專利名稱：細(xì)胞破裂的制作方法
細(xì)胞破裂
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)破裂細(xì)胞膜釋放細(xì)胞的成分的方法和設(shè)備。此可進(jìn)行，以便收獲一種或更多細(xì)胞成分用于在例如，生物學(xué)反應(yīng)中可能的進(jìn)一步處理。常常其是需要隨后診斷分析的細(xì)胞核酸(NA)組分。NA下文指稱RNA和DNA組分。方法可容易適應(yīng)于優(yōu)先釋放細(xì)胞基質(zhì)的蛋白性組分，如果此如此需要。偶爾必需首先純化祀NA分子，以便實(shí)施生物學(xué)反應(yīng)諸如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。例如NA本身起初含在被細(xì)胞膜保護(hù)的細(xì)胞之內(nèi)。由此，為對(duì)NA實(shí)施PCR，必需自其細(xì)胞釋放NA及進(jìn)入適合于下游提取和純化步驟的載體流體。
背景技術(shù)：
許多方法是細(xì)胞破裂目前可利用的。這些包括酸/堿，酶促，超聲處理(由超聲波破裂)或機(jī)械分離。但是，這些是耗時(shí)，一些是過(guò)度損傷及破壞NA本身，風(fēng)險(xiǎn)混雜和可引起不可再現(xiàn)的質(zhì)量和量的最終純化的產(chǎn)生的NA。而且許多存在的技術(shù)不是自動(dòng)化靈敏的。DNA提取常在潛在地危險(xiǎn)的化學(xué)品諸如苯酚和胍鎗鹽的存在下實(shí)施，以便移出可干擾隨后下游過(guò)程的不需要的細(xì)胞組分諸如脂肪和蛋白。會(huì)期望不依賴于這些毒性添加劑的快速方法。由溫度操作的DNA提取已描述于文獻(xiàn)。已描述使用沸騰以物理學(xué)破壞釋放NA的靶細(xì)胞的細(xì)胞膜。同樣，已關(guān)于植物材料特別描述通過(guò)使用液氮冷凍，其中冰晶的形成可物理學(xué)破壞這些組織類型的細(xì)胞膜，它們包含多糖。此細(xì)胞裂解方法會(huì)適合于直接包括進(jìn)許多診斷測(cè)定。已之前描述直接自簡(jiǎn)單靶諸如人血擴(kuò)增核酸序列的方法。在這些之前工作中細(xì)胞類型高度靈敏于裂解，且像這樣無(wú)需另外的步驟，以優(yōu)化緩沖流程以最小化由細(xì)胞內(nèi)容物的生物學(xué)過(guò)程的抑制。未描述更多復(fù)合靶，諸如細(xì)菌細(xì)胞的直接擴(kuò)增，及會(huì)需要添加蛋白酶和長(zhǎng)，耗時(shí)的下游處理。有在非常短時(shí)期內(nèi)獲得NA釋放，同時(shí)精確地控制量和質(zhì)量的純化的NA是高度期望的環(huán)境。能經(jīng)操作依賴于簡(jiǎn)單的時(shí)間和溫度動(dòng)力學(xué)的過(guò)程進(jìn)行此會(huì)可有價(jià)值。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的第I方面，提供用于細(xì)胞破裂的方法，包括放置含有細(xì)胞的物質(zhì)緊鄰熱電電池的工作面，其基面鄰近處于水的冷凍及沸騰溫度之間的基本上恒定溫度的熱源/匯，將電流施加到熱電電池以實(shí)質(zhì)上改變物質(zhì)的溫度。熱電電池可為珀耳帖電池。 在一實(shí)施方式中，熱電電池(TEC)與熱匯單獨(dú)關(guān)聯(lián)，及提供獨(dú)立的電阻性加熱器元件。在此實(shí)施方式中，因此單獨(dú)使用熱電電池以提供冷卻，因此減少對(duì)TEC的熱應(yīng)激。2個(gè)獨(dú)立加熱及冷卻裝置被相同的電子回路有利地控制，從而可達(dá)到任何溫度設(shè)置點(diǎn)。優(yōu)選的加熱器元件可為與容器本身緊密接觸的電阻性加熱器線，例如包含圍繞熱導(dǎo)電容器支架或中間體和熱導(dǎo)電支架諸如金屬杯電阻線圈。可替代性地采用UK專利說(shuō)明書GB1100625. I中所示的加熱手段。
