專利名稱：高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白及其制造方法。
背景技術(shù)：
血栓調(diào)節(jié)蛋白作為具有通過與凝血酶特異性結(jié)合來阻斷凝血酶的血液凝固活性并同時顯著促進凝血酶的蛋白質(zhì)C活化能力的作用的物質(zhì)而為人所知，并已知其具有強力的血液凝固阻斷作用。已知其延長基于凝血酶作用的凝固時間、抑制基于凝血酶的血小板聚集。蛋白質(zhì)C為在血液凝固纖溶系統(tǒng)中起到重要作用的維生素K依賴性蛋白質(zhì)，在凝血酶的作用下被活化，成為活化蛋白C。已知該活化蛋白C在生物體內(nèi)使血液凝固系統(tǒng)因子的活性型第V因子以及活性型第VIII因子失活，并且還與具有血栓溶解作用的纖溶酶原激活劑的產(chǎn)生相關(guān)(非專利文獻I)。因此認為，血栓調(diào)節(jié)蛋白利用該凝血酶來促進蛋白質(zhì)C的活化，作為抗血液凝固劑或血栓溶解劑是有用的，另外還有動物實驗報告指出血栓調(diào)節(jié)蛋 白在伴隨凝固亢進的疾病的治療、預(yù)防中是有效(非專利文獻2)。以往，血栓調(diào)節(jié)蛋白是作為在以人為首的各種動物種的血管內(nèi)皮細胞上表達的糖蛋白質(zhì)而被發(fā)現(xiàn)獲得的，其后成功進行克隆化。即，利用基因工程方法，從人肺cDNA文庫中對含有信號肽的人血栓調(diào)節(jié)蛋白前體的基因進行克隆，并且對血栓調(diào)節(jié)蛋白的全基因序列進行解析，明確了含有信號肽(通常示例出18個氨基酸殘基)的575個殘基的氨基酸序列(專利文獻I)。信號肽被切斷的成熟血栓調(diào)節(jié)蛋白由以下5個區(qū)域構(gòu)成從其成熟肽的N末端側(cè)起的N末端區(qū)域(1-226號表示在認可信號肽為18個氨基酸殘基時的位置，下同)、具有6個EGF樣結(jié)構(gòu)的區(qū)域(227-462號)、O型糖鏈增加區(qū)域(463-498號)、膜貫通區(qū)域(499-521號)、以及細胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域(522-557號)，并且作為與全長血栓調(diào)節(jié)蛋白具有相同活性的部分(即最小活性單元)，已知為在具有6個EGF樣結(jié)構(gòu)的區(qū)域之中的主要由從N末端側(cè)起的第4、5、6號EGF樣結(jié)構(gòu)構(gòu)成的部分(非專利文獻3)。全長的血栓調(diào)節(jié)蛋白如果沒有表面活性劑的存在則難以溶解，作為制劑必須添加表面活性劑，與此相對，存在即使在沒有表面活性劑的情況下也能很好地發(fā)生溶解的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白。只要使可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白至少不含有膜貫通區(qū)域的一部分或全部來進行制備即可，例如，僅由N末端區(qū)域、具有6個EGF樣結(jié)構(gòu)的區(qū)域和O型糖鏈增加區(qū)域這3個區(qū)域構(gòu)成(即，由序列編號I的第19 516位氨基酸序列構(gòu)成)的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白可通過應(yīng)用重組技術(shù)來獲得，并且確認到該重組體可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白具有天然的血栓調(diào)節(jié)蛋白的活性(專利文獻I)。此外作為可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的例子也有一些報告(專利文獻2 9)。另外作為天然型也舉出了人尿來源的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白等(專利文獻10、11)。順便提及，在基因中，通過自然的變異或取得時的變異，如多數(shù)情況所確認的那樣，在人中也發(fā)現(xiàn)了多形性變異，上述的由575個殘基的氨基酸序列構(gòu)成的人血栓調(diào)節(jié)蛋白前體的第473位氨基酸為Val的和為Ala的是現(xiàn)在所確認的。在編碼該氨基酸的堿基序列中，分別相當于在第1418位上有T變異和C變異(非專利文獻4)。但是，在活性和物性方面是完全無差異的，可判定兩者實質(zhì)上相同。有報告指出血栓調(diào)節(jié)蛋白在DIC的治療中是有效的(非專利文獻5、6)。作為血栓調(diào)節(jié)蛋白的用途，除了上述以外，還期待其用于例如下述疾病的治療和預(yù)防急性冠狀動脈綜合征(ACS)、血栓癥、末梢血管閉塞癥、閉塞性動脈硬化癥、血管炎、心臟手術(shù)的繼發(fā)性功能性障礙、臟器移植的并發(fā)癥、心絞痛、暫時性腦缺血發(fā)作、妊娠中毒癥、糖尿病、肝V0D(Liver veno-occlusive disease ;急性肝炎和骨髓移植后的肝靜脈閉塞癥)、深部靜脈血栓癥(DVT ；Deep venous thrombosis)等；以及成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS ；Adultrespiratory distress syndrome)。以考慮到在藥品中的應(yīng)用為前提，需要大量地且以更低成本來制造可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，這自不消說，但有文獻指出，來源于制造工序的異種蛋白質(zhì)(例如宿主細胞來源的蛋白質(zhì)、培養(yǎng)基來源的牛血清蛋白、抗體柱來源的小鼠IgG等)具有免疫原性，從安全性方面考慮可能有問題(非專利文獻7)。

考慮到在藥品中的應(yīng)用，作為以工業(yè)水平制造可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的方法,例如已知有采用擔載有針對血栓調(diào)節(jié)蛋白的抗體的親和柱色譜法作為主精制工序的方法；進一步已知有下述高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的制造方法，其為實質(zhì)上不含有血清來源物和抗體來源物的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的制造方法，該制造方法的特征在于，將通過親和色譜法得到的該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白在電導(dǎo)率為25ms/cm 34ms/cm、pH為3 4的條件下與陽離子交換體接觸，在該工序中，以流通級分(素通O畫分)的形式得到該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白(專利文獻12)。還已知有在主精制工序的親和柱色譜法工序之后組合強陰離子交換柱色譜法的精制方法(專利文獻13)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻專利文獻I :日本特開昭64-6219號公報專利文獻2 :日本特開平2-255699號公報專利文獻3 :日本特開平3-133380號公報專利文獻4 :日本特開平3-259084號公報專利文獻5 :日本特開平4-210700號公報專利文獻6 :日本特開平5-213998號公報專利文獻7 W092/00325號公報專利文獻8 W092/03149號公報專利文獻9 W093/15755號公報專利文獻10 :日本特開平3-86900號公報專利文獻11 :日本特開平3-218399號公報專利文獻12 :日本特開平11-341990號公報專利文獻13 W02008/117735 號公報非專利文獻非專利文獻I :鈴木宏治，醫(yī)學(xué)O (醫(yī)學(xué)進展)，第125卷，901頁(1983年)非專利文獻2 K. Gomi 等，Blood 75. 1396-1399 (1990)非專利文獻3 M. Zushi 等，J. Biol. Chem.，246，10351-10353 (1989)
非專利文獻4 D. Z. Wen 等，Biochemistry, 26，4350-4357 (1987)非專利文獻5 S. M. Bates 等，Br. J. Pharmacol.，144，1017-1028 (2005)非專利文獻6 :Η· Saito 等，J. Thromb Haemost, 5 (I), 31 (2007)非專利文獻7:早川堯夫，〃M才醫(yī)薬品O開発i品質(zhì) 安全性確保(生物藥品的開發(fā)與品質(zhì)-安全性確保)，273-274(2007)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明的課題在于提供宿主細胞來源的蛋白質(zhì)濃度比率為相對于10，000U可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白小于IOng的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白及其制造方法。 解決課題的手段在專利文獻13中記載了經(jīng)精制的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白。特別是在該文獻的實施例14中公開了宿主來源的蛋白質(zhì)(以下，在本說明書中也簡稱為“HCP”)的濃度被記為“N.D.”(盡管未明確記載，但認為其意味著“未檢出”)的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白。看到該記載的本領(lǐng)域技術(shù)人員會認為已經(jīng)充分實現(xiàn)了 HCP的混入得以降低的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，也就不會想到試圖降低可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白中的HCP，即試圖降低可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白中HCP的混入的動機等通常是不存在的。