施例10cDNA向氨基酸序列的轉(zhuǎn)換及其分析(1)cDNA向氨基酸序列的轉(zhuǎn)換采用通常的遺傳密碼子，并使用基因分析軟件“Genetyx-SV”(軟件開發(fā)有限公司)進行，得到序列號3所示的氨基酸序列。PPR基序的分析用Protein families database ofalignment and HMNs(以下略稱為Pfam，http//www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/search.shtml)中的程序進行。分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)序列號1所示的可育性恢復(fù)基因的翻譯產(chǎn)物是含有16個PPR基序的蛋白質(zhì)。另外，PPR基序有3個PPR簇。該3個蔟為①PPR簇#1由N末端起第1個PPR基序至第5個基序的連續(xù)175個氨基酸殘基組成的PPR簇；②PPR簇#2由N末端起第6個PPR基序至第12個基序的連續(xù)245個氨基酸殘基組成的PPR簇；以及③PPR簇#3由N末端起第13個PPR基序至第16個基序的連續(xù)140個氨基酸殘基組成的PPR簇。
實施例11本發(fā)明蛋白質(zhì)的解析進行試驗確認，通過造成Kosena細胞質(zhì)雄性不育的原因蛋白質(zhì)ORF125的基因與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(mRNA)結(jié)合是否對大腸桿菌中的翻譯起抑制作用。
將序列號2所示的可育性恢復(fù)基因?qū)氪竽c桿菌表達載體pQE-80L(Qiagen公司)的BamHI-SphI部位，構(gòu)建成N末端添加6個組氨酸殘基(6×His)的表達載體(pQEB1/cds6)。另外，用pSTV29(寶酒造)載體作為模板，采用導(dǎo)入BamHI位點的引物CGGGATCCGCTCACAATT(序列號12)、M13引物(寶酒造公司)進行DNA擴增。DNA的擴增采用Takara LA PCR試劑盒(寶酒造公司)。將擴增的DNA用限制酶BamHI、EcoRI(寶酒造公司)切斷后，用Suprec-02(寶酒造公司)純化。為了合成在orf125基因的5’-UTR區(qū)域和orf125的25個氨基酸的兩端含有BamHI和EcoRI位點的DNA片段，用2根引物，按照藤本的方法(植物的PCR實驗方案合成DNA的實際PP84-87(秀潤公司))進行PCR。引物采用下述兩種引物
125-5’BamHIGCGGATCCCAATTTCATTCTGCATCACTCTCCCTGTCGTTATCGACCTCGCAAGGTTTTTGAAACGGCCGAAACGGGAAGTGACAATACCGCTTTTCTTC(序列號13)125-5’EcoRIGGAATTCACTAACTTTACATTCAGTAGGAGTGAGATTATGACAAAAAGTGGACAATTTTTCGAAAAAGGTAATCATGCATTTATATGCTGAAGAAAAGCG(序列號14)擴增的DNA用限制酶BamHI、EcoRI(寶酒造公司)切斷后，用Suprec-02(寶酒造公司)純化。純化的DNA用TaKaRa Ligation試劑盒(寶酒造公司)連接，性狀轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B(Gibco BRL公司生產(chǎn))。在添加了50μg/ml的氯霉素(Sigma公司)的LB瓊脂培養(yǎng)基(1％Bacto-Tryptone，0.5％Bacto-Yeast Extract，1％NaCl，1.5％Bacto-Agar，0.1mM IPTG，20μg/ml X-Gal)上，37℃下培養(yǎng)18小時以上。用常規(guī)方法從淺蘭色的菌落提取質(zhì)粒，確定其堿基序列。這樣，構(gòu)建在EcoRI位點至1acZ基因的轉(zhuǎn)錄起始點之間導(dǎo)入了含有orf125基因的5’-UTR區(qū)域和orf125的25個氨基酸的174bp(圖6所述堿基序列中第7-180位)的載體(pSTV125-5’#LA6)。此外，同時還獲得了含有在相應(yīng)于該174bp的部分產(chǎn)生數(shù)個突變點的片段(圖6所述堿基序列中的第7-183位)的載體(pSTV125-5’#LA12)。
將該載體pSTV125-5’#LA6及pSTV125-5’#LA12分別導(dǎo)入大腸桿菌10B(Gibco BRL公司)中，用在LB培養(yǎng)基中添加500μg/ml氯霉素(和光純藥公司)、200μMIPTG(和光純藥公司)，40μg/ml X-Gal(寶酒造公司)得到的瓊脂培養(yǎng)基，在37℃下培養(yǎng)過夜，使菌落生長，呈現(xiàn)淺蘭色。亦即，確認導(dǎo)入了任何一種載體的大腸桿菌中都能表達LacZ基因。
此外，為了將上述pSTV125-5’載體和pQEB1/cds6載體一起導(dǎo)入與上述同樣的大腸桿菌中，采用在上述培養(yǎng)基中加入50μg/ml氨芐青霉素得到的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)時，在與pSTV125-5’#LA6共存的場合，產(chǎn)生白色的菌落；與導(dǎo)入片段部位有變異的pSTV125-5’#LA12共存的場合，產(chǎn)生淺蘭色的菌落，蘭色的深淺與#LA12單獨的場合沒有變化。此外，對于導(dǎo)入的這些載體是否從大腸桿菌脫落，可以將每個菌落培養(yǎng)后，用常規(guī)方法提取載體進行確認。
根據(jù)以上結(jié)果可以認為，通過pQEB1/cds6載體在大腸桿菌內(nèi)表達的蛋白質(zhì)與pSTV125-5’#LA6的mRNA結(jié)合的結(jié)果，抑制了LacZ基因的表達，形成了白色菌落。此外，與pSTV125-5’#LA12共存的場合，由于導(dǎo)入片段部位有變異，來源于pQEB1/cds6的蛋白質(zhì)不能與mRNA結(jié)合，結(jié)果LacZ基因表達，形成蘭色菌落。
由此可以推測，具有序列號3所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)與orf125的mRNA，更具體是至少與orf125-5’UTR區(qū)域和ORF125的25個氨基酸的編碼區(qū)域的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有關(guān)，抑制ORF125蛋白質(zhì)的表達。
亦即，可以推測本發(fā)明基因的翻譯產(chǎn)物在轉(zhuǎn)運至線粒體后，在該線粒體內(nèi)與雄性不育基因結(jié)合，抑制其翻譯，減少造成細胞質(zhì)雄性不育的蛋白質(zhì)的蓄積量，從而使細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)至可育。
實施例12Kosena油菜籽可育性恢復(fù)基因的分離由通過細胞融合導(dǎo)入Kosena蘿卜的可育性恢復(fù)基因得到的油菜籽系統(tǒng)(以下稱為Kosena油菜籽)，用PCR法得到可育性恢復(fù)基因的基因組序列。用Qiage公司的DNA分離試劑盒(DNeasy plant mini)，從0.1g Kosena油菜籽的葉提取DNA。為了進行DNA擴增，將序列號1的堿基序列中1027bp至1059bp的序列5’-ACATAAAAATCACTAGATACTTGACATGGAGGC-3’(序列號30)設(shè)定為正向引物，序列號1的堿基序列中7675bp至7651bp的序列5’-AAGAGGAGGAAGATGGCATCACAGC-3’(序列號31)設(shè)定為反向引物。
在10μl的Kosena油菜籽DNA溶液(50ng/μl)中，加入49μl的滅菌水、10μl的10×LA PCR緩沖液(寶酒造公司生產(chǎn))、10μl的25mM MgCl2、16μl的2.5mM dNTP混合物、2μl的10μM正向引物溶液、2μl的10μM反向引物溶液、1μl的5unit/μl的TaKaRa LATAq(寶酒造公司生產(chǎn))并混和后，反復(fù)進行98℃20秒、68℃15分的循環(huán)30次，擴增DNA。熱循環(huán)儀使用UNOII(Biometra公司生產(chǎn))。反應(yīng)結(jié)束后，用超濾過濾器Microcon-PCR(Milipore公司生產(chǎn))純化約6kb的擴增產(chǎn)物。用純化的擴增產(chǎn)物作為模板，用常規(guī)方法確定相當(dāng)于序列號1中第4280-7585位部分的3306bp堿基序列(序列號15)。所得Kosena油菜籽的基因組堿基序列與園紅蘿卜的序列比較，3306bp中只發(fā)現(xiàn)7bp的DNA堿基發(fā)生置換，由此可知二者具有高度的同源性。
此外，用RT-PCR法獲得Kosena油菜籽的可育性恢復(fù)基因的3’部分cDNA序列，確認內(nèi)含子的剪接方式與園紅蘿卜的相同。由Kosena油菜籽的花蕾按照常規(guī)方法AGPC(Acid Guanidium-Phenol-Chloroform)法(秀潤社細胞工學(xué)分冊生物實驗實例②基因分析的基礎(chǔ)P161-166)，提取全長RNA。由1μg的全長RNA，用SUPERSCRIPTII RNaseH-Reverse Transcriptase(Invitrogen公司生產(chǎn))，合成cDNA?？捎曰謴?fù)基因3’部分特異性正向引物使用5’-TGGAGTAAAGAGGAACTAAAAAGGGC-3’(序列號32)，可育性恢復(fù)基因3’部分特異性反向引物使用5’-CAGACAATAGACGCATAAAAGGC-3’(序列號33)。在1μl的Kosena油菜籽cDNA溶液中加入14.9μl的滅菌水、2.5μl的10×PCR緩沖液(寶酒造公司生產(chǎn))、1.5μl的25mM MgCl2、2μl的2.5mM dNTP混合物、1.5μl的10μM正向引物溶液、1.5μl的10μM反向引物溶液、0.1μl的5unit/μl的TaKaRa Taq(寶酒造公司生產(chǎn))并混和后，反復(fù)進行94℃40秒、60℃30秒、72℃2分的循環(huán)35次，擴增DNA。熱循環(huán)儀使用UNOII(Biometra公司生產(chǎn))。在3μl的擴增產(chǎn)物中，加入1μl pGEM-Teasy載體(Promega公司生產(chǎn))和5μl的2×連接緩沖液(Promega公司生產(chǎn))、1μl的T4 DNA連接酶(Promega公司生產(chǎn))，室溫下放置1小時，使其與載體結(jié)合。用該載體性狀轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(Gibco BRL公司生產(chǎn))，得到無性系。用常規(guī)的方法測定所得無性系的堿基序列，可以確認Kosena油菜籽的cDNA中其內(nèi)含子的剪接方式與園紅蘿卜相同。亦即，通過上述基因組序列的比較發(fā)現(xiàn)的7bp的堿基置換存在于序列號1的5444bp-5814bp中，對剪接沒有影響。