本發(fā)明的方法可產(chǎn)生非?？焖偌?xì)胞破裂，及靈敏于通過(guò)例如改變實(shí)施的熱循環(huán)的循環(huán)數(shù)，利用的緩沖系統(tǒng)，如果任何，待達(dá)到的靶溫度及也漸變發(fā)生的速度來(lái)操作。在一實(shí)施方式中，第I步驟旨在將其工作面的溫度降低到冷凍，由此在靶細(xì)胞中形成冰晶，然后導(dǎo)致冰解凍。在另一實(shí)施方式中，溫度首先升高到沸騰，然后允許樣品冷卻。此后來(lái)的實(shí)施方式其當(dāng)細(xì)胞相對(duì)簡(jiǎn)單時(shí)是有用的。血是此一例。在再一實(shí)施方式中，采用熱循環(huán)，其可包含交替對(duì)熱電電池逆轉(zhuǎn)電流，其中電池多少循環(huán)冷凍及沸騰。需知，當(dāng)細(xì)胞沸騰時(shí)發(fā)生細(xì)胞破裂的溫度，通常是75°C以上。包含冷凍及沸騰的熱循環(huán)可重復(fù)多次。快速熱循環(huán)，也許甚至熱休克，也會(huì)在樣品的滲透勢(shì)中實(shí)現(xiàn)有用的變化，由此輔助細(xì)胞破裂。在特定環(huán)境中，方法可包含幾個(gè)加熱及冷卻循環(huán)，不冷凍，或僅偶然冷凍，或等同地幾個(gè)冷凍及解凍循環(huán)，有僅偶然或無(wú)加熱。熱循環(huán)的時(shí)程會(huì)依賴于樣品的樣品體積和容器性質(zhì)。循環(huán)速度可例如涉及冰晶體生成，由于不同冷卻速度會(huì)創(chuàng)建不同尺寸的冰晶，其會(huì)進(jìn)而不同地影響細(xì)胞破裂。方法可個(gè)別優(yōu)化依賴于許多因素，諸如NA釋放的特異性靶生物，需要的期望的NA產(chǎn)率，需要的個(gè)體 NA片段的尺寸及隨后實(shí)施的任何給定下游診斷測(cè)定的物理需求。此優(yōu)化可取改變溫度，時(shí)間，循環(huán)數(shù)和也NA釋放進(jìn)去的載體介質(zhì)本身的形式。但是，如果如此需要，可采用方法以釋放細(xì)胞基質(zhì)的其他蛋白性組分。循環(huán)過(guò)程在靶細(xì)胞中具有許多物理效應(yīng)。首先，加熱細(xì)胞到沸點(diǎn)導(dǎo)致細(xì)胞膜破壞，由此導(dǎo)致細(xì)胞組分大規(guī)模釋放進(jìn)提取基質(zhì)。加熱，而非冷卻是第I步驟的方法對(duì)NA被簡(jiǎn)單脂質(zhì)膜圍繞的血使用可為適合。在此情況中，實(shí)際上，在第I加熱循環(huán)之后，除了冷卻之外，裂解的物質(zhì)，不需要進(jìn)一步循環(huán)。但是，加熱單獨(dú)不足以自許多生物產(chǎn)生高質(zhì)量NA，由于在這些條件下NA保持與細(xì)胞蛋白關(guān)聯(lián)。隨后冷凍進(jìn)一步破壞余下的細(xì)胞結(jié)構(gòu)及重復(fù)冷凍足以變性與NA關(guān)聯(lián)的蛋白，和因此致使其適合于純化和隨后診斷使用。提取基質(zhì)，NA釋放的流體，也可為諸如旨在改善提取過(guò)程的結(jié)果。以其最簡(jiǎn)單的形式，本領(lǐng)域知道的任何緩沖劑，諸如TRIS EDTA (三氨基甲烷乙二胺四乙酸)，可用于實(shí)施冷凍/解凍。任何提取的NA會(huì)適合于立即下游處理，在此實(shí)例中，和像這樣，此是優(yōu)選的實(shí)施方式。