但是，本發(fā)明人強烈認識到如下重大問題在將精制的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白作為藥品使用的情況下，若混入有HCP，則其會引起過敏性休克等無法預(yù)料的情況，根據(jù)情況會有致死的風險。如此，由于上述專利文獻13的實施例14中記載為“N. D. ”，因而本領(lǐng)域技術(shù)人員通?？烧J為HCP的混入得到了充分降低，而本發(fā)明人對上述專利文獻13的實施例14所述的經(jīng)過精制的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的HCP濃度進行測定的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然存在定量極限，但所混入的HCP濃度相對于可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白10，000U(如后述的參考例I所述，只要沒有特別限定，“U”意味著表示促進蛋白質(zhì)C活化的作用(下文中也簡稱為APC活性)的單位。下同)顯示出了 70ng 不足SOng的比率，本發(fā)明人首先確認到關(guān)于HCP的降低可能仍有改善的余地。關(guān)于該HCP濃度，本發(fā)明人獨自考慮到，通過在HCP測定中采用在專利文獻13中并無公開的濃縮工序這一新工序，可對濃度進行精確測定。本發(fā)明人首先發(fā)現(xiàn)了上述事實，考慮到將可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白更為安全地作為藥品來進行利用，獲得了可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白中的HCP含量進一步得以降低的經(jīng)精制的血栓調(diào)節(jié)蛋白，從而發(fā)現(xiàn)了使過敏性休克的風險為最小限這一新穎課題。本發(fā)明人為了以工業(yè)水平制造HCP的混入進一步得以降低的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，對新型柱色譜工序的導(dǎo)入進行了研究。即，嘗試了通過在據(jù)認為HCP去除效果最高的親和柱色譜中組合多種柱色譜來降低HCP，但追加柱色譜工序會產(chǎn)生如下問題不僅增加制造的勞力和時間、而且還會降低可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的收率。并且，在親和柱色譜中，即使組合多種柱色譜，也無法獲得將HCP濃度進一步降低至現(xiàn)有水平以上的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白。此外，柱色譜法還具有僅PH或離子強度等稍有變化便會使HCP與可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的分離發(fā)生變化、不能再現(xiàn)所期待的結(jié)果的問題，難以獲得高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白。因此，本發(fā)明人為了找出比柱色譜法操作簡便、不會降低可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的收率、可以工業(yè)水平有效地去除HCP、可獲得HCP的混入進一步得以降低的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的方法進行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過使用尼龍和/或聚醚砜、尤其是尼龍，可以獲得HCP濃度相對于10，000U可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白小于IOng的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，可以解決上述課題，從而完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明可以舉出以下內(nèi)容。〔I〕一種高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其為由轉(zhuǎn)化細胞所產(chǎn)生的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，該轉(zhuǎn)化細胞是將包含編碼可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的堿基序列的DNA轉(zhuǎn)染至宿主細胞而得到的，其中，該宿主細胞來源的蛋白質(zhì)含量比率為相對于10，000U可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白小于IOng0〔1-2〕如上述〔I〕所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中，高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白在總蛋白質(zhì)中的純度為99%以上?！?-3〕上述〔I〕或〔1-2〕所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中，高純度可溶性 血栓調(diào)節(jié)蛋白為水溶液的形態(tài)。〔1-4〕上述〔1-3〕所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中，高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白水溶液中的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白濃度為8mg/mL以上的濃度?！?〕如上述〔I〕 〔1-4〕的任一項所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中，可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白為通過對該轉(zhuǎn)化細胞進行無血清培養(yǎng)而產(chǎn)生的血栓調(diào)節(jié)蛋白。需要說明的是，如上述〔I〕 〔1-4〕那樣進行引用的項編號以范圍來表示，在其范圍內(nèi)配置具有〔1-2〕等分支編號的項的情況下，意味著也引用了具有〔1-2〕等分支編號的項。下同?！?2-2〕如上述〔I〕 〔2〕的任一項所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中在測定該宿主細胞來源的蛋白質(zhì)含量時，通過利用至少包括以下工序的方法進行測定，確認到相對于10，000U可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白小于IOng的宿主細胞來源的蛋白質(zhì)濃度；(a)將包含編碼可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的堿基序列的DNA轉(zhuǎn)染至宿主細胞，對所得到的轉(zhuǎn)化細胞、或其宿主細胞的任意之一進行無血清培養(yǎng)，由所得到的培養(yǎng)上清來制備宿主細胞來源的蛋白質(zhì)的工序；(b)用上述(a)的該宿主細胞來源的蛋白質(zhì)使兔致敏，由所得到的抗血清來精制抗宿主細胞來源蛋白質(zhì)的抗體的工序；構(gòu)建包括下述(Cl) (c6)的測定系統(tǒng)的工序(Cl)使上述(b)的該抗宿主細胞來源蛋白質(zhì)的抗體吸附于固相的工序；(c2-l)使懷疑混入了該宿主細胞來源的蛋白質(zhì)的含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的待檢測溶液與吸附有該抗宿主細胞來源蛋白質(zhì)的抗體的該固相進行接觸的工序、以及使含有濃度已知的宿主細胞來源的蛋白質(zhì)的溶液與吸附有該抗宿主細胞來源蛋白質(zhì)的抗體的該固相進行接觸的工序；(c3)向該固相中添加生物素化的抗宿主細胞來源蛋白質(zhì)的抗體的工序；(c4)向該固相中添加抗生物素蛋白化的過氧化物酶溶液的工序；(c5)添加酶底物溶液進行顯色的工序；以及(c6)停止顯色，對其吸光度進行測定的工序；(d)利用上述測定系統(tǒng)對懷疑混入了該宿主細胞來源的蛋白質(zhì)的含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的待檢測溶液中的宿主細胞來源的蛋白質(zhì)濃度進行測定，判斷該含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的待檢測溶液中的宿主細胞來源的蛋白質(zhì)濃度是否包含在上述測定系統(tǒng)的可定量范圍中的工序，該可定量范圍是通過利用上述測定系統(tǒng)采用含有濃度已知的宿主細胞來源的蛋白質(zhì)的溶液進行測定而預(yù)先確認的；(e-Ι)在上述(d)中，在懷疑混入了該宿主細胞來源的蛋白質(zhì)的含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的待檢測溶液中的宿主細胞來源的蛋白質(zhì)濃度包含在可定量范圍中的情況下，將該濃度作為該宿主細胞來源的蛋白質(zhì)濃度的工序；(e-2-l)在上述(d)中，在懷疑混入 了該宿主細胞來源的蛋白質(zhì)的含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的待檢測溶液中的宿主細胞來源的蛋白質(zhì)濃度未包含在可定量范圍中的情況下，為使其成為包含在上述測定系統(tǒng)的可定量范圍中的可測定濃度，根據(jù)需要對含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的待檢測溶液進行濃縮或稀釋，對該濃縮率或稀釋率進行記錄的工序；(e-2-2)將以上述(cl) (c6)表示的測定系統(tǒng)中的(c2_l)替換為如下所示的(c2-2)，利用該測定系統(tǒng)對在上述(e-2-l)中進行了濃縮或稀釋的含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的待檢測溶液中的宿主細胞來源的蛋白質(zhì)濃度進行測定，考慮濃縮率或稀釋率來求出該宿主細胞來源的蛋白質(zhì)濃度的工序；(c2-2)使根據(jù)需要進行了濃縮或稀釋的含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的待檢測溶液與吸附有該抗宿主細胞來源蛋白質(zhì)的抗體的該固相進行接觸的工序、以及使含有濃度已知的宿主細胞來源的蛋白質(zhì)的溶液與吸附有該抗宿主細胞來源蛋白質(zhì)的抗體的該固相進行接觸的工序；以及(f)另外測定出每單位體積含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的待檢測溶液中的血栓調(diào)節(jié)蛋白的APC活性，計算出(e-Ι)或(e-2-2)中求出的宿主細胞來源的蛋白質(zhì)濃度相對于該APC活性的比率的工序。