由以上可知，Kosena油菜籽的可育性恢復(fù)基因以與園紅蘿卜同樣的形式表達mRNA。只編碼翻譯區(qū)域的cDNA序列如序列號16所示。此外，由該cDNA序列得到了氨基酸序列(序列號17)。
實施例13蘿卜野生種Raphanus raphanistrum(以下稱為R.raphanistrum)可育性恢復(fù)基因部分序列的分離由cDNA分離R.raphanistrum的可育性恢復(fù)基因的部分序列(mRNA的純化)由R.raphanistrum的花蕾按照常規(guī)方法AGPC(AcidGuanidium-Phenol-Chlorroform)法(秀潤社細胞工學(xué)分冊生物實驗實例②基因分析的基礎(chǔ)P161-166)，提取全長RNA。由全長RNA采用利用寡脫氧胸苷酸纖維素柱的“mRNA純化試劑盒”(AmershamPharmacia公司)純化PolyA+RNA，得到mRNA。
(cDNA的部分序列分離)由1μg純化的mRNA，采用“Marathon RACE system5’RACE3’RACE”試劑盒(Clonetech公司生產(chǎn))合成cDNA。
可育性恢復(fù)基因特異性正向引物使用5’-GATTCCTTTCTCTTGCATTTCAG-3’(序列號34)、可育性恢復(fù)基因特異性反向引物使用5’-ATCTCGTCCTTTACCTTCTGTGG-3’(序列號35)。
在1μl的R.raphanistrum cDNA溶液中加入14.4μl的滅菌水、2.5μl的10×Pyrobest PCR緩沖液(寶酒造公司生產(chǎn))、2μl的2.5mM dNTP混合物、2.5μl的10μM正向引物溶液、2.5μl的10μM反向引物溶液、0.1μl的5unit/μl的Pyrobest DNA聚合酶(寶酒造公司生產(chǎn))并混和后，反復(fù)進行98℃5秒、55℃ 30秒、72℃1分30秒的循環(huán)30次，擴增DNA。熱循環(huán)儀使用UNOII(Biometra公司生產(chǎn))。在擴增的DNA溶液中，加入0.1μl的5unit/μl TaKaRa Taq(寶酒造公司生產(chǎn))混和后，72℃下加溫處理10分鐘，在DNA的3’末端添加腺嘌呤核苷酸。在3μl的擴增產(chǎn)物中加入1μl pGEM-Teasy載體(Promega公司生產(chǎn))和5μl的2×連接緩沖液(Promega公司生產(chǎn))、1μl的T4 DNA連接酶(Promega公司生產(chǎn))，室溫下放置1小時，使其與載體結(jié)合。用該載體性狀轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(Gibco BRL公司生產(chǎn))，得到無性系。用常規(guī)的方法測定所得無性系的堿基序列后，得到cDNA部分序列(序列號20)。進一步由cDNA序列得到氨基酸序列(序列號21)。
實施例14Ogura油菜籽可育性恢復(fù)基因的分離由通過交配導(dǎo)入Ogura蘿卜的可育性恢復(fù)基因得到的油菜籽系統(tǒng)(以下稱為Ogura油菜籽)，用5’-RACE法和3’-RACE法分離可育性恢復(fù)基因的cDNA序列。
(mRNA的純化)由Ogura油菜籽的花蕾按照常規(guī)方法AGPC(Acid Guanidium-Phenol-Chloroform)法(秀潤社細胞工學(xué)分冊生物實驗實例②基因分析的基礎(chǔ)161-166)，提取全長RNA。由全長RNA采用利用寡脫氧胸苷酸纖維素柱的“mRNA純化試劑盒”(Amersham Pharmacia公司)純化PolyA+RNA，得到mRNA。
(cDNA部分序列的分離)用1μg純化的mRNA，采用“Marathon RACE system 5’RACE3’RACE”試劑盒(Clontech公司生產(chǎn))合成cDNA?？捎曰謴?fù)基因特異性正向引物使用5’-GATCCATGCATTTGTCAAGG-3’(序列號36)，可育性恢復(fù)基因特異性反向引物使用5’-CATTTGTGTAGCCTCATCTAGG-3’(序列號37)。
在1μl的Ogura油菜籽cDNA溶液中加入14.4μl的滅菌水、2.5μl的10×Pyrobest PCR緩沖液(寶酒造公司生產(chǎn))、2μl的2.5mMdNTP混合物、2.5μl的10μM正向引物溶液、2.5μl的10μM反向引物溶液、0.1μl的5unit/μl的Pyrobest DNA聚合酶(寶酒造公司生產(chǎn))并混和后，反復(fù)進行98℃5秒、55℃30秒、72℃1分30秒的循環(huán)30次，擴增DNA。熱循環(huán)儀使用UNOII(Biometra公司生產(chǎn))。在擴增的DNA溶液中，加入0.1μl的5unit/μl TaKaRa Taq混和后，72℃下加溫處理10分鐘，在DNA的3’末端添加腺嘌呤核苷酸。在3μl的擴增產(chǎn)物中加入1μl pGEM-Teasy載體(Promega公司生產(chǎn))和5μl的2×連接緩沖液(Promega公司生產(chǎn))、1μl的T4 DNA連接酶(Promega公司生產(chǎn))，室溫下放置1小時，使其與載體結(jié)合。用該載體性狀轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(Gibco BRL公司生產(chǎn))，得到無性系。用常規(guī)的方法測定所得無性系的堿基序列后，得到4種cDNA部分序列。根據(jù)所得的4種序列信息，在4種序列的共同部分設(shè)定5’-RACE和3’-RACE用引物，分別進行cDNA的分離。
(通過5’-RACE和3’-RACE分離cDNA)與上述同樣合成cDNA，采用“Mara thon RACE system 5’RACE3’RACE”試劑盒(Clontech公司生產(chǎn))進行5’-RACE和3’-RACE，分離cDNA。作為基因特異性引物，在5’-RACE中，使用5’-CATTTGTGTAGCCTCATCTAGG-3’(序列號37)和5’-GTCCGGAGAGCAGCCCTTGGTAG-3’(序列號38)，在3’-RACE中，使用5’-TCATCGTATAATTCTTCAGCCTC-3’(序列號39)。
在5’-RACE中，進行2次PCR得到DNA。在2μl的250倍稀釋的Ogura油菜籽cDNA溶液中，加入8.6μl的滅菌水、2μl的10×LA PCR緩沖液(寶酒造公司生產(chǎn))、2μl的25mM MgCl2、3.2μl的2.5mM dNTP混合物、1μl的10μM序列號9907F的引物溶液、1μl的10μM銜接頭引物溶液(Marathon RACE system 5’RACE 3’RACE’試劑盒，Clontech公司生產(chǎn))、0.2μl的5unit/μl的TaKaRa LA Taq(寶酒造公司生產(chǎn))并混和后，反復(fù)進行98℃5秒、72℃3分的循環(huán)5次；98℃5秒、70℃3分3的循環(huán)5次；98℃5秒、68℃3分的循環(huán)25次，擴增DNA。將所得的DNA溶液稀釋100倍，向其中的2μl中，加入8.6μl的滅菌水、2μl的10×LA PCR緩沖液(寶酒造公司生產(chǎn))、2μl的25mM MgCl2、3.2μl的2.5mM dNTP混合物、1μl的10μM序列號5’ogu-1的引物溶液、1μl的10μM銜接頭引物溶液(MarathonRACE system 5’RACE 3’RACE’試劑盒，Clontech公司生產(chǎn))、0.2μl的5unit/μl的TaKaRa LA Taq(寶酒造公司生產(chǎn))并混和后，反復(fù)進行98℃5秒、72℃3分的循環(huán)5次；98℃5秒、70℃3分的循環(huán)5次；98℃5秒、68℃3分的循環(huán)25次，擴增DNA。熱循環(huán)儀使用UNOII(Biometra公司生產(chǎn))。
3’-RACE中，在2μl的50倍稀釋的Ogura油菜籽cDNA溶液中，加入8.6μl的滅菌水、2μl的10×LAPCR緩沖液(寶酒造公司生產(chǎn))、2μl的25mM MgCl2、3.2μl的2.5mM dNTP混合物、1μl的10μM序列號3’ogu-1的引物溶液、1μl的10μM銜接頭引物溶液(Marathon RACE system 5’RACE 3’RACE’試劑盒，Clontech公司生產(chǎn))、0.2μl的5unit/μl的TaKaRa LA Taq(寶酒造公司生產(chǎn))，混和后，反復(fù)進行98℃5秒、68℃30秒、72℃2分的循環(huán)35次，擴增DNA。
在3μl的擴增產(chǎn)物中加入1μl pGEM-Teasy載體(Promega公司生產(chǎn))和5μl的2×連接緩沖液(Promega公司生產(chǎn))、1μl的T4 DNA連接酶(Promega公司生產(chǎn))，室溫下放置1小時，使其與載體結(jié)合。用該載體性狀轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(Gibco BRL公司生產(chǎn))，得到無性系。測定所得無性系的堿基序列后，得到與上述4種cDNA部分序列對應(yīng)的5’-RACE序列和3’-RACE序列，將各序列結(jié)合起來，即得到全長cDNA序列。其中與園紅蘿卜的cDNA序列同源性最高的序列為Kosena油菜籽的可育性恢復(fù)基因(序列號18)。進一步由cDNA得到氨基酸序列(序列號19)。
實施例15可育性恢復(fù)基因的解析對由上述方法所得的各可育性恢復(fù)基因，用基因分析軟件“MacVector 6.5”(Oxford Molecular Ltd.)分析cDNA序列及氨基酸序列的同源性，用英國的Sanger研究所的Protein families database ofaligments and HMNs對其基序進行分析。
本發(fā)明的來源于園紅蘿卜、Kosena油菜籽和Ogura油菜籽的Rf基因都有16個PPR基序，這些PPR基序群從氨基末端一側(cè)起分割為5個、7個及4個基序的3個模序，位于從氨基末端側(cè)起第2個PPR基序的第4個氨基酸是天冬酰胺。此外，對于來源于Raphanusraphanistrum的部分片段，對其相當(dāng)于上述序列的部分(序列號26的第94-264位)首次進行了分析，其含有相當(dāng)于氨基末端的第1至第6的PPR基序的部分，PPR基序群和位于氨基末端側(cè)起第2個PPR基序的第4個氨基酸也具有上述特征。