一些靶細(xì)胞可對(duì)冷凍/解凍提取方法有抗性，及在這些實(shí)例中，包括另外的手段以裂解細(xì)胞內(nèi)容物可為必需。這些可尤其包括初始酶處理，預(yù)先的超聲處理和酸/堿處理。但是預(yù)期，任何其他破裂會(huì)通過(guò)操作細(xì)胞的滲透勢(shì)，例如通過(guò)改變提取基質(zhì)的鹽濃度和成分和還通過(guò)操作熱循環(huán)步驟來(lái)提供。步驟諸如包括酶處理，酸/堿處理，改變提取基質(zhì)的鹽濃度和成分可在本發(fā)明的方法之前實(shí)施，或可合并進(jìn)設(shè)備和過(guò)程。自由此破壞的細(xì)胞的特定成分的純化可然后通過(guò)使用本領(lǐng)域所知的過(guò)程實(shí)現(xiàn)，諸如簡(jiǎn)單的基于醇的沉淀方法或經(jīng)過(guò)任何可商購(gòu)的基于“柱”的系統(tǒng)。此會(huì)然后致使所述NA適合于隨后生物學(xué)過(guò)程諸如PCR。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，不會(huì)需要該中間步驟，及釋放的NA會(huì)用于下游生物學(xué)過(guò)程，諸如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，其用對(duì)此上清液優(yōu)化的酶和緩沖劑混合物實(shí)施。在此實(shí)例中，PCR緩沖劑會(huì)是就在多個(gè)冷凍解凍循環(huán)后無(wú)產(chǎn)率損失和另外地待被細(xì)胞內(nèi)容物最低限度抑制優(yōu)化的裂解培養(yǎng)基。有其他就該直接方法記載的方法，但這些限制于非常容易裂解的樣品，諸如血。描述的發(fā)明會(huì)能自更寬得多范圍的復(fù)合生物依靠能破壞蛋白和復(fù)合多糖細(xì)胞器經(jīng)冷凍解凍方法直接擴(kuò)增DNA。此會(huì)帶來(lái)能提供在單關(guān)閉的管容器中實(shí)施的基于快速PCR的診斷學(xué)的新優(yōu)勢(shì)，其不需求多個(gè)步驟，由此本身成為非-專家操作根據(jù)本發(fā)明的破裂過(guò)程是容易靈敏于自動(dòng)化及，更特別，作為可包括隨后純化和PCR或其他生物學(xué)過(guò)程的閉合過(guò)程實(shí)現(xiàn)。提供用于將以上直接所示的細(xì)胞裂解步驟包括進(jìn)下游過(guò)程諸如PCR以便進(jìn)一步減少該過(guò)程的時(shí)間和復(fù)雜性的方法和設(shè)備是本發(fā)明的特征。在多數(shù)情況中，過(guò)程可在單容器諸如管中實(shí)施，立即跟隨的是無(wú)需由PCR或其他生物學(xué)反應(yīng)中間純化是本發(fā)明的特別有價(jià)值的特征。根據(jù)本發(fā)明的此方面的方法提供快速和有效裂解方法，適合于自廣泛的生物，諸如例如，病原性細(xì)菌和病毒提取質(zhì)粒和基因組DNA。本發(fā)明的破裂過(guò)程可在約I分鐘之內(nèi)，當(dāng)然在5分鐘之內(nèi)完成，和可優(yōu)化以釋放任何期望的細(xì)胞組分，其是DNA，RNA或的確期望蛋白級(jí)分。當(dāng)將電壓施加于TEC時(shí)，流過(guò)的電流導(dǎo)致其第I面成為更溫和第2面成為更冷。逆 轉(zhuǎn)電流導(dǎo)致第I面冷卻及第2面變熱。由此，TEC可用于實(shí)施含有待在根據(jù)本發(fā)明的方法中破壞或裂解的細(xì)胞的樣品的加熱及冷卻，只要是第2或基面保持在沸騰及冰點(diǎn)中間的恒定溫度而第I或工作面是交替在沸騰及冷凍溫度。