〔2-3〕如上述〔2-2〕所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中，上述〔2_2〕(a)中的宿主細胞為中國倉鼠卵巢細胞DXBll株?！?〕如上述〔I〕 〔2-3〕的任一項所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中，該宿主細胞為中國倉鼠卵巢細胞。〔4〕如上述〔I〕 〔3〕的任一項所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中，該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白為具有下述(I) (5)的性質(zhì)的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白；(I)與凝血酶選擇性結(jié)合的作用；(2)促進基于凝血酶的蛋白質(zhì)C的活化的作用；(3)延長基于凝血酶的凝固時間的作用；(4)抑制基于凝血酶的血小板聚集的作用；以及(5)抗炎作用。〔4-2〕如上述〔I〕 〔3〕的任一項所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中，該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白為具有下述(I) (4)的性質(zhì)的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白；(I)與凝血酶選擇性結(jié)合的作用；(2)促進基于凝血酶的蛋白質(zhì)C的活化的作用；(3)延長基于凝血酶的凝固時間的作用；以及(4)抑制基于凝血酶的血小板聚集的作用。
〔5〕如上述〔I〕 〔4-2〕的任一項所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中，該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的分子量為50，000至80，000?！?〕如上述〔I〕 〔5〕的任一項所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中，該高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白是通過包括以下工序的方法制造的(a)將包含編碼可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的堿基序列的DNA轉(zhuǎn)染至宿主細胞，獲得轉(zhuǎn)化細胞的工序；(b)培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細胞，獲得含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液的工序；以及(C)使該含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液與尼龍和/或聚醚砜接觸，得到高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的工序,該高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白中，宿主細胞來源的蛋白質(zhì)含量比率為相對于10，000U可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白小于long。 〔7〕如上述〔I〕 〔6〕的任一項所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中，該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白為下述的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白其為含有⑴序列編號9或序列編號11的任一項所記載的氨基酸序列中的第367 480位氨基酸序列、且含有下述(ii-Ι)或(ii-2)的任意氨基酸序列的肽，該肽具有下述⑴ (5)的性質(zhì)，(ii-Ι)序列編號9或序列編號11的任一項所記載的氨基酸序列中的第19 244位氨基酸序列；或(ii-2)上述(ii-Ι)的氨基酸序列中有I個或2個以上的氨基酸發(fā)生取代、缺失、或添加而成的氨基酸序列，(I)與凝血酶選擇性結(jié)合的作用；(2)促進基于凝血酶的蛋白質(zhì)C的活化的作用；(3)延長基于凝血酶的凝固時間的作用；(4)抑制基于凝血酶的血小板聚集的作用；以及(5)抗炎作用。〔7-2〕如上述〔I〕 〔6〕的任一項所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中，該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白為下述可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白其為含有(i)序列編號9或序列編號11的任一項所記載的氨基酸序列中的第367 480位氨基酸序列、且含有下述(ii-Ι)或(ii-2)的任意氨基酸序列的肽，該肽具有下述⑴ ⑷的性質(zhì)；(ii-Ι)序列編號9或序列編號11的任一項所記載的氨基酸序列中的第19 244位氨基酸序列；或(ii-2)上述(ii-Ι)的氨基酸序列中有I個或2個以上的氨基酸發(fā)生取代、缺失、或添加而成的氨基酸序列，(I)與凝血酶選擇性結(jié)合的作用；(2)促進基于凝血酶的蛋白質(zhì)C的活化的作用；(3)延長基于凝血酶的凝固時間的作用；以及(4)抑制基于凝血酶的血小板聚集的作用?！?-3〕如上述〔I〕 〔6〕的任一項所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中，該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白為下述可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白其為含有下述(i-Ι)或(i-2)的任意氨基酸序列、且含有下述(ii-Ι)或(ii-2)的任意氨基酸序列的肽，該肽具有下述(I) (5)的性質(zhì)，(i-Ι)序列編號9或序列編號11的任一項所記載的氨基酸序列中的第367 480位氨基酸序列；或(i-2)上述(i-ι)的氨基酸序列中有I個或2個以上的氨基酸發(fā)生取代、缺失、或添加而成的氨基酸序列，(ii-Ι)序列編號9或序列編號11的任一項所記載的氨基酸序列中的第19 244位氨基酸序列；或(ii-2)上述(ii-Ι)的氨基酸序列中有I個或2個以上的氨基酸發(fā)生取代、缺失、或添加而成的氨基酸序列，(I)與凝血酶選擇性結(jié)合的作用；
(2)促進基于凝血酶的蛋白質(zhì)C的活化的作用；(3)延長基于凝血酶的凝固時間的作用；(4)抑制基于凝血酶的血小板聚集的作用；以及(5)抗炎作用?！?〕如上述〔I〕 〔6〕的任一項所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中，該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白為下述可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白其為具有下述(i-Ι)或(i-2)的任意氨基酸序列的肽，該肽具有下述⑴ (5)的性質(zhì)；(i-Ι)序列編號9或序列編號11的任一項所記載的氨基酸序列中的第19 516位氨基酸序列；或(i-2)上述(i-ι)的氨基酸序列中有I個或2個以上的氨基酸發(fā)生取代、缺失、或添加而成的氨基酸序列，(I)與凝血酶選擇性結(jié)合的作用；(2)促進基于凝血酶的蛋白質(zhì)C的活化的作用；(3)延長基于凝血酶的凝固時間的作用；(4)抑制基于凝血酶的血小板聚集的作用；以及(5)抗炎作用?！?〕如上述〔I〕 〔6〕的任一項所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中，包含編碼該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的堿基序列的DNA為編碼序列編號9或序列編號11的任一項所記載的氨基酸序列的DNA。〔10〕一種藥物組合物，其含有上述〔I〕 〔9〕的任一項所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白和可藥用載體?！?1〕一種制造方法，其是高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的制造方法，所述高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白中，宿主細胞來源的蛋白質(zhì)含量比率為相對于10，000U可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白小于long，其中，該方法包括下述工序?qū)幋a可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的堿基序列的DNA轉(zhuǎn)染至宿主細胞，得到轉(zhuǎn)化細胞，使該轉(zhuǎn)化細胞產(chǎn)生的含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液與尼龍和/或聚醚砜接觸?！?2〕如上述〔11〕所述的制造方法，其中，可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白是通過對該轉(zhuǎn)化細胞進行無血清培養(yǎng)而產(chǎn)生的。