此外，由園紅蘿卜、Kosena油菜籽、Ogura油菜籽得到的3種可育性恢復(fù)基因與R.raphanistrum的可育性恢復(fù)基因部分序列的分析結(jié)果得到的本發(fā)明蛋白質(zhì)(序列號26)及其編碼基因(序列號22)中，園紅蘿卜和Kosena油菜籽的同源性非常高，氨基酸序列表現(xiàn)出高達99.6％的值(僅發(fā)現(xiàn)3個位置的氨基酸不同)；堿基序列表現(xiàn)出高達99.7％的值，因此特別優(yōu)選具有序列號29所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)及其編碼基因(序列號25)。
另一方面，比較Ogura油菜籽與園紅蘿卜、Ogura油菜籽與Kosena油菜籽，都顯示出高的同源性，其氨基酸序列的同源性如下，Ogura油菜籽與園紅蘿卜比較為92.0％，Ogura油菜籽與Kosena油菜籽比較為91.6％，堿基序列的同源性均為約95％，這些值都低于園紅蘿卜與Kosena油菜籽間的同源性。
工業(yè)實用性根據(jù)本發(fā)明，分離了Rf基因，特別是來源于蘿卜的Rf1基因，并鑒定了其結(jié)構(gòu)。此外，根據(jù)本發(fā)明，利用分離的Rf基因，可以提供建立油菜籽恢復(fù)系統(tǒng)的方法。
序列表<110>三菱化學(xué)公司<120>參與由細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)至可育的蛋白質(zhì)及編碼該蛋白質(zhì)的基因<130>A21220A<160>39<210>1<211>8553<212>DNA<213>蘿卜<400>1atttaaattt tatacttaat atgtatttaa actctccaat gcaataaggg atataaacaa 60aaggtattca tagatgttat gtattcgtac accgatgtat tcgtatacct taaatatatg 120tatacttatg tatacatata cttgtgtatt cgtacacctt aagtattcga tgggttatgt 180tggtattcgt atattttatg tatttgtaca ccttatgtat acttatgtat atgtacacct 240tatgtatttg tacatcttaa gtattagatg agttatgttg atattcgtac accttatgta 300ttcgtacacc ttctgtatac cttaggtatt cgtacacctt aggtatttgt acacctaagg 360tattcgtaca ccttatgtat acttatgtat acgtacacct tatatattcg aacaccttag 420atattcgtac atcttatgta tacgtatact tatttcttga gttatagtga attagattgt 480attaaacgtt agacataggg ttccggattt atccaagggt tccagattgt ttcagattct 540ggatttaccc aatggttctg gatttaccca agggttccgg atttaggatt caaggtttag 600agtttaggat tttaggttta gtgttttgtt gatgattttt aatatttaag ataaatgtag 660acaaatttgt tcttcctacc attttgacaa aaaatgaaag atctatgtag gtttccaagt 720ttattaaatt tacccagatt tatgaaaatt atccataaat ttatataatt ttatgaataa 780tttatcattt atttgggtaa atttcataaa tatgaaagtt tcttttatgg gtcaaaatgt 840ataatttatt cggattctgg atttacccaa gggttccgga tttacccaag gattccagat 900ttaggattca tggtttagag tttaggagtt tatgtttagt gttttgttga tgattttaaa 960
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atgaaaaaat atgtattata ttaaaagtag ttgctcatat atgattttta aatattaaat 2640atgatccaaa agtttaatga ataaagaatg tttatggaat ttacaaaagt tagttgttaa 2700aagttagtgg gaaaaaaatt attttttata ggcaaagtgg attttgggtc ccacgaaatt 2760acttttccaa cttgccaagt ttaataggca aaaaggttaa aaatgtcata aatttattct 2820ctctctacta ggttgcccaa ttgcctaata taaacttgag gtggcctatt tttctaattc 2880aaacttaaaa gttgcccttt cccctaattg acccataaaa gaatgaaaga catttttctt 2940ttccaaatta caatccctag ataattttat tttgtaggtg cattccatcg gttatgatta 3000cagaatagct acgcttctct attgattctt attgcgccgt tggtgacgtt ttccatggaa 3060tcaagtagtg ttttatctcc tatcactaac aacatattca tagattttgt ttatcacttg 3120ttctgtgttc ctgatcatat acttgactca gtttctgtga tttcatcaag tttttgagaa 3180cagaagaagc aaaaaagaaa acgagcagag ctgctcttac aatgttttaa ccgtgagtga 3240taaatttatt tacataaaag tattttaaaa atagatttaa tcaaccaatt taatatatta 3300ttttatattt agttcatttt tttttgacat cttttatatt tagtttagaa cacctctatt 3360tgagtacaac atagattata atgataaatt tataaaatag cataattttt tattttcatt 3420gttttatgat aaaattctaa ataacaataa ttataatatt attatattac taattgcaaa 3480aattaattaa tacattattt tataataaat atttaaaacg ttgggtagga ttttgttaga 3540tttttttcaa caaattttgt tatagctaaa ataaaattca aatgtattgt taaaattgat 3600tttttttttt tttgattatt aagatttaat ataaataaac atatatgtca tattaaatat 3660ttaactaagt ggtcctaatc tttgaactag gggtgggcgt tcgggtacct attcgggttt 3720cggttcgagt ctattcggat ttcggatttt tggggtcaaa gattttagcc ccattcggtt 3780atttctaaat tacggttcgg gttcggttcg gatccttgcg gattcggttc gggttcggat 3840aacccgttta aattattttc aaaattttaa aatttcatta tatattttaa acttttcgaa 3900atttgtaaac aaaataatat attacatata aatttcaata atatgtgtcg aagtaccaaa 3960acttaacatg taaattggtt tgatttggat atttggatag aaaatcaatc atattttata 4020tatttttggt gttttgagta tgctttaact atttatacat gtacttttta atgtttttat 4080atattttcta gtattttgaa caatttaaaa gtattatata tattttagat gctttttaat 4140atatattcaa tctaaaaata gttaaatata tatgtatatt aatctatttc ggatacattc 4200
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tct gcg gct aga ttg ttc tgt acg aga tcg att cgt gat act ctg gcc 96Ser Ala Ala Arg Leu Phe Cys Thr Arg Ser Ile Arg Asp Thr Leu Ala20 25 30aag gca agc gga gag agt tgc gaa gca ggt ttt gga gga gag agt ttg 144Lys Ala Ser Gly Glu Ser Cys Glu Ala Gly Phe Gly Gly Glu Ser Leu35 40 45aag ctg caa agt ggg ttt cat gaa atc aaa ggt tta gag gat gcg att 192Lys Leu Gln Ser Gly Phe His Glu Ile Lys Gly Leu Glu Asp Ala Ile50 55 60gat ttg ttc agt gac atg ctt cga tct cgt cct tta cct tct gtg gtt 240Asp Leu Phe Ser Asp Met Leu Arg Ser Arg Pro Leu Pro Ser Val Val65 70 75 80gat ttc tgt aaa ttg atg ggt gtg gtg gtg aga atg gaa cgc ccg gat 288Asp Phe Cys Lys Leu Met Gly Val Val Val Arg Met Glu Arg Pro Asp85 90 95ctt gtg att tct ctc tat cag aag atg gaa agg aaa cag att cga tgt 336Leu Val Ile Ser Leu Tyr Gln Lys Met Glu Arg Lys Gln Ile Arg Cys100 105 110gat ata tac agc ttc aat att ctg ata aaa tgt ttc tgc agc tgc tct 384Asp Ile Tyr Ser Phe Asn Ile Leu Ile Lys Cys Phe Cys Ser Cys Ser115 120 125aag ctc ccc ttt gct ttg tct aca ttt ggt aag atc acc aag ctt gga 432Lys Leu Pro Phe Ala Leu Ser Thr Phe Gly Lys Ile Thr Lys Leu Gly130 135 140ctc cac cct gat gtt gtt acc ttc acc acc ctg ctc cat gga tta tgt 480Leu His Pro Asp Val Val Thr Phe Thr Thr Leu Leu His Gly Leu Cys145 150 155 160