TEC優(yōu)選具有施加的電壓，使得樣品加熱到水的沸點(diǎn)(100°C)，在該點(diǎn)，逆轉(zhuǎn)對(duì)TEC的電壓及將樣品冷卻到在或小于0°C的溫度。但是，以此方式使用TEC的問(wèn)題是TEC的構(gòu)建中使用的不同材料，例如陶瓷和金屬的熱膨脹系數(shù)會(huì)，在現(xiàn)有TEC中，或即為可被稱的熱疲乏，其中工作面作為其溫度變化的結(jié)果連續(xù)旁側(cè)地膨脹及收縮，而基面基本上維持其尺度，導(dǎo)致當(dāng)重復(fù)該大量溫度反轉(zhuǎn)時(shí)分層。此問(wèn)題在本發(fā)明的第2方面解決。根據(jù)本發(fā)明的此第2方面，用于實(shí)施本發(fā)明的方法的設(shè)備包含具有由柱分離的基面和工作面的TEC，及設(shè)置為保持在恒定溫度的熱源/匯，基面柔性地附接于熱源/匯。以此方式，基面可隨著工作面扭曲膨脹及收縮，而后者由于其中的溫度變化而膨脹及收縮，但就TEC自熱源/匯的脫離或TEC解離而言傾向被減少。柱有利地由碲化鉍形成。在微量滴定設(shè)備的情景中，其柱盡可能短可為重要，在該情況中，電連接可最佳由降額的線形成，且所述線與HRM (熱移出模塊)盡可能緊密關(guān)聯(lián)，例如設(shè)置為由此經(jīng)過(guò)以保持線相對(duì)冷。有利地，基面附接于熱匯，下文可能稱為HRM，而工作面附接于反應(yīng)容器，或更可能反應(yīng)容器支架，在其中，例如，本發(fā)明的細(xì)胞破裂發(fā)生。附接優(yōu)選由熱導(dǎo)電柔性的粘合劑實(shí)現(xiàn)。粘合劑可具有大于lW/mK，優(yōu)選超過(guò)10W/mK的熱傳導(dǎo)率。因此，當(dāng)TEC的面金屬化，使用焊劑而將基面附接于熱匯是可能的，特別當(dāng)熱匯本身由金屬構(gòu)成時(shí)。優(yōu)選使用軟焊劑，諸如基于銦的焊劑，及焊劑的厚度被制成諸如也足夠減少其的熱應(yīng)激，且可為IOym和幾個(gè)mm之間的任何。為了確保焊劑厚度的一致性，可將間隔物放入焊劑。該間隔物會(huì)確保，當(dāng)焊劑粘合劑取其液相形式時(shí)，熱匯和TEC之間的間隔由此間隔物控制。替代性的方法和設(shè)備旨在采用僅TEC用于加熱或，更可能冷卻，及根據(jù)情況合并分離的加熱器或冷卻器。此可避免TEC中無(wú)法耐受的應(yīng)激。在加熱的情況中，適合的結(jié)構(gòu)可包含TEC，其具有貫穿其的空穴以接收容器，容器也被加熱器圍繞。正常情況下，該結(jié)構(gòu)會(huì)需要不同電供給，一個(gè)用于TEC和另一個(gè)用于加熱器。在此專利說(shuō)明書中，詞匯容器指稱能保持待處理的物質(zhì)或樣品的任何裝置，及反應(yīng)容器可因此包含孔，管(打開或關(guān)閉的)載玻片，也許以硅芯片或托架的形式。本發(fā)明特別關(guān)乎孔形式的微量滴定容器，盡管創(chuàng)建容器形式的TEC工作面可特別有利。在本發(fā)明中，用來(lái)保持待裂解的細(xì)胞的反應(yīng)容器可個(gè)別建立，或?yàn)榫€形，矩形，環(huán)狀陣列或其他陣列。一般，陣列會(huì)使得其安裝在標(biāo)準(zhǔn)微孔板的足跡之內(nèi)，其為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的形式。此形式包括但不限于以下陣列3X2反應(yīng)容器，(6反應(yīng)容器)6X4反應(yīng)容器，(12反應(yīng)容器)12X8反應(yīng)容器，(96反應(yīng)容器)24 X 16反應(yīng)容器和(384反應(yīng)容器)48 X 32反應(yīng)容器(1536反應(yīng)容器) 根據(jù)本發(fā)明的重要特征，可每反應(yīng)容器提供至少一個(gè)珀耳帖，和反應(yīng)容器可為微量滴定容器，其也可為該容器的陣列之一，一般3X 2陣列或其整數(shù)倍。熱匯或HRM可包含如描述于PCT專利說(shuō)明書PCT/GB2007/003564的裝置。其可一般包含由金屬如銅形成的板，其中具有與由適當(dāng)?shù)娘L(fēng)扇手段保持在恒定溫度的液體貯器連接的管迷路。HRM可因此形成容器陣列底，在該情況中，用定位銷或垛提供HRM會(huì)是方便的。