〔13〕如上述〔11〕或〔12〕所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的制造方法，其中，該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白為具有下述(I) (5)的性質(zhì)的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白(I)與凝血酶選擇性結(jié)合的作用；(2)促進基于凝血酶的蛋白質(zhì)C的活化的作用；(3)延長基于凝血酶的凝固時間的作用；(4)抑制基于凝血酶的血小板聚集的作用；以及(5)抗炎作用?！?4〕如上述〔11〕 〔13〕的任一項所述的制造方法，其中，該宿主細胞為中國倉鼠 卵巢細胞?！?15〕如上述〔11〕 〔14〕的任一項所述的制造方法，其中，該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的分子量為50，000至80，000?！?16〕如上述〔11〕 〔15〕的任一項所述的制造方法，其中，該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白為下述可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白其為含有(i)序列編號9或序列編號11的任一項所記載的氨基酸序列中的第367 480位氨基酸序列、且含有下述(ii-Ι)或(ii-2)的任意氨基酸序列的肽，該肽具有下述⑴ (5)的性質(zhì)；(ii-Ι)序列編號9或序列編號11的任一項所記載的氨基酸序列中的第19 244位氨基酸序列；或(ii-2)上述(ii-Ι)的氨基酸序列中有I個或2個以上的氨基酸發(fā)生取代、缺失、或添加而成的氨基酸序列，(I)與凝血酶選擇性結(jié)合的作用；(2)促進基于凝血酶的蛋白質(zhì)C的活化的作用；(3)延長基于凝血酶的凝固時間的作用；(4)抑制基于凝血酶的血小板聚集的作用；以及(5)抗炎作用。〔17〕如上述〔11〕 〔15〕的任一項所述的制造方法，其中，該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白為下述可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白其為具有下述(i-Ι)或(i-2)的任意氨基酸序列的肽，該肽具有下述⑴ (5)的性質(zhì)，(i-Ι)序列編號9或序列編號11的任一項所記載的氨基酸序列中的第19 516位氨基酸序列；(i-2)上述(i-Ι)的氨基酸序列中有I個或2個以上的氨基酸發(fā)生取代、缺失、或添加而成的氨基酸序列，(I)與凝血酶選擇性結(jié)合的作用；(2)促進基于凝血酶的蛋白質(zhì)C的活化的作用；(3)延長基于凝血酶的凝固時間的作用；(4)抑制基于凝血酶的血小板聚集的作用；以及(5)抗炎作用?！?8〕如上述〔11〕 〔15〕的任一項所述的制造方法，其中，包含編碼該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的堿基序列的DNA為編碼序列編號9或序列編號11所記載的氨基酸序列的DNA。
〔19〕如上述〔11〕 〔18〕的任一項所述的制造方法，其中，尼龍和/或聚醚砜的形態(tài)為過濾膜的形態(tài)?！?0〕如上述〔19〕所述的制造方法，其中，過濾膜的膜面積相對于Img宿主細胞來源蛋白質(zhì)為O. Olm2至O. 5m2。(21)如上述〔11〕 〔20〕的任一項所述的制造方法，其中，尼龍和/或聚醚砜為尼龍?！?2〕一種制造方法，其為上述〔11〕 〔20〕所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的制造方法，該方法具有〔1-2〕 〔I 4〕、〔2-2〕、〔2-3〕、〔7-2〕、或〔7-3〕的任一項所述的特征?！?3〕如上述〔11〕 〔22〕的任一項所述的制造方法，其為高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的制造方法，所述高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白中，宿主細胞來源的蛋白質(zhì)含量比率為相對于10，000U可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白小于10ng，該方法包括下述工序 (a)將編碼序列編號9或序列編號11所記載的氨基酸序列的DNA轉(zhuǎn)染至宿主細胞，獲得轉(zhuǎn)化細胞的工序；(b)培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細胞，獲得含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液的工序；(C)將該含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液精制至總蛋白質(zhì)中的血栓調(diào)節(jié)蛋白純度為99%以上的工序；以及(d)使該含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液與尼龍接觸，將高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白分離的工序，該高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白中，宿主細胞來源的蛋白質(zhì)含量比率為相對于10，000U可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白小于10ng，所述宿主細胞為中國倉鼠卵巢細胞?！?24〕一種高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其是通過上述〔23〕所記載的方法進行制造的?！?5〕一種方法，其為去除可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白中的宿主細胞來源的蛋白質(zhì)的方法，該方法包括下述工序?qū)幋a可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的堿基序列的DNA轉(zhuǎn)染至宿主細胞，得到轉(zhuǎn)化細胞，使該轉(zhuǎn)化細胞產(chǎn)生的含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液與尼龍和/或聚醚砜接觸?！?26〕如上述〔25〕所記載的方法，其為去除可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白中的宿主細胞來源的蛋白質(zhì)的方法，該方法包括下述工序(a)將編碼序列編號9或序列編號11所記載的氨基酸序列的DNA轉(zhuǎn)染至宿主細胞，獲得轉(zhuǎn)化細胞的工序；(b)培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細胞，獲得含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液的工序；(C)將該含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液精制至總蛋白質(zhì)中的血栓調(diào)節(jié)蛋白純度為99%以上的工序；以及(d)使該含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液與尼龍接觸的工序，所述宿主細胞為中國倉鼠卵巢細胞?！?27〕一種方法，其為上述〔25〕所述的去除可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白中的宿主細胞來源的蛋白質(zhì)的方法，該方法具有上述〔I〕 〔9〕的任一項所述的特征。發(fā)明的效果
通過采用本發(fā)明的制造方法，能夠獲得宿主細胞來源的蛋白質(zhì)含量比率為相對于10, 000U可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白小于IOng的、宿主細胞來源的蛋白質(zhì)的混入得到了降低的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白。由此，能夠降低將可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白作為藥品利用時的過敏性休克的風險。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的一些優(yōu)選方式(用于實施本發(fā)明的優(yōu)選方式以下，在本說明書中也簡稱為“實施方式”)進行具體說明，但本發(fā)明的范圍并不限于下述說明的特定方式。本實施方式的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白可以作為藥物原料進行使用。也可將本實施方式的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白與其它可藥用載體組合作為藥品使用。另外，本實施方式的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白可以以實質(zhì)上不含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白以外的物質(zhì)的、含有高純度的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的藥物組合物的形式來進行使用。也可以以本實施方式的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白與其它可藥用載體組合而成的藥物 組合物的形式使用。在下文中，有時包括高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的藥物原料稱為高純度血栓調(diào)節(jié)蛋白。另外，有時包括實質(zhì)上不含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白以外的物質(zhì)的含有高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白藥物組合物稱為高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白。對于本實施方式中的血栓調(diào)節(jié)蛋白，已知其具有(I)與凝血酶選擇性結(jié)合、(2)促進基于凝血酶的蛋白質(zhì)C的活化的作用。并且優(yōu)選通常認可其具有(3)延長基于凝血酶的凝固時間的作用、(4)抑制基于凝血酶的血小板聚集的作用、和/或(5)抗炎作用。將這些血栓調(diào)節(jié)蛋白所具有的作用稱為血栓調(diào)節(jié)蛋白活性。作為血栓調(diào)節(jié)蛋白活性，優(yōu)選具有上述(I)和(2)的作用、進一步具有上述(I)