gtg gaa gat agg gtt tct gaa gcc ttg gat ttt ttt cat caa atg ttt 528Val Glu Asp Arg Val Ser Glu Ala Leu Asp Phe Phe His Gln Met Phe165 170 175gaa acg aca tgt agg ccc aat gtc gta acc ttc acc act ttg atg aac 576Glu Thr Thr Cys Arg Pro Asn Val Val Thr Phe Thr Thr Leu Met Asn180 185 190ggt ctt tgc cgc gag ggt aga att gtc gaa gcc gta gct ctg ctt gat 624Gly Leu Cys Arg Glu Gly Arg Ile Val Glu Ala Val Ala Leu Leu Asp195 200 205cgg atg atg gaa gat ggt ctc cag cct acc cag att act tat gga aca 672Arg Met Met Glu Asp Gly Leu Gln Pro Thr Gln Ile Thr Tyr Gly Thr210215 220atc gta gat ggg atg tgt aag aag gga gat act gtg tct gca ctg aat 720Ile Val Asp Gly Met Cys Lys Lys Gly Asp Thr Val Ser Ala Leu Asn225 230 235 240ctg ctg agg aag atg gag gag gtg agc cac atc ata ccc aat gtt gta 7684eu Leu Arg Lys Met Glu Glu Val Ser His Ile Ile Pro Asn Val Val245 250 255atc tat agt gca atc att gat agc ctt tgt aaa gac gga cgt cat agc 816Ile Tyr Ser Ala Ile Ile Asp Ser Leu Cys Lys Asp Gly Arg His Ser260 265 270gat gca caa aat ctt ttc act gaa atg caa gag aaa gga atc ttt ccc 864Asp Ala Gln Asn Leu Phe Thr Glu Met Gln Glu Lys Gly Ile Phe Pro275 280 285gat tta ttt acc tac aac agt atg ata gtt ggt ttt tgt agc tct ggt 912Asp Leu Phe Thr Tyr Asn Ser Met Ile Val Gly Phe Cys Ser Ser Gly290 295 300
aga tgg agc gac gcg gag cag ttg ttg caa gaa atg tta gaa agg aag 960Arg Trp Ser Asp Ala Glu Gln Leu Leu Gln Glu Met Leu Glu Arg Lys305 310 315 320atc agc cct gat gtt gta act tat aat gct ttg atc aat gca ttt gtc 1008Ile Ser Pro Asp Val Val Thr Tyr Asn Ala Leu Ile Asn Ala Phe Val325 330 335aag gaa ggc aag ttc ttt gag gct gaa gaa tta tac gat gag atg ctt 1056Lys Glu Gly Lys Phe Phe Glu Ala Glu Glu Leu Tyr Asp Glu Met Leu340 345 350cca agg ggt ata atc cct aat aca atc aca tat agt rca atg arc gat 1104Pro Arg Gly Ile Ile Pro Asn Thr Ile Thr Tyr Ser Ser Met Ile Asp355 360 365gga ttt tgc aaa cag aat cgt ctt gat gct gct gag cac atg ttt tat 1152Gly Phe Cys Lys Gln Asn Arg Leu Asp Ala Ala Glu His Met Phe Tyr370 375 380ttg atg gct acc aag ggc tgc tct ccc aac cta atc act ttc aat act 1200Leu Met Ala Thr Lys Gly Cys Ser Pro Asn Leu Ile Thr Phe Asn Thr385 390 395 400ctc ata gac gga tat tgt ggg gct aag agg ata gat gat gga atg gaa 1248Leu Ile Asp Gly Tyr Cys Gly Ala Lys Arg Ile Asp Asp Gly Met Glu405 410 415ctt ctc cat gag atg act gaa aca gga tta gtt gct gac aca act act 1296Leu Leu His Glu Met Thr Glu Thr Gly Leu Val Ala Asp Thr Thr Thr420 425 430tac aac act ctt att cac ggg ttc tat ctg gtg ggc gat ctt aat gct 1344Tyr Asn Thr Leu Ile His Gly Phe Tyr Leu Val Gly Asp Leu Asn Ala435 440 445
gct cta gac ctt tta caa gag atg atc tct agt ggt ttg tgc cct gat 1392Ala Leu Asp Leu Leu Gln Glu Met Ile Ser Ser Gly Leu Cys Pro Asp450 455 460atc gtt act tgt gac act ttg ctg gat ggt ctc tgc gat aat ggg aaa 1440Ile Va1 Thr Cys Asp Thr Leu Leu Asp Gly Leu Cys Asp Asn Gly Lys465 470 475 480cta aaa gat gca ttg gaa atg ttt aag gtt atg cag aag agt aag aag 1488Leu Lys Asp Ala Leu Glu Met Phe Lys Val Met Gln Lys Ser Lys Lys485 490 495gat ctt gat gct agt cac ccc ttc aat ggt gtg gaa cct gat gtt caa 1536Asp Leu Asp Ala Ser His Pro Phe Asn Gly Val Glu Pro Asp Val Gln500 505 510act tac aat ata ttg atc agc ggc ttg atc aat gaa ggg aag ttt tta 1584Thr Tyr Asn Ile Leu Ile Ser Gly Leu Ile Asn Glu Gly Lys Phe Leu515 520 525gag gcc gag gaa tta tac gag gag atg ccc cac agg ggt ata gtc cca 1632Glu Ala Glu Glu Leu Tyr Glu Glu Met Pro His Arg Gly Ile Val Pro530 535 540gat act atc acc tat agc tca atg atc gat gga tta tgc aag cag agc 1680Asp Thr Ile Thr Tyr Ser Ser Met Ile Asp Gly Leu Cys Lys Gln Ser545 550 555 560cgc cta gat gag gct aca caa atg ttt gat tcg atg ggt agc aag agc 1728Arg Leu Asp Glu Ala Thr Gln Met Phe Asp Ser Met Gly Ser Lys Ser565 570 575ttc tct cca aac gta gtg acc ttt act aca ctc att aat ggc tac tgt 1776Phe Ser Pro Asn Val Val Thr Phe Thr Thr Leu Ile Asn Gly Tyr Cys580 585 590
aag gca gga agg gtt gat gat ggg ctg gag ctt ttc tgc gag atg ggt 1824Lys Ala Gly Arg Val Asp Asp Gly Leu Glu Leu Phe Cys Glu Met Gly595 600 605cga aga ggg ata gtt gct aac gca att act tac atc act ttg att tgt 1872Arg Arg Gly Ile Val Ala Asn Ala Ile Thr Tyr Ile Thr Leu Ile Cys610 615 620ggt ttt cgt aaa gtg ggt aat att aat ggg gct cta gac att ttc cag 1920Gly Phe Arg Lys Val Gly Asn Ile Asn Gly Ala Leu Asp Ile Phe Gln625 630 635 640gag atg att tca agt ggt gtg tat cctgatacc att acc atc cgc aat 1968Glu Met Ile Ser Ser Gly Val Tyr Pro Asp Thr Ile Thr Ile Arg Asn645 650 655atg ctg act ggt tta tgg agt aaa gag gaa cta aaa agg gca gtg gca 2016Met Leu Thr Gly Leu Trp Ser Lys Glu Glu Leu Lys Arg Ala Val Ala660 665 670atg ctt gag aaa ctg cag atg agt atg gat cta tca ttt ggg gga tga 2064Met Leu Glu Lys Leu Gln Met Ser Met Asp Leu Ser Phe Gly Gly675 680 685<210>3<2ll>687<212>PRT<213>蘿卜<400>3Met Leu Ala Arg Val Cys Gly Phe Lys Cys Ser Ser Ser Pro Ala Glu1 5 10 15Ser Ala Ala Arg Leu Phe Cys Thr Arg Ser Ile Arg Asp Thr Leu Ala20 25 30