現(xiàn)在參照附圖以例方式描述本發(fā)明的一實(shí)施方式圖I是容器經(jīng)TEC安裝在HRM的示意性模式圖；圖2是在HRM上安裝TEC陣列的計(jì)劃視圖；圖3是HRM的示意性模式圖；以及圖4是合并本發(fā)明的閉合回路裝置的示意性模式圖。實(shí)施方式圖I顯示經(jīng)珀耳帖11安裝到HRM 12的反應(yīng)容器10。珀耳帖11包含基板11a，第2板11b，多個(gè)柱Ilc和補(bǔ)給線lid。珀耳帖11用粘合劑13附接容器10和HRM，其厚度由間隔物14控制。補(bǔ)給線Ild經(jīng)過(guò)HRM 12，由此它們被熱導(dǎo)電塑料物質(zhì)15電絕緣。如顯示于圖2，HRM攜帶多個(gè)垛16，其形成安裝珀耳帖11的指引。HRM可替代性地具有一系列壓凹，諸如在圖3中，反應(yīng)容器可合適地安裝于其中。在以上描述的設(shè)備的使用中，用容器中的一些靶生物材料，和保持在50°C量級(jí)的溫度的熱匯，以一個(gè)方向應(yīng)用到TEC的電流將容器之內(nèi)的溫度降低到冷凍以下。此可在特定情況中足以破壞靶材料的細(xì)胞。電流可然后逆轉(zhuǎn)，從而容器內(nèi)的溫度上升到沸騰以上。此循環(huán)循環(huán)性重復(fù)以完成生物材料的細(xì)胞破裂。然后采用PCR以倍增特定細(xì)胞成分用于鑒定。純化過(guò)程可在破裂過(guò)程中實(shí)施，和從事分離需要的細(xì)胞成分，正常情況下為其NA。在顯示的特定例中，拍耳帖11是9mm矩形,及具有締化秘柱11c。補(bǔ)給線Ild是降額的。基于銦的焊劑13用于將珀耳帖11附接到容器10和HRM 12。在另一實(shí)施方式中，容器10不是反應(yīng)容器，像這樣，但是支架，因此，設(shè)置為用于微量滴定反應(yīng)容器的合適的接受。由此，一次性容器的成本可保持低，和標(biāo)準(zhǔn)物該使用的容器。用于此情況的理想的微量滴定反應(yīng)容器是具有高表面體積比，具有7mmX7mm量級(jí)的底和3 5mm的高度，由熱導(dǎo)電塑料物質(zhì)形成的容器。圖3例證HRM塊原理，其中TEC或加熱器和冷卻器元件(3)利用例如軟，柔性的銦焊劑附接于塊(I)?？蔀樗珒?yōu)選是專利非導(dǎo)電介質(zhì)的流體諸如‘流體XP’經(jīng)入口(2)流過(guò)塊，以便遍及塊均衡溫度，因此使得各元件彼此獨(dú)立，也移出過(guò)量熱及允許HRM維持在靶溫度。加熱器冷卻器元件然后圍繞此預(yù)定的溫度熱循環(huán)，以便減少冷凍解凍過(guò)程發(fā)生的時(shí)間和能量需求。圖4例證面對(duì)的由熱/冷方法NA提取的實(shí)施方式，其允許NA提取，純化和隨后擴(kuò)增及在自含有的盒或“生物芯片”中發(fā)生。此實(shí)施方式的優(yōu)勢(shì)是整個(gè)過(guò)程可在閉合的管環(huán)境中實(shí)施，最小化混雜的似然性，及帶來(lái)相當(dāng)?shù)募皶r(shí)保存和消費(fèi)，由于全部步驟可在單儀器和消耗品上實(shí)施。涉及的方法在以下凸顯；I.