(4)的作用。并且，作為血栓調(diào)節(jié)蛋白活性，更優(yōu)選具備(I) (5)的全部作用。血栓調(diào)節(jié)蛋白與凝血酶的結(jié)合作用例如可以利用以Thrombosis andHaemostasisl993 70(3) :418-422為代表的各種公知文獻中所記載的試驗方法來進行確認。促進基于凝血酶的蛋白質(zhì)C的活化的作用例如可以利用以日本特開昭64-6219號公報為代表的各種公知文獻中所明確記載的試驗方法容易地對促進蛋白質(zhì)C活化的作用的活性量或其有無進行確認。另外，也可以同樣容易地對延長基于凝血酶的凝固時間的作用和/或抑制基于凝血酶的血小板聚集的作用進行確認。進一步地，對于抗炎作用，也可以利用例如以blood 2008112 :3361-3670,The Journal of Clinical Investigation 20051155 1267-1274為代表的各種公知文獻中所記載的試驗方法進行確認。作為可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，可以舉出在沒有表面活性劑的存在下可溶于水的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白作為示例。作為可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白溶解性的優(yōu)選示例，可以示例出在水、例如注射用蒸餾水(在不存在TritonX-100或聚多卡醇等表面活性劑的條件下、通常在中性附近)中為lmg/ml以上、或者為10mg/ml以上，優(yōu)選為15mg/ml以上、或者為17mg/ml以上，進一步優(yōu)選為20mg/ml以上、25mg/ml以上、或者30mg/ml以上,特別可以優(yōu)選舉出為60mg/ml以上,根據(jù)情況,分別可以舉出80mg/ml以上、或者100mg/ml以上。在對可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白是否可溶解進行判斷時，可以理解為，在溶解之后，例如在白色光源的正下方，在約lOOOlux亮度的位置，利用肉眼進行觀察的情況下為澄清，以不含有可明顯確認程度的不溶性物質(zhì)作為直接指標的狀況。另外，也可進行過濾來確認殘渣的有無。對于可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，只要如上所述具有血栓調(diào)節(jié)蛋白活性、為可溶性的，則其分子量并無限定，作為分子量的上限，優(yōu)選為100,000以下、更優(yōu)選為90，000以下、進一步優(yōu)選為80，000以下、特別優(yōu)選為70，000以下，作為分子量的下限，進一步優(yōu)選為50，000以上、特別優(yōu)選為60，000以上?？扇苄匝ㄕ{(diào)節(jié)蛋白的分子量可利用測定蛋白質(zhì)分子量的通常方法來容易地進行測定，但優(yōu)選通過質(zhì)量分析法進行測定，更優(yōu)選MALDI-T0F-MS法。為了獲得目的范圍分子量的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，如后所述，將編碼可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的DNA利用載體轉(zhuǎn)染至宿主細胞中，通過對所制備的轉(zhuǎn)化細胞進行培養(yǎng)來獲得可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，利用柱色譜法等對所得到的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白進行分級，由此能夠獲得目的范圍分子量的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白。作為可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，優(yōu)選包含下述氨基酸序列，該氨基酸序列為人型血栓調(diào)節(jié)蛋白中序列編號I的第19 132位氨基酸序列以及序列編號9或序列編號11的第 19 244位氨基酸序列或該氨基酸序列中的一個或2個以上的氨基酸可以發(fā)生取代、缺失、添加的氨基酸序列。該序列編號I的第19 132位氨基酸序列為與血栓調(diào)節(jié)蛋白活性中的促進基于凝血酶的蛋白質(zhì)C的活化的作用相關(guān)的序列。另一方面，序列編號9或序列編號11的第19 244位氨基酸序列為與血栓調(diào)節(jié)蛋白活性中的抗炎作用相關(guān)的序列。對于可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白來說，只要作為可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白整體具有血栓調(diào)節(jié)蛋白活性，則該序列編號I的第19 132位氨基酸序列也可以自然或人工變異，即，序列編號I的第19 132位氨基酸序列中的一個或2個以上的氨基酸可以發(fā)生取代、缺失、添加。只要具有血栓調(diào)節(jié)蛋白活性，則對所容許的變異程度沒有特別限定，例如作為氨基酸序列可示例出50%以上的同源性、優(yōu)選70%以上的同源性、更優(yōu)選80%以上的同源性、進一步優(yōu)選90%以上的同源性、特別優(yōu)選95%以上的同源性、最優(yōu)選98%以上的同源性。將這樣的氨基酸序列中的一個或2個以上的氨基酸發(fā)生取代、缺失、添加的氨基酸序列稱為相同變異序列。對于這些變異，如后所述，只要采用通常的基因操作技術(shù)即可容易地獲得。對于可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，只要具有上述序列、作為可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白整體至少具有與凝血酶選擇性結(jié)合、促進基于凝血酶的蛋白質(zhì)C的活化的作用，就沒有特別限定，優(yōu)選同時具有抗炎作用。序列編號3的序列是序列編號I的序列的第125位氨基酸Val變異為Ala的序列，作為本實施方式中的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，優(yōu)選還包含序列編號3的第19 132位氨基酸序列。作為這樣的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，只要至少具有序列編號I或序列編號3的第19 132位序列或它們的相同變異序列以及序列編號9或序列編號11的第19 244位序列或它們的相同變異序列、作為可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白整體至少具有與凝血酶選擇性結(jié)合并促進基于凝血酶的蛋白質(zhì)C活化的作用，就沒有特別限定，可以舉出由序列編號I或序列編號3中的第19 132位或第17 132位序列構(gòu)成的肽、或者由上述序列的相同變異序列以及序列編號9或序列編號11的第19 244位序列或它們的相同變異序列構(gòu)成且作為可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白整體至少具有血栓調(diào)節(jié)蛋白活性的肽作為優(yōu)選的實例，更優(yōu)選由序列編號I或者序列編號3的第19 132位序列以及序列編號9或序列編號11的第19 244位序列或它們的相同變異序列構(gòu)成的肽。另外，也存在更優(yōu)選由在序列編號I或序列編號3中的第19 132位或第17 132位的相同變異序列以及序列編號9或序列編號11的第19 244位序列或它們的相同變異序列構(gòu)成且作為可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白整體至少具有血栓調(diào)節(jié)蛋白活性的肽的其它方式?？扇苄匝ㄕ{(diào)節(jié)蛋白優(yōu)選作為可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白整體同時具有抗炎作用。另外，作為可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的其它方式，優(yōu)選包含序列編號5的第19 480位氨基酸序列，只要包含序列編號5的第19 480位氨基酸序列就沒有特別限定。該序列編號5的第19 480位氨基酸序列只要具有血栓調(diào)節(jié)蛋白活性也可以為其相同變異序列。