Lys Ala Ser Gly Glu Ser Cys Glu Ala Gly Phe Gly Gly Glu Ser Leu35 40 45Lys Leu Gln Ser Gly Phe His Glu Ile Lys Gly Leu Glu Asp Ala Ile50 55 60Asp Leu Phe Ser Asp Met Leu Arg Ser Arg Pro Leu Pro Ser Val Val65 70 75 80Asp Phe Cys Lys Leu Met Gly Val Val Val Arg Met Glu Arg Pro Asp85 90 95Leu Val Ile Ser Leu Tyr Gln Lys Met Glu Arg Lys Gln Ile Arg Cys100 105 110Asp Ile Tyr Ser Phe Asn Ile Leu Ile Lys Cys Phe Cys Ser Cys Ser115 120 125Lys Leu Pro Phe Ala Leu Ser Thr Phe Gly Lys Ile Thr Lys Leu Gly130 135 140Leu His Pro Asp Val Val Thr Phe Thr Thr Leu Leu His Gly Leu Cys145 150 155 160Val Glu Asp Arg Val Ser Glu Ala Leu Asp Phe Phe His Gln Met Phe165 170 175Glu Thr Thr Cys Arg Pro Asn Val Val Thr Phe Thr Thr Leu Met Asn180 185 190Gly Leu Cys Arg Glu Gly Arg Ile Val Glu Ala Val Ala Leu Leu Asp195 200 205Arg Met Met Glu Asp Gly Leu Gln Pro Thr Gln Ile Thr Tyr Gly Thr210 215 220Ile Val Asp Gly Met Cys Lys Lys Gly Asp Thr Val Ser Ala Leu Asn225 230 235 240Leu Leu Arg Lys Met Glu Glu Val Ser His Ile Ile Pro Asn Val Val
245 250 255Ile Tyr Ser Ala Ile Ile Asp Ser Leu Cys Lys Asp Gly Arg His Ser260 265 270Asp Ala Gln Asn Leu Phe Thr Glu Met Gln Glu Lys Gly Ile Phe Pro275 280 285Asp Leu Phe Thr Tyr Asn Ser Met Ile Val Gly Phe Cys Ser Ser Gly290 295 300Arg Trp Ser Asp Ala Glu Gln Leu Leu Gln Glu Met Leu Glu Arg Lys305 310 315 320Ile Ser Pro Asp Val Val Thr Tyr Asn Ala Leu Ile Asn Ala Phe Val325 330 335Lys Glu Gly Lys Phe Phe Glu Ala Glu Glu Leu Tyr Asp Glu Met Leu340 345 350Pro Arg Gly Ile Ile Pro Asn Thr Ile Thr Tyr Ser Ser Met Ile Asp355 360 365Gly Phe Cys Lys Gln Asn Arg Leu Asp Ala Ala Glu His Met Phe Tyr370375 380Leu Met Ala Thr Lys Gly Cys Ser Pro Asn Leu Ile Thr Phe Asn Thr385 390 395 400Leu Ile Asp Gly Tyr Cys Gly Ala Lys Arg Ile Asp Asp Gly Met Glu405 410 415Leu Leu His Glu Met Thr Glu Thr Gly Leu Val Ala Asp Thr Thr Thr420 425 430Tyr Asn Thr Leu Ile His Gly Phe Tyr Leu Val Gly Asp Leu Asn Ala435 440 445Ala Leu Asp Leu Leu Gln Glu Met Ile Ser Ser Gly Leu Cys Pro Asp450 455 460
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115 120 125tgc tct aag ctg ccc ttt gct ttg tct aca ttt ggt aag ctc acc aag 432Cys Ser Lys Leu Pro Phe Ala Leu Ser Thr Phe Gly Lys Leu Thr Lys130 135 140ctt gga ctc cac cct gat gtt gtt acc ttc acc acc ctt ctc cac gga 480Leu Gly Leu His Pro Asp Val Val Thr Phe Thr Thr Leu Leu His Gly145 150 155 160ttg tgt gtg gaa aat agg ggt tct gaa gct ttg aat ttg ttt cat caa 528Leu Cys Val Glu Asn Arg Gly Ser Glu Ala Leu Asn Leu Phe His Gln165 170 175atg ttt gaa acg rca tgt agg ccc aat gtc gta acc ttc acc act ttg 576Met Phe Glu Thr Thr Cys Arg Pro Asn Val Val Thr Phe Thr Thr Leu180 185 190atg aac ggt ctt tgc cgc gag ggt aga att gtc gaa gcc gta gct cta 624Met Asn Gly Leu Cys Arg Glu Gly Arg Ile Val Glu Ala Val Ala Leu195 200 205ctt gat cgg atg atg gaa gat ggt ctc cag cct acc cag att act tat 672Leu Asp Arg Met Met Glu Asp Gly Leu Gln Pro Thr Gln Ile Thr Tyr210 215 220gga aca atc gta gat ggg atg tgt aag aag gga gat act gtg tct gca 720Gly Thr Ile Val Asp Gly Met Cys Lys Lys Gly Asp Thr Val Ser Ala225 230 235 240ctg aat ctg ctg agg aag atg gag gag gtg agc cac atc ata ccc aat 768Leu Asn Leu Leu Arg Lys Met Glu Glu Val Ser His Ile Ile Pro Asn245 250 255gtt gta atc tat agt gca atc att gat agc ctt tgt aaa gac gga cgt 816Val Val Ile Tyr Ser Ala Ile Ile Asp Ser Leu Cys Lys Asp Gly Arg
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Ser Leu Lys Leu Gln Ser Gly Phe His Glu Ile Lys Gly Leu Glu Asp50 55 60Ala Ile Asp Leu Phe Ser Asp Met Leu Arg Ser Arg Pro Leu Pro Ser65 70 75 80Val Val Asp Phe Cys Lys Leu Met Gly Val Val Val Arg Met Xaa Arg85 90 95Pro Asp Xaa Val Ile Ser Leu Xaa Xaa Lys Met Glu Xaa Xaa Xaa Ile100 105 110Xaa Cys Asp Xaa Tyr Ser Phe Asn Ile Leu Ile Lys Cys Phe Cys Ser115 120 125Cys Ser Lys Leu Pro Phe Ala Leu Ser Thr Phe Gly Lys Xaa Thr Lys130 135 140Leu Gly Leu His Pro Asp Val Val Thr Phe Thr Thr Leu Leu His Gly145 150 155 160Leu Cys Val Glu Xaa Arg Xaa Ser Glu Ala Leu Xaa Xaa Phe His Gln165 170 175Met Phe Glu Thr Thr Cys Arg Pro Asn Val Val Thr Phe Thr Thr Leu180 185 190Met Asn Gly Leu Cys Arg Glu Gly Arg IIe Val Glu Ala Val Ala Leu195 200 205Leu Asp Arg Met Met Glu Asp Gly Leu Gln Pro Thr Gln Ile Thr Tyr210 215 220Gly Thr Ile Val Asp Gly Met Cys Lys Lys Gly Asp Thr Val Ser Ala225 230 235 240Leu Asn Leu Leu Arg Lys Met Glu Glu Val Ser His Ile Ile Pro Asn245 250 255Val Val Ile Tyr Ser Ala Ile Ile Asp Ser Leu Cys Lys Asp Gly Arg