操作者通過(guò)一旦拭子已插入便液密性的孔口(6)(理想地利用密封劑膜)插入樣品，例如自懷疑患特定疾病的患者取的拭子。系統(tǒng)可適于使用許多不同原材料，例如使用注射器，通過(guò)路-洛二氏擬合或‘固體’材料，通過(guò)有用于系統(tǒng)壓力的適當(dāng)?shù)拿芊獾穆┒奉愋涂卓?。?br> 2.然后利用向反應(yīng)站(5)正置換自室I向含有樣品的密封的隔室沖入緩沖劑，如此進(jìn)行含有懷疑的病原體細(xì)胞的樣品作為液體向反應(yīng)室轉(zhuǎn)移。3.如之前描述于本申請(qǐng)，由反應(yīng)室(5)的重復(fù)的熱循環(huán)介導(dǎo)病原體細(xì)胞的裂解和隨后NA釋放，以輔助裂解的過(guò)程，室I中含有的流體成分可依賴于靶病原體和待實(shí)施的特定測(cè)定而改變。4.在特定實(shí)施方式中，室I中含有的緩沖劑流體可含有特異于靶病原體的磁珠，其由抗體介導(dǎo)的手段或由本領(lǐng)域知道的直接寡核苷酸雜交結(jié)合。對(duì)此步驟的需求依賴于對(duì)于以對(duì)總NA的偏好優(yōu)先捕獲靶NA或確保每種可能的病原體NA分子作為手段分離，以增加隨后分析的靈敏度的需求。5.在使用捕獲用磁珠的實(shí)例中磁場(chǎng)可應(yīng)用于反應(yīng)室(5)，其結(jié)合具有結(jié)合到它們的靶NA的珠。然后由室2中含有的流體重復(fù)漂洗自冷凍/解凍得到的細(xì)胞廢棄物。將自過(guò)程的廢棄物沖入室4，從而全體過(guò)程是自含有的。6.最終步驟旨在利用輕輕加溫自磁珠釋放結(jié)合的核酸，及重懸浮于室3中含有的擴(kuò)增緩沖劑。當(dāng)磁分離不是需要的時(shí)，將液相中的一部分總細(xì)胞NA去除到廢棄物，留下僅旨在與由室3供給的擴(kuò)增組分組合需要的量。室3的內(nèi)容物可構(gòu)成對(duì)于許多生物學(xué)擴(kuò)增流程必需的試劑，以便檢測(cè)靶分子的小初始數(shù)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，此會(huì)是實(shí)時(shí)PCR，其包括添加特異于目標(biāo)病原體的熒光標(biāo)記的引物分子序列。流體室可由許多手段活化 正置換，其中壓縮流體室，將流體擠壓到反應(yīng)室。此方法也包括流體可雙向地動(dòng)的益處，如果漂洗或混合步驟需要及需要更少體積以存儲(chǔ)廢棄物流體。 正壓.以此方式，將空氣通過(guò)封件注入流體室。在盒插入后，和當(dāng)需要的空氣將流體推出室時(shí)由針穿刺此封件。封件應(yīng)設(shè)計(jì)使得當(dāng)盒從儀器除去時(shí)其自封。 負(fù)壓也可使用。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)的性質(zhì)允許隨后利用控制冷凍/解凍過(guò)程而實(shí)施任何熱循環(huán)過(guò)程，諸如PCR過(guò)程的TEC的益處。
權(quán)利要求
1.破裂生物學(xué)細(xì)胞而釋放含有的核酸物質(zhì)的方法，包括 將含有細(xì)胞的容器放置在緊鄰熱電電池的工作表面，其基面緊鄰處于水的冷凍及沸騰溫度之間的基本上恒定溫度的熱源/匯，及 將電流施加到熱電電池以實(shí)質(zhì)上改變物質(zhì)的溫度。
2.權(quán)利要求I的方法，其中第I步驟旨在將其工作面的溫度降低到冷凍，由此在靶細(xì)胞中形成冰晶，然后導(dǎo)致冰解凍。
3.權(quán)利要求I的方法，其中首先將靶細(xì)胞加熱到其沸騰溫度，然后允許樣品冷卻。