序列編號7的序列是序列編號5的序列的第473位氨基酸Val變異為Ala的序列，作為本實施方式中的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，也優(yōu)選包含序列編號7的第19 480位氨基酸序列。如此，作為可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，只要是包含至少具有序列編號5或者序列編號7的第19 480位序列或它們的相同變異序列、至少具有血栓調(diào)節(jié)蛋白活性的肽序列，就沒有特別限定，可以舉出由序列編號5或序列編號7各自的第19 480位或第17 480位序列構(gòu)成的肽、或者由上述序列的相同變異序列構(gòu)成且至少具有血栓調(diào)節(jié)蛋白活性的肽作為優(yōu)選的實例，更優(yōu)選由序列編號5或者序列編號7的第19 480位序列構(gòu)成的肽。另外，也存在更優(yōu)選由序列編號5或序列編號7各自的第19 480位或第17 480位的相同變異序列構(gòu)成且至少具有血栓調(diào)節(jié)蛋白活性的肽的其它方式?？扇苄匝ㄕ{(diào)節(jié)蛋白優(yōu)選同時具有抗炎作用。另外，作為可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白特別優(yōu)選的其它方式，優(yōu)選包含序列編號9的第19 515位氨基酸序列，只要包含序列編號9的第19 515位氨基酸序列就沒有特別限定。該序列編號9的第19 515位氨基酸序列只要具有血栓調(diào)節(jié)蛋白活性，也可以是其相同變異序列。序列編號11的序列是序列編號9的序列的第473位氨基酸Val變異為Ala的序列，作為本實施方式中的血栓調(diào)節(jié)蛋白，優(yōu)選也包含序列編號11的第19 515位氨基酸序列。作為這樣的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，只要是包含至少具有序列編號9或者序列編號11的第19 515位序列或它們的相同變異序列、至少具有血栓調(diào)節(jié)蛋白活性的肽序列，就沒有特別限定，可以舉出由序列編號9或序列編號11各自的第19 516位、第19 515位、第19 514位、第17 516位、第17 515位、或者第17 514位的序列構(gòu)成的肽、或者由上述序列的相同變異序列構(gòu)成且至少具有血栓調(diào)節(jié)蛋白活性的肽作為更優(yōu)選的實例，特別優(yōu)選由序列編號9中的第19 516位、第19 515位、第19 514位、第17 516位、第17 515位、或第17 514位的序列構(gòu)成的肽。也可以舉出這些的混合物作為優(yōu)選的實例。另外，也有特別優(yōu)選由序列編號11各自的第19 516位、第19 515位、第19 514位、第17 516位、第17 515位、或第17 514位序列構(gòu)成的肽的其它方式。也可以舉出這些的混合物作為優(yōu)選的實例。進一步地也可以舉出由它們的相同變異序列構(gòu)成且至少具有血栓調(diào)節(jié)蛋白活性的肽作為優(yōu)選的實例?？扇苄匝ㄕ{(diào)節(jié)蛋白優(yōu)選同時具有抗炎作用。對于所謂具有相同變異序列的肽，如上所述，其也意味著作為對象的肽的氨基酸序列中有I個以上、即I個或2個以上的氨基酸、進一步優(yōu)選多個(例如I至20個、優(yōu)選I至10個、更優(yōu)選I至5個、特別優(yōu)選I至3個)氨基酸可以發(fā)生取代、缺失、添加的肽。只要具有血栓調(diào)節(jié)蛋白活性，對于容許變異的程度就沒有特別限定，例如作為氨基酸序列可示例出50%以上的同源性，優(yōu)選70%以上的同源性、更優(yōu)選80%以上的同源性、進一步優(yōu)選90%以上的同源性、特別優(yōu)選95%以上的同源性，最優(yōu)選98%以上的同源性。進一步地，作為可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，還可以舉出日本特開昭64-6219號公報中的由序列編號14的序列(462個氨基酸殘基)構(gòu)成的肽、由序列編號8的序列(272個氨基酸殘基)構(gòu)成的肽、或者由序列編號6的序列(236個氨基酸殘基)構(gòu)成的肽作為優(yōu)選的實例。作為可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，只要是至少具有序列編號I或序列編號3的第19 132位氨基酸序列以及序列編號9或序列編號11的第19 244位序列或者它們的相同變異序列、作為可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白整體至少具有血栓調(diào)節(jié)蛋白活性的肽，就沒有特別限定，其中優(yōu)選為至少具有序列編號5或序列編號7的第19 480位氨基酸序列的肽，更優(yōu)選為至少具有序列編號9或序列編號11的第19 515位氨基酸序 列的肽。作為至少具有序列編號9或序列編號11的第19 515位氨基酸序列的肽，可以舉出由序列編號9或序列編號11各自的第19 516位、第19 515位、第19 514位、第17 516位、第17 515位、或第17 514位的序列構(gòu)成的肽作為更優(yōu)選的實例。另外，也可以舉出由序列編號9或序列編號11各自的第19 516位、第19 515位、第19 514位、第17 516位、第17 515位、或者第17 514位序列構(gòu)成的肽的、序列編號9或者序列編號11各自的混合物作為更優(yōu)選的實例。在上述混合物的情況下，作為從序列編號9或序列編號11各自的第17位開始的肽與從第19位開始的肽的混合比率，可示例出(30 70) (50 :50)，可以舉出(35 65) (45 55)作為優(yōu)選的實例。另外，作為在序列編號9或序列編號11各自的第514位、第515位以及第516位終止的肽的混合比率，可示例出(O 0 :100) (O 90 :10)，根據(jù)情況可示例出(O 70 30) (10 90 0)、(10 0 90) (20 10 70)。這些肽的混合比率可以通過通常的方法求出。需要說明的是，序列編號I的第19 132位的序列相當于序列編號9的第367 480位的序列，序列編號5的第19 480位的序列相當于序列編號9的第19 480位的序列。此外，序列編號3的第19 132位的序列相當于序列編號11的第367 480位的序列，序列編號7的第19 480位的序列相當于序列編號11的第19 480位的序列。進一步地，序列編號1、3、5、7、9以及11各自的第I 18位的序列是完全相同的序列。對于這些可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，如后所述，例如可以通過下述轉(zhuǎn)化細胞來獲得，該轉(zhuǎn)化細胞是利用載體將編碼這些肽的DNA (具體地說，為具有序列編號10的第I 732位的堿基序列和序列編號2的第55 396位的堿基序列的堿基序列；具有序列編號10的第I 732位的堿基序列和序列編號4的第55 396位的堿基序列的堿基序列；序列編號6、序列編號8、序列編號10、或序列編號12等的堿基序列)轉(zhuǎn)染至宿主細胞而制備的。另外，這些肽只要具有上述氨基酸序列即可，其可以具有糖鏈或者也可不具有糖鏈，在這點上沒有特別限定。另外，在基因操作中，根據(jù)所使用的宿主細胞種類的不同，糖鏈的種類、加成位置及加成程度是不同的，它們均可使用。對于糖鏈的結(jié)合位置和種類，已知有日本特開平11-341990號公報所記載的事實，對于本實施方式中的血栓調(diào)節(jié)蛋白，也存在有在同樣的位置加成同樣的糖鏈的情況。在本實施方式的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白中，結(jié)合有巖藻糖基二天線型(7 -7 f f丨」一型)與巖藻糖基三天線型(7 - >卜
U 7 f U—型)這兩種N結(jié)合型糖鏈，其比率可示例為(100:0) (60:40)，優(yōu)選為(95 5) (60 :40)，可以舉出(90 10) (70 30)作為更優(yōu)選的實例。這些糖鏈的比率可通過生物化學(xué)實驗法23糖蛋白質(zhì)糖鏈研究法、學(xué)會出版中心(生物化學(xué)実験法23糖蛋白質(zhì)糖鎖研究法、學(xué)會出版力>>一)(1990年)等中記載的2維糖鏈圖譜進行測定。進一步地，若對本實施方式的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的糖組成進行研究，則檢測出中性糖、氨基糖和唾液酸，相對于蛋白質(zhì)含量，可舉出各自獨立地以重量比計為I 30%的比率，優(yōu)選2 20%，更優(yōu)選5 10%。這些糖含量可通過新生化學(xué)實驗講座3糖質(zhì)I糖蛋白質(zhì)(上)、東京化學(xué)同人(新生化學(xué)実験講座3糖質(zhì)I糖夕 々質(zhì)(上)、東京化學(xué)同人)(1990年)中所記載的方法(中性糖苯酚-硫酸法、氨基糖艾爾遜-莫根法、唾液酸高碘酸-間苯二酚法)來進行測定。 在通過基因操作來獲得可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的情況下，作為在表達時可以使用的信號序列，可以使用上述的編碼序列編號9的第I 18位氨基酸序列的堿基序列、編碼序列編號9的第I 16位氨基酸序列的堿基序列、其他公知的信號序列、例如人組織型纖溶酶原激活劑的信號序列(國際公開88/9811號公報)。將編碼可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的DNA序列導(dǎo)入至宿主細胞中的情況下，可以優(yōu)選舉出將編碼可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的DNA序列重組到載體(特別優(yōu)選可在動物細胞中表達的表達載體)中來進行導(dǎo)入的方法。所謂表達載體為由啟動子序列、對mRNA賦予核糖體結(jié)合位點的序列、編碼要表達的蛋白的DNA序列、剪接信號、轉(zhuǎn)錄終止的終止子序列、復(fù)制起始序列等構(gòu)成的DNA分子,作為優(yōu)選的動物細胞表達載體的例子,可以舉出R. C. Mulligan等[Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78. 