260 265 270His Ser Asp Xaa Gln Asn Leu Phe Thr Glu Met Gln Glu Lys Gly Ile275 280 285Phe Pro Asp Leu Phe Thr Tyr Asn Xaa Met Ile Xaa Gly Phe Cys Ser290 295 300Ser Gly Arg Trp Xaa Asp Ala Glu Gln Leu Leu Gln Glu Met Leu Glu305 310 315 320Arg Lys Ile Ser Pro Asp Val Val Thr Tyr Asn Ala Leu Ile Asn Ala325 330 335Phe Val Lys Glu Gly Lys Phe Phe Glu Ala Glu Glu Leu Tyr Asp Glu340 345 350Met Leu Pro Arg Gly Ile Ile Pro Asn Thr Ile Thr Tyr Ser Ser Met355 360 365Ile Asp Gly Phe Cys Lys Gln Asn Arg Leu Asp Ala Ala Glu His Met370 375 380Phe Tyr Leu Met Xaa Thr Lys Gly Cys Ser Pro Xaa Xaa Xaa Thr Phe385 390 395 400Asn Thr Leu Ile Asp Gly Tyr Xaa Gly Ala Lys Arg Ile Asp Asp Gly405 4l0 415Met Glu Leu Leu His Glu Met Thr Glu Xaa Gly Leu Val Ala Xaa Thr420 425 430Xaa Thr Tyr Asn Thr Leu Ile His Gly Phe Xaa Xaa Val Gly Asp Leu435 440 445Xaa Ala Ala Leu Asp Leu Leu Xaa Glu Met Ile Ser Ser Gly Xaa Cys450 455 460Pro Xaa Xaa Val Thr Cys Xaa Thr Leu Leu Asp Gly Leu Cys Asp Asn465 470 475 480
Gly Lys Leu Lys Asp Ala Xaa Glu Xaa Phe Lys Val Met Gln Lys Ser485 490 495Lys Xaa Asp Leu Asp Ala Ser His Pro Phe Asn Gly Val Glu Pro Asp500 505 510Val Gln Thr Tyr Asn Ile Leu Ile Ser Gly Leu Ile Asn Glu Gly Lys515 520 525Phe Leu Glu Ala Glu Glu Leu Tyr Xaa Glu Met Pro His Arg Gly Ile530 535 540Val Pro Asp Thr Ile Thr Tyr Ser Ser Met Ile Asp Gly Leu Cys Lys545 550 555 560Gln Ser Arg Leu Asp Glu Ala Thr Gln Met Phe Asp Ser Met Gly Ser565 570 575Lys Ser Phe Ser Pro Asn Val Val Thr Phe Thr Thr Leu Ile Xaa Gly580 585 590Tyr Cys Lys Ala GlyArg Val Asp Asp Gly Leu Glu Leu Phe Cys Glu595600 605Met Gly Arg Arg Gly Ile Val Ala Asn Xaa Ile Thr Tyr Ile Thr Leu610 615 620Ile Xaa Gly Phe Arg Xaa Val Gly Asn Ile Asn Gly Ala Leu Asp Ile625 630 635 640Phe Gln Glu Met Ile Ser Ser Gly Val Tyr Pro Xaa Xaa Ile Thr Ile645 650 655Arg Xaa Met Leu Thr Gly Leu Trp Ser Lys Glu Glu Leu Lys Arg Xaa660 665 670Val Ala Met Leu Glu Xaa Leu Gln Met Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa675 680 685Xaa Xaa
690<210>28<211>687<212>PRT<213>蘿卜屬<220>
<221>Xaa<222>111<223>Arg或Pro<221>Xaa<222>114<222>Ile或Val<221>Xaa<222>140<223>Leu或Ile<221>Xaa<222>150<223>Val或Ala<221>Xaa<222>153<223>Thr或Asn<221>Xaa<222>161<223>Val或Leu<221>Xaa<222>162<223>Glu或Asp
<221>Xaa<222>163<223>Asp或Lys<221>Xaa<222>170<223>Asn或Asp<221>Xaa<222>171<223>Leu或Phe<221>Xaa<222>184<223>Val或Ile<221>Xaa<222>185<223>Val或Ile<221>Xaa<222>196<223>Arg或Tyr<221>Xaa<222>200<223>Ile或Val<221>Xaa<222>211<223>Met或Leu<221>Xaa<222>218<223>Thr或Asp
<221>Xaa<222>232<223>Lys或Met<221>Xaa<222>248<223>Val或Leu<221>Xaa<222>252<223>Ile或Lys<400>28Met Leu Ala Arg Val Cys Gly Phe Lys Cys Ser Ser Sar Pro Ala Glu1 5 10 15Ser Ala Ala Arg Leu Phe Cys Thr Arg Ser Ile Arg Asp Thr Leu Ala20 25 30Lys Ala Ser Gly Glu Ser Cys Glu Ala Gly Phe Gly Gly Glu Ser Leu35 40 45Lys Leu Gln Ser Gly Phe His Glu Ile Lys Gly Leu Glu Asp Ala Ile50 55 60Asp Leu Phe Ser Asp Met Leu Arg Ser Arg Pro Leu Pro Ser Val Val65 70 75 80Asp Phe Cys Lys Leu Met Gly Val Val Val Arg Met Glu Arg Pro Asp85 90 95Leu Val Ile Ser Leu Tyr Gln Lys Met Glu Arg Lys Gln Ile Xaa Cys100 105 110Asp Xaa Tyr Ser Phe Asn Ile Leu Ile Lys Cys Phe Cys Ser Cys Ser115 120 125Lys Leu Pro Phe Mla Leu Ser Thr Phe Gly Lys Xaa Thr Lys Leu Gly
130 135 140Leu His Pro Asp Val Xaa Thr Phe Xas Thr Leu Leu His Gly Leu Cys145 150 155 160Xaa Xaa Xaa Arg Val Ser Glu Ala Leu Xaa Xaa Phe His Gln Met Phe165 170 175Glu Thr Thr Cys Arg Pro Asn Xaa Xaa Thr Phe Thr Thr Leu Met Asn180 185 190Gly Leu Cys Xaa Glu Gly Arg Xaa Val Glu Ala Val Ala Leu Leu Asp195 200 205Arg Met Xaa Glu Asp Gly Leu Gln Pro Xaa Gln Ile Thr Tyr Gly Thr210 215 220Ile Val Asp Gly Met Cys Lys Xaa Gly Asp Thr Val Ser Ala Leu Asn225 230 235 240Leu Leu Arg Lys Met Glu Glu Xaa Ser His Ile Xaa Pro Asn Val Val245 250 255Ile Tyr Ser Ala Ile Ile Asp Ser Leu Cys Lys Asp Gly Arg His Ser260 265 270Asp Ala Gln Asn Leu Phe Thr Glu Met Gln Glu Lys Gly Ile Phe Pro275 280 285Asp Leu Phe Thr Tyr Asn Ser Met Ile Val Gly Phe Cys Ser Ser Gly290 295 300Arg Trp Ser Asp Ala Glu Gln Leu Leu Gln Glu Met Leu Glu Arg Lys305 310 315 320Ile Ser Pro Asp Val Val Thr Tyr Asn Ala Leu Ile Asn Ala Phe Val325 330 335Lys Glu Gly Lys Phe Phe Glu Ala Glu Glu Leu Tyr Asp Glu Met Leu340 345 350
Pro Arg Gly Ile Ile Pro Asn Thr Ile Thr Tyr Ser Ser Met Ile Asp355 360 365Gly Phe Cys Lys Gln Asn Arg Leu Asp Ala Ala Glu His Met Phe Tyr370 375 380Leu Met Ala Thr Lys Gly Cys Ser Pro Asn Leu Ile Thr Phe Asn Thr385 390 395 400Leu Ile Asp Gly Tyr Cys Gly Ala Lys Arg lle Asp Asp Gly Met Glu405 410 415Leu Leu His Glu Met Thr Glu Thr Gly Leu Val Ala Asp Thr Thr Thr420 425 430Tyr Asn Thr Leu Ile His Gly Phe Tyr Leu Val Gly Asp Leu Asn Ala435 440 445Ala Leu Asp Leu Leu Gln Glu Met Ile Ser Ser Gly Leu Cys Pro Asp450 455 460Ile Val Thr Cys Asp Thr Leu Leu Asp Gly Leu Cys Asp Asn Gly Lys465 470 475480Leu Lys Asp Ala Leu Glu Met Phe Lys Val Met Gln Lys Ser Lys Lys485 490 495Asp Leu Asp Ala Ser His Pro Phe Asn Gly Val Glu Pro Asp Val Gln500 505 510Thr Tyr Asn Ile Leu Ile Ser Gly Leu Ile Asn Glu Gly Lys Phe Leu515 520 525Glu Ala Glu Glu Leu Tyr Glu Glu Met Pro His Arg Gly Ile Val Pro530 535 540Asp Thr Ile Thr Tyr Ser Ser Met Ile Asp Gly Leu Cys Lys Gln Ser545 550 555 560Arg Leu Asp Glu Ala Thr Gln Met Phe Asp Ser Met Gly Ser Lys Ser