4.權(quán)利要求I的方法，其采用熱循環(huán)，所述方法包括交替對(duì)熱電電池逆轉(zhuǎn)電流，其中熱循環(huán)可包括細(xì)胞的沸點(diǎn)和冰點(diǎn)。
5.權(quán)利要求I 4之任一項(xiàng)的方法，其中在冷凍后使物質(zhì)經(jīng)歷大于75°C的溫度。
6.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的方法，其中物質(zhì)暴露于熱休克，由此實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的滲透勢(shì)的變化。
7.權(quán)利要求I的細(xì)胞破裂方法，其包括交替冷凍及加熱細(xì)胞超過(guò)多個(gè)循環(huán)的進(jìn)一步步驟。
8.權(quán)利要求I或權(quán)利要求2的細(xì)胞破裂方法，其包括改變細(xì)胞內(nèi)的滲透壓的進(jìn)一步步 驟。
9.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的方法，其為閉合過(guò)程中的步驟，其中隨后步驟是生物學(xué)或化學(xué)過(guò)程，諸如NA擴(kuò)增過(guò)程。
10.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的方法，其還在前述權(quán)利要求的方法之前包括破裂步驟。
11.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞含于緩沖劑。
12.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的方法，其中熱電電池具有由柱分離的基面和工作面，基面柔性地附接于保持在恒定溫度的熱匯/源，所述方法包括交替逆轉(zhuǎn)TEC中的極性，以使TEC工作面至熱匯溫度以下及以上的溫度。
13.權(quán)利要求12的方法，其中采用電阻性加熱元件以提供另外的加熱能力或構(gòu)成熱源。
14.權(quán)利要求13的方法，其中柱由碲化鉍形成。
15.權(quán)利要求13或權(quán)利要求14的方法，其中TEC具有由降額的線形成的電連接。
16.權(quán)利要求13 15之任一項(xiàng)的方法，其中TEC基板用熱導(dǎo)電柔性的粘合劑附接于熱匯。
17.權(quán)利要求16的方法，其中粘合劑具有大于lW/mK，優(yōu)選超過(guò)10W/mK的熱傳導(dǎo)率。
18.權(quán)利要求16或權(quán)利要求17的方法，其中粘合劑包含軟焊劑。
19.權(quán)利要求18的方法，其中焊劑是基于銦的焊劑。
20.權(quán)利要求18 18之任一項(xiàng)的方法，其中間隔物確保焊劑厚度的一致性。
21.實(shí)施前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的方法的設(shè)備，其包含熱電電池，所述熱電電池具有由柱分離的基面和工作面，基面柔性地附接于設(shè)置在保持在恒定溫度的熱源/匯，其中交替逆轉(zhuǎn)熱電電池中的極性，使TEC工作面至熱匯溫度以下及以上的溫度。
22.權(quán)利要求21的設(shè)備，其中柱由碲化鉍形成。
23.權(quán)利要求21的設(shè)備，其中熱匯包含由金屬如銅形成的板，其中具有與保持在恒定溫度的液體貯器連接的管迷路。
24.權(quán)利要求21 23之任一項(xiàng)的設(shè)備，其中TEC熱電電池具有經(jīng)過(guò)熱匯的連接線，以便由此保持冷卻。
25.權(quán)利要求21 24之任一項(xiàng)的設(shè)備，其中TEC基板用熱導(dǎo)電柔性的粘合劑附接于熱匯。