2072 (1981)]報告的 pSV2_X、P. M. Howley 等[Method inEmzymology, 101, 387, Academic Press (1983)]報告的 pBP69T (69-6)等。另外，也有重組到可在微生物中表達的表達載體中的其它優(yōu)選方式。作為能夠在制造這些肽時使用的宿主細胞，可以舉出動物細胞。作為動物細胞，可以舉出中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、C0S-1細胞、C0S-7細胞、VERO(ATCC CCL-81)細胞、BHK細胞、犬腎來源的MDCK細胞、倉鼠AV-12-664細胞、NSO細胞等，作為人源細胞可以舉出HeLa細胞、WI38細胞、人293細胞、PER. C6細胞。CHO細胞極為普遍而優(yōu)選，在CHO細胞中，進一步優(yōu)選二氫葉酸還原酶(DHFR)缺損CHO細胞。此外，在基因操作的過程和肽的制造過程中，還多使用大腸桿菌等微生物，優(yōu)選使用適于各微生物的宿主-載體體系，在上述的宿主細胞中，也可以選擇適宜的載體體系。用于基因重組技術(shù)的血栓調(diào)節(jié)蛋白的基因已被克隆化，并且已公開了使用血栓調(diào)節(jié)蛋白的基因重組技術(shù)的制造例，此外還已知用于得到其精制品的精制方法[日本特開昭64-6219號公報、日本特開平2-255699號公報、日本特開平5-213998號公報、日本特開平5-310787號公報、H 本特開平 7-155176 號公報、J. Biol. Chem.，264 10351-10353 (1989)]。因此，本實施方式中所用的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白可通過使用上述報告中記載的方法或以這些報告所記載的方法為基準來進行制造。例如，在日本特開昭64-6219號公報中，公開了包含質(zhì)粒PSV2血栓調(diào)節(jié)蛋白J2的大腸桿菌K-12菌株DH5 (ATCC保藏編號67283號)，該質(zhì)粒pSV2血栓調(diào)節(jié)蛋白J2包含編碼全長血栓調(diào)節(jié)蛋白的DNA。另外，還可以使用將該菌株再次保藏于生命研(現(xiàn)獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心)的菌株(大腸桿菌DH5/PSV2TM J2) (FERMBP-5570)?？梢砸栽摼幋a全長血栓調(diào)節(jié)蛋白的DNA作為原料，通過公知的基因操作技術(shù)來制備本實施方式的血栓調(diào)節(jié)蛋白?？扇苄匝ㄕ{(diào)節(jié)蛋白可以采用現(xiàn)有公知的方法或基于這些方法來進行制備，例如可以參考上述山本等人的方法[日本特開昭64-6219號公報]、或者日本特開平5-213998號公報。即，通過基因操作技術(shù)將人源可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白基因制成例如編碼序列編號9的氨基酸序列的DNA，進而在必要時也可進行改變。作為該改變，例如，為了制成編碼序列編號11的氨基酸序列的DNA (具體地說，由序列編號12的堿基序列構(gòu)成)，對于編碼序列編號
9的氨基酸序列的第473位氨基酸的密碼子(特別是第1418位的堿基)，按照Methods inEnzymology, 100 :468(1983年),Academic Press所記載的方法進行位點特異性突變。例如，可以使用具有序列編號13所示堿基序列的變異用合成DNA來制成將序列編號10的第 1418位的堿基T轉(zhuǎn)換成堿基C的DNA?？梢詫⑷绱酥苽涞腄NA重組到例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中，制成轉(zhuǎn)化細胞，進行適宜選擇，利用公知的方法由對該細胞進行培養(yǎng)所得到的培養(yǎng)液中制造出經(jīng)精制的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白。如上所述，優(yōu)選將編碼序列編號9的氨基酸序列的DNA(序列編號10)轉(zhuǎn)染到上述宿主細胞中。在對上述轉(zhuǎn)化細胞進行培養(yǎng)時，可以使用通常用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，優(yōu)選通過事先利用各種培養(yǎng)基對該轉(zhuǎn)化細胞進行培養(yǎng)來選擇最佳的培養(yǎng)基。例如，可以使用將MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、199培養(yǎng)基等公知的培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基并進一步進行改良或添加各種培養(yǎng)基用的添加物而得到的培養(yǎng)基。作為培養(yǎng)方法，可以舉出利用添加有血清的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)的血清培養(yǎng)、或者利用不添加血清的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)。培養(yǎng)方法并無特別限定，但優(yōu)選無血清培養(yǎng)。在血清培養(yǎng)中，在向培養(yǎng)基中添加血清的情況下，優(yōu)選牛血清。牛血清中有胎牛血清、新生小牛血清、小牛血清、成牛血清等,只要適于細胞培養(yǎng),可以使用任何一種。另一方面，在無血清培養(yǎng)中，所使用的無血清培養(yǎng)基可以使用市售的培養(yǎng)基。適于各種細胞的無血清培養(yǎng)基有市售品，例如對于CHO細胞，有Invitrogen社在售的⑶-CH0、CHO-S-SFMII,CHO-III-PFM，有 Irvine Scientific 社在售的 IS CHO、ISCHO-CD 培養(yǎng)基等。這些培養(yǎng)基可以直接使用、進行改良或者添加添加物進行使用。另外，作為無血清培養(yǎng)基，可示例出分別按5mg/L添加胰島素、鐵傳遞蛋白以及亞硒酸的DMEM培養(yǎng)基。如此，只要為可產(chǎn)生本實施方式的血栓調(diào)節(jié)蛋白的培養(yǎng)基，就沒有特別限定。培養(yǎng)方法沒有特別限定，可以為分批培養(yǎng)、反復(fù)分批培養(yǎng)、補料分批培養(yǎng)、灌流培養(yǎng)等培養(yǎng)法。利用上述細胞培養(yǎng)方法來制造可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的情況下，有時可以通過蛋白質(zhì)的翻譯后修飾來確認N末端氨基酸的多樣性。例如，序列編號9中的第17位、18位、19位、或者22位的氨基酸有時會成為N末端。另外,例如有時也將第22位的谷氨酸轉(zhuǎn)換為焦谷氨酸來進行N末端氨基酸的修飾。優(yōu)選第17位或19位的氨基酸為N末端，更優(yōu)選第19位的氨基酸為N末端。另外，也存在優(yōu)選第17位的氨基酸為N末端的其它方式。關(guān)于以上的修飾和多樣性等，針對序列編號11也可以舉出同樣的示例。
進一步地，在使用具有序列編號10的堿基序列的DNA來制造可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的情況下，有時會確認到C末端氨基酸的多樣性，有時會制造出短I個氨基酸殘基的肽。即，存在有第515位的氨基酸為C末端、進而該第515位被酰胺化這樣的C末端氨基酸被修飾的情況。另外，也有會制造出短2個氨基酸殘基的肽的情況。即，存在有第514位的氨基酸為C末端的情況。因而，有時會制造出N末端氨基酸與C末端氨基酸富于多樣性的肽或者它們的混合物。優(yōu)選第515位的氨基酸或第516位的氨基酸為C末端、更優(yōu)選第516位的氨基酸為C末端。并且也存在優(yōu)選第514位的氨基酸為C末端的其它方式。關(guān)于以上的修飾和多樣性等，對于具有序列編號12的堿基序列的DNA也是同樣的。利用上述方法得到的血栓調(diào)節(jié)蛋白有時是確認到了 N末端和C末端的多樣性的肽的混合物。具體地說，可以舉出由序列編號9中的第19 516位、第19 515位、第19 514位、第17 516位、第17 515位、或者第17 514位的序列構(gòu)成的肽的混合物。根據(jù)本發(fā)明，能夠提供HCP的混入得到降低的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白。作為本實施方式的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，可以舉出實質(zhì)上不含有可溶性血 栓調(diào)節(jié)蛋白以外的蛋白質(zhì)的高純度的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白。具體地說，可以舉出例如實質(zhì)上不含有HCP的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白。優(yōu)選可以舉出實質(zhì)上不含有HCP、小鼠IgG以及牛血清蛋白質(zhì)的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白。本實施方式的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白不含有人來源的蛋白質(zhì)。對于HCP的含量，只要為實質(zhì)上不含有HCP的狀態(tài)就沒有特別限定，優(yōu)選相對于可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白10，000U為HCP小于IOng的比率，更優(yōu)選小于8ng的比率、進一步優(yōu)選小于7ng的比率、特別優(yōu)選小于6ng的比率、更特別優(yōu)選小于5ng的比率。本實施方式的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白是利用轉(zhuǎn)化細胞產(chǎn)生的，該轉(zhuǎn)化細胞通過將包含編碼可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的堿基序列的DNA轉(zhuǎn)染至宿主細胞而得到，據(jù)考慮，無論怎樣精制，實際上也會有痕量程度HCP的混入。