565 570 575Phe Ser Pro Asn Val Val Thr Phe Thr Thr Leu Ile Asn Gly Tyr Cys580 585 590Lys Ala Gly Arg Val Asp Asp Gly Leu Glu Leu Phe Cys Glu Met Gly595 600 605Arg Arg Gly Ile Val Ala Asn Ala Ile Thr Tyr Ile Thr Leu Ile Cys610 615 620Gly Phe Arg Lys Val Gly Asn Ile Asu Gly Ala Leu Asp Ile Phe Gln625 630 635 640Glu Met Ile Ser Ser Gly Val Tyr Pro Asp Thr Ile Thr Ile Arg Asn645 650 655Met Leu Thr Gly Leu Trp Ser Lys Glu Glu Leu Lys Arg Ala Val Ala660 665 670Met Leu Glu Lys Leu Gln Met Ser Met Asp Leu Ser Phe Gly Gly675 680 685<210>29<211>687<212>PRT<213>蘿卜屬<220>
<221>Xaa<222>140<223>Leu或Ile<221>Xaa<222>170<223>Asn或Asp<221>Xaa
<222>171<223>Leu或Phe<400>29Met Leu Ala Arg Val Cys Gly Phe Lys Cys Ser Ser Ser Pro Ala Glu1 5 10 15Ser Ala Ala Arg Leu Phe Cys Thr Arg Ser Ile Arg Asp Thr Leu Ala20 25 30Lys Ala Ser Gly Glu Ser Cys Glu Ala Gly Phe Gly Gly Glu Ser Leu35 40 45Lys Leu Gln Ser Gly Phe His Glu Ile Lys Gly Leu Glu Asp Ala Ile50 55 60Asp Leu Phe Ser Asp Met Leu Arg Ser Arg Pro Leu Pro Ser Val Val65 70 75 80Asp Phe Cys Lys Leu Met Gly Val Val Val Arg Met Glu Arg Pro Asp85 90 95Leu Val Ile Ser Leu Tyr Gln Lys Met Glu Arg Lys Gln Ile Arg Cys100 105 110Asp Ile Tyr Ser Phe Asn Ile Leu Ile Lys Cys Phe Cys Ser Cys Ser115 120 125Lys Leu Pro Phe Ala Leu Ser Thr Phe Gly Lys Xaa Thr Lys Leu Gly130 135 140Leu His Pro Asp Val Val Thr Phe Thr Thr Leu Leu His Gly Leu Cys145 150 155 160Val Glu Asp Arg Val Ser Glu Ala Leu Xaa Xaa Phe His Gln Met Phe165 170 175Glu Thr Thr Cys Arg Pro Asn Val Val Thr Phe Thr Thr Leu Met Asn180 185 190
Gly Leu Cys Arg Glu Ghy Arg Ile Val Glu Ala Val Ala Leu Leu Asp195 200 205Arg Met Met Glu Asp Gly Let Gln Pro Thr Gln Ile Thr Tyr Gly Thr210 215 220Ile Val Asp Gly Met Cys Lys Lys Gly Asp Thr Val Ser Ala Leu Asn225 230 235 240Leu Leu Arg Lys Met Glu Glu Val Ser His Ile Ile Pro Asn Val Val245 250 255Ile Tyr Ser Ala Ile Ile Asp Ser Leu Cys Lys Asp Ghy Arg His Ser260 265 270Asp Ala Gln Asn Leu Phe Thr Glu Met Gln Glu Lys Gly Ile Phe Pro275 280 285Asp Leu Phe Thr Tyr Asn Ser Met Ile Val Gly Phe Cys Ser Ser Gly290 295 300Arg Trp Ser Asp Ala Glu Glr Leu Leu Gln Glu Met Leu Glu Arg Lys305 310 315 320Ile Ser Pro Asp Val Val Thr Tyr Asn Ala Leu Ile Asn Ala Phe Val325 330 335Lys Glu Gly Lys Phe Phe Glu Ala Glu Glu Leu Tyr Asp Glu Met Leu340 345 350Pro Arg Gly Ile Ile Pro Asr Thr Ile Thr Tyr Ser Ser Met Ile Asp355 360 365Gly Phe Cys Lys Gln Asn Arg Leu Asp Ala Ala Glu His Met Phe Tyr370 375 380Leu Met Ala Thr Lys Gly Cys Ser Pro Asn Leu Ile Thr Phe Asn Thr385 390 395 400Leu Ile Asp Gly Tyr Cys Gly Ala Lys Arg Ile Asp Asp Gly Met Glu
405 410 415Leu Leu His Glu Met Thr Glu Thr Gly Leu Val Ala Asp Thr Thr Thr420 425 430Tyr Asn Thr Leu Ile His Gly Phe Tyr Leu Val Gly Asp Leu Asn Ala435 440 445Ala Leu Asp Leu Leu Gln Glu Met Ile Ser Ser Gly Leu Cys Pro Asp450 455 460Ile Val Thr Cys Asp Thr Leu Leu Asp Gly Leu Cys Asp Asn Gly Lys465 470 475 480Leu Lys Asp Ala Leu Glu Met Phe Lys Val Met Gln Lys Ser Lys Lys485 490 495Asp Leu Asp Ala Ser His Pro Phe Asn Gly Val Glu Pro Asp Val Gln500 505 510Thr Tyr Asn Ile Leu Ile Ser Gly Leu Ile Asn Glu Gly Lys Phe Leu515 520 525Glu Ala Glu Glu Leu Tyr Glu Glu Met Pro His Arg Gly Ile Val Pro530 535 540Asp Thr Ile Thr Tyr Ser Ser Met Ile Asp Gly Leu Cys Lys Gln Ser545 550 555 560Arg Leu Asp Glu Ala Thr Gln Met Phe Asp Ser Met Gly Ser Lys Ser565 570 575Phe Ser Pro Asn Val Val Thr Phe Thr Thr Leu Ile Asn Gly Tyr Cys580 585 590Lys Ala Gly Arg Val Asp Asp Gly Leu Glu Leu Phe Cys Glu Met Gly595 600 605Arg Arg Gly Ile Val Ala Asn Ala Ile Thr Tyr Ile Thr Leu Ile Cys610 615 620
Gly Phe Arg Lys Val Gly Asn Ile Asn Gly Ala Leu Asp Ile Phe Gln625 630 635 640Glu Met Ile Ser Ser Gly Val Tyr Pro Asp Thr Ile Thr Ile Arg Asn645 650 655Met Leu Thr Gly Leu Trp Ser Lys Glu Glu Leu Lys Arg Ala Val Ala660 665 670Met Leu Glu Lys Leu Gln Met Ser Met Asp Leu Ser Phe Gly Gly675 680 685<210>30<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成DNA<400>30acataaaaat cactagatac ttgacatgga ggc33<210>31<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成DNA<400>31aagaggagga agatggcatc acagc 25<210>32<211>26<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成DNA<400>32tggagtaaag aggaactaaa aagggc26<210>33<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成DNA<400>33cagacaatag acgcataaaa ggc 23<210>34<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成DNA<400>34gattcctttc tcttgcattt cag 23<210>35<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成DNA