26.權(quán)利要求21 25之任一項(xiàng)的設(shè)備，其中TEC工作面用熱導(dǎo)電柔性的粘合劑附接于反應(yīng)容器或反應(yīng)容器支架。
27.權(quán)利要求25或權(quán)利要求26的設(shè)備，其中粘合劑具有大于lW/mK，優(yōu)選超過(guò)10W/mK的熱傳導(dǎo)率。
28.權(quán)利要求25 27之任一項(xiàng)的設(shè)備，其中粘合劑包含軟焊劑。
29.權(quán)利要求28的設(shè)備，其中焊劑是基于銦的焊劑。
30.權(quán)利要求25 29之任一項(xiàng)的設(shè)備，其中間隔物確保粘合劑厚度的一致性。
31.權(quán)利要求21 30之任一項(xiàng)的設(shè)備，其中TEC具有由降額的線形成的電連接。
32.權(quán)利要求21 31之任一項(xiàng)的設(shè)備，其包含附接于熱匯的熱電電池陣列。
33.權(quán)利要求21和32的設(shè)備，其中各TEC熱電電池附接于反應(yīng)容器或反應(yīng)容器支架。
34.權(quán)利要求33的設(shè)備，其中反應(yīng)容器支架具有關(guān)聯(lián)的電阻性加熱器。
35.權(quán)利要求21 34之任一項(xiàng)的設(shè)備，其中當(dāng)在n96陣列中使用時(shí)，TEC是小于IOmm矩形。
36.權(quán)利要求34或權(quán)利要求35的設(shè)備，其中反應(yīng)容器具有微量滴定能力。
37.權(quán)利要求21 36之任一項(xiàng)的設(shè)備，其中TEC熱電電池工作面附接于容器支架，其適應(yīng)于合適地接收具有高表面體積比，具有7mmX7mm量級(jí)的底和3 5mm的高度，由熱導(dǎo)電塑料物質(zhì)形成的反應(yīng)容器。
38.用于權(quán)利要求37的設(shè)備的容器，所述容器具有高表面體積比，具有7_X7mm量級(jí)的底和3 5mm的高度，由熱導(dǎo)電塑料物質(zhì)形成。
39.權(quán)利要求21 38之任一項(xiàng)的設(shè)備，其也包含用于實(shí)現(xiàn)其他生物學(xué)過(guò)程的裝置。
40.權(quán)利要求38的設(shè)備，其也包含用于實(shí)現(xiàn)其他生物學(xué)過(guò)程的裝置。
41.基本上如之前參照附圖描述的設(shè)備。
42.基本上如之前參照附圖描述的方法。
全文摘要
破裂生物學(xué)細(xì)胞的方法，其包括使用熱電電池冷凍，沸騰或也許交替冷凍及沸騰含有生物學(xué)細(xì)胞的物質(zhì)，所述熱電電池具有與保持在基本上恒定溫度的熱匯/源連續(xù)的基面和工作面。用于實(shí)施破裂過(guò)程的設(shè)備包含珀耳帖電池，其基面柔性地附接于設(shè)置在保持在約50℃的恒定溫度的熱匯和其工作面與反應(yīng)容器或反應(yīng)容器支架連續(xù)。珀耳帖電池中電壓的反轉(zhuǎn)致使工作面交替達(dá)到冷凍溫度以下及沸騰溫度以上，和/或在容器支架上使用電阻性線用于加熱，TEC純用于冷卻。珀耳帖電池基面由趨向于抑制由在熱下膨脹和收縮所致的珀耳帖電池的解離的物質(zhì)構(gòu)成。
文檔編號(hào)C12N1/06GK102939371SQ201180029257
公開日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2011年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月15日
發(fā)明者N·納扎雷斯, D·艾吉, D·沃德 申請(qǐng)人:Bg研究有限公司