<400>35atctcgtcct ttaccttctg tgg 23<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成DNA<400>36gatccatgca tttgtcaagg 20<210>37<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成DNA<400>37catttgtgta gcctcatcta gg22<210>38<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成DNA<400>38gtccggagag cagcccttgg tag 23<210>39
<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成DNA<400>39tcatcgtata attcttcagc ctc 2權(quán)利要求
1.參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的蛋白質(zhì)，其特征在于，它含有14個以上的Pentatricopeptide Repeat(以下略稱為PPR)基序，該基序群分為3個以上的模序，每個模序至少有2個以上的PPR基序，而且在羧基末端(C末端)一側(cè)的模序含有4個PPR基序。
2.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，PPR基序的數(shù)量為14-16個。
3.權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，PPR基序群分為3個模序，從氨基末端(N末端)一側(cè)起各模序依次有5個、7個及4個PPR基序。
4.權(quán)利要求1-3所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，位于氨基末端(N末端)一側(cè)起第2個PPR基序的第4個氨基酸是除絲氨酸、蘇氨酸或半胱氨酸以外的氨基酸。
5.權(quán)利要求4所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，位于氨基末端(N末端)一側(cè)起第2個PPR基序的第4個氨基酸是天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或組氨酸中的任何一種。
6.權(quán)利要求1-5中任何一項所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，在氨基末端進一步含有易位至線粒體的信號肽序列，或者在羧基末端進一步含有-LysAspGluLeu-序列。
7.參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的蛋白質(zhì)，其特征在于，與細胞質(zhì)雄性不育基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物接觸后，使該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物發(fā)生凝膠移位。
8.參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的蛋白質(zhì)，它具有序列號26所述的氨基酸序列。
9.參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的蛋白質(zhì)，它具有序列號27所述的氨基酸序列。
10.參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的蛋白質(zhì)，它具有序列號28所述的氨基酸序列。
11.參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的蛋白質(zhì)，它具有序列號29所述的氨基酸序列。
12.下述任何一種蛋白質(zhì)(1)具有序列號3所述氨基酸序列的第80-687位的氨基酸序列、序列號17所述氨基酸序列的第80-687位的氨基酸序列、或序列號19所述氨基酸序列的第82-690位的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或(2)具有序列號3所述氨基酸序列的第80-687位的氨基酸序列、序列號17所述氨基酸序列的第80-687位的氨基酸序列、或序列號19所述氨基酸序列的第82-690位的氨基酸序列中1個至多個氨基酸的缺失、添加和/或置換的氨基酸序列，并且參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的蛋白質(zhì)。
13.下述任何一種蛋白質(zhì)(1)具有序列號3、序列號17、或序列號19所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或(2)具有序列號3、序列號17、或序列號19所述氨基酸序列中1個至多個氨基酸的缺失、添加和/或置換的氨基酸序列，并且參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的蛋白質(zhì)。
14.權(quán)利1-9項所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，細胞質(zhì)雄性不育個體含有Kosena蘿卜和/或Ogura蘿卜的細胞質(zhì)雄性不育基因或其同系物。
15.編碼權(quán)利要求1-10中任何一項所述的蛋白質(zhì)的DNA。
16.具有序列號22所述堿基序列的DNA。
17.具有序列號23所述堿基序列的DNA。
18.具有序列號24所述堿基序列的DNA。
19.具有序列號25所述堿基序列的DNA。
20.下述任何一種DNA(1)具有序列號2、序列號16、或序列號18所述堿基序列的DNA；或(2)具有序列號2、序列號16、或序列號18所述堿基序列中1個至多個堿基缺失、添加和/或置換的堿基序列，并且參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的DNA；或(3)與具有序列號2、序列號16、或序列號18所述堿基序列的DNA在嚴(yán)格條件下雜交，并且參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的DNA。
21.下述任何一種DNA(1)具有序列號1所述堿基序列的第3754-8553位的堿基序列或序列號15所述堿基序列的第812-3002位的堿基序列的DNA；或(2)具有序列號1所述堿基序列的第3754-8553位的堿基序列或序列號15所述堿基序列的第812-3002位的堿基序列中1個至多個堿基缺失、添加和/或置換的堿基序列，并且參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的DNA；或(3)與具有序列號1所述堿基序列的第3754-8553位的堿基序列或序列號15所述堿基序列的第812-3002位的堿基序列的DNA在嚴(yán)格條件下雜交，并且參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的DNA。
22.下述任何一種DNA(1)具有序列號1或序列號15所述堿基序列的DNA；或(2)具有序列號1或序列號15所述堿基序列中1個至多個堿基缺失、添加和/或置換的堿基序列，并且參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的DNA；或(3)與具有序列號1或序列號15所述堿基序列的DNA在嚴(yán)格條件下雜交，并且參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的DNA。
23.權(quán)利15-22項中任何一項所述的DNA，其中，細胞質(zhì)雄性不育個體含有Kosena蘿卜和/或Ogura蘿卜的細胞質(zhì)雄性不育基因或其同系物。
24.含有權(quán)利要求15-23中任何一項所述的DNA的載體。
25.含有權(quán)利要求15-23中任何一項所述的DNA或權(quán)利要求24所述的載體的性狀轉(zhuǎn)化體。
26.權(quán)利要求25所述的性狀轉(zhuǎn)化體，該性狀轉(zhuǎn)化體為性狀轉(zhuǎn)化植物。
27.一種細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求15-23中任何一項所述的DNA。
28.一種性狀轉(zhuǎn)化體，含有細胞質(zhì)雄性不育基因，而且通過進一步將權(quán)利要求15-23中任何一項所述的DNA的部分或全部與誘導(dǎo)型啟動子一起導(dǎo)入含有權(quán)利要求15-23中任何一項所述的DNA的細胞中，能夠調(diào)節(jié)雄性不育恢復(fù)基因的表達。
29.一種細胞質(zhì)雄性不育系統(tǒng)的維持方法，通過利用權(quán)利要求28所述的性狀轉(zhuǎn)化體維持。
30.一種檢測參與細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)的基因的方法，使用由權(quán)利要求15-23中任何一項所述的DNA任意設(shè)定的15-50mer的低聚核苷酸引物、或由權(quán)利要求15-23中任何一項所述的DNA的全部或部分構(gòu)成的至少15mer以上的探針，通過確認目的生物樣品中，通過該引物擴增的堿基序列的量、或通過探針檢測出的堿基序列的量在1個基因組中有1個以上基因，檢測參與細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)的基因。
31.一種啟動子DNA，含有序列號1所述堿基序列的第3754-5091位的堿基序列，或序列號15所述堿基序列的第1-811位的堿基序列。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于分離Rf基因，特別是來源于蘿卜的Rf1基因，并鑒定其結(jié)構(gòu)。根據(jù)本發(fā)明，提供參與細胞質(zhì)雄性不育個體的不育性恢復(fù)至可育的蛋白質(zhì)，其特征在于，該蛋白質(zhì)含有14個以上的Pentatricopeptide Repeat(以下略稱為PPR)基序，該PPR基序群分為3個以上的模序，每個模序至少有2個以上的PPR基序，而且，在羧基末端(C末端)一側(cè)的模序有4個PPR基序。
文檔編號C12N15/29GK1505639SQ02808968
公開日2004年6月16日 申請日期2002年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月25日
發(fā)明者今村順, 藤本英也, R·今井, 肥塚信也, 酒井隆子, 早川孝彥, 也, 子, 彥 申請人:三菱化學(xué)株式會社