HCP的含量越低越優(yōu)選，例如作為HCP含量的下限，可示例出相對于可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白10，000U, HCP為O. OOlng的比率。對于小鼠IgG的含量，只要為實質(zhì)上不含有小鼠IgG的狀態(tài)就沒有特別限定，優(yōu)選相對于可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白10，000U,小鼠IgG為小于IOng的比率，更優(yōu)選為小于2ng的比率、進一步優(yōu)選為小于O. 6ng的比率。對于牛血清蛋白質(zhì)的含量，只要為實質(zhì)上不含有牛血清蛋白質(zhì)的狀態(tài)就沒有特別限定，優(yōu)選相對于可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白10，000U為小于IOng的比率、更優(yōu)選為小于2ng的比率、進一步優(yōu)選為小于O. 6ng的比率。這些蛋白質(zhì)濃度優(yōu)選通過ELISA法進行測定，可以參考生物化學(xué)實驗法11酶聯(lián)免疫分析東京化學(xué)同人(生化學(xué)実験法11 - > Λ 4 Λ 77 ^東京化學(xué)同人)(1992年)等來進行測定。另外，在本實施方式的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白中，作為總蛋白質(zhì)中的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白純度，優(yōu)選在HPLC法中為99%以上、更優(yōu)選為99.5%以上、進一步優(yōu)選為99. 7%以上、特別優(yōu)選為99. 9%以上的純度。對于HPLC法中的色譜法只要可對可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的純度進行測定就沒有限定，可示例出凝膠過濾液相色譜法、離子交換液相色譜法和反相液相色譜法等，優(yōu)選凝膠過濾液相色譜法。在使用凝膠過濾液相色譜法的情況下，對于所使用的柱，只要結(jié)合可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的分子量進行選擇即可，例如可以舉出使用TOSOH TSKgel G3000SWXL(日本、東曹)，利用pH7. 3的磷酸鹽緩沖液進行展開的方法?？梢园凑杖毡舅幘址降囊合嗌V法〈2. 01>來實施試驗。進一步地，在本實施方式的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白中，對于宿主來源的DNA成分，優(yōu)選相對于可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白10，000U為小于2ng的比率，更優(yōu)選為小于O. 2ng的比率、進一步優(yōu)選為小于O. 02ng的比率。對于DNA量的測定，只要使用閾值系統(tǒng)(美國、Molecular Devices)即可容易地進行測定。對于本實施方式的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，只要HCP的含量相對于該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白10，000U為小于IOng的比率，則其形態(tài)就沒有特別限定，可以以溶液或粉末的形態(tài)存在。優(yōu)選以溶液的形態(tài)存在。并且，也有優(yōu)選以粉末形態(tài)存在的其它方式。作為溶液狀態(tài)情況下的濃度，以上限計優(yōu)選為lOOmg/mL以下、更優(yōu)選為60mg/mL以下、進一步優(yōu)選為30mg/mL以下、特別優(yōu)選為15mg/mL以下，以下限計優(yōu)選為2mg/mL以上、更優(yōu)選為4mg/mL以上、進一步優(yōu)選為6mg/mL以上、特別優(yōu)選為8mg/mL以上、最優(yōu)選為10mg/mL以上。另 夕卜，在以粉末形態(tài)存在的情況下，可以舉出冷凍干燥的形態(tài)作為優(yōu)選的實例。冷凍干燥體可以參考W003/061687所記載的方法來獲得。本實施方式的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白可以以實質(zhì)上不含有內(nèi)毒素的形式來獲得。作為內(nèi)毒素含量，優(yōu)選相對于可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白10，000U為小于I內(nèi)毒素單位(EU)，更優(yōu)選為小于O. 2EU、進一步優(yōu)選為小于O. 04EU。內(nèi)毒素量可以按照日本藥局方一般試驗法的內(nèi)毒素試驗法〈4. 01>進行測定。另外，由于本實施方式的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白不含有TFA等對生物體有害的物質(zhì)、可以接近于無菌的狀態(tài)獲得，因而可作為藥品的原料進行使用。本實施方式的HCP的混入得到降低的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白可以通過使含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液與尼龍和/或聚醚砜接觸來獲得，優(yōu)選使用尼龍。另外，也有優(yōu)選使用聚醚砜的其它方式。作為與本實施方式的含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液接觸的尼龍，可以舉出含有脂肪族骨架的聚酰胺，可示例出例如尼龍6、尼龍66、尼龍46、或者尼龍MXD6。只要可吸附HCP,其種類并無限定,優(yōu)選尼龍6。對于尼龍,例如可以以購自Sartorius社的Minisart NY的形式來獲得。對于尼龍的形態(tài)，只要為膜狀、無紡布、珠狀等可與溶液接觸的形態(tài)就特別沒有限定，優(yōu)選成型為膜狀，以過濾膜的形式進行使用。這種情況下，過濾膜的孔徑只要為HCP可通過的尺寸就沒有限定,可示例出O. 01 μ m 10 μ m,優(yōu)選為O. I μ m I μ m、更優(yōu)選為O. 01 μ m O. 06 μ m。對于與尼龍接觸的含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液的量，可以事先使一部分溶液與少量尼龍接觸，對HCP的去除能力進行評價，由此來容易地確定與尼龍接觸的含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液的量。在確認使含有HCP的含可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液與尼龍接觸后溶液中的HCP含量相對于可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白10，000U為小于IOng的比率的同時來獲得本實施方式的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，在HCP含量相對于可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白10，000U為IOng以上時停止獲得，或者可將使用中的尼龍變換為未使用品，重新進行高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的獲得。若示例出HCP量與尼龍量的關(guān)系，則例如在尼龍為過濾膜的情況下，相對于ImgHCP的膜面積作為上限可示例出50m2以下，優(yōu)選為5m2以下、更優(yōu)選為O. 5m2以下、進一步優(yōu)選為O. Im2以下，作為下限優(yōu)選為O. Olm2以上、更優(yōu)選為O. 02m2以上、進一步優(yōu)選為O. 03m2以上。重要的是根據(jù)要降低的HCP量來設(shè)定膜面積。
與本實施方式的含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液接觸的聚醚砜例如可以購自Sartorius社的Minisart High-Flow的形式來獲得。關(guān)于聚醚砜的形態(tài),只要為膜狀、無紡布、珠狀等且可與溶液接觸就特別沒有限定。優(yōu)選成型為膜狀以過濾膜的形式使用。這種情況下的過濾膜的孔徑只要為HCP可通過的尺寸就沒有限定，可示例出0.01μπι 10μπι4λ選O. Ιμπι 1μ m、更優(yōu)選O. 01 μ m O. 06 μ m。對于與聚醚砜接觸的含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液的量，可以事先使一部分溶液與少量聚醚砜接觸，對HCP的去除能力進行評價，由此來容易地確定。在確認使含有HCP的含可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液與聚醚砜接觸后的溶液中的HCP含量相對于可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白10，OOOU為小于IOng的比率的同時來獲得本實施方式的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，在HCP含量相對于可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白10，000U為IOng以上時停止獲得，或者可將使用中的聚醚砜變換為未使用品，重新進行高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的獲得。若示例出HCP量與聚醚砜量的關(guān)系，則例如在聚醚砜為過濾膜的情況下，相對于Img HCP的膜面積作為上限可示例出50m2以下，優(yōu)選為5m2以下、更優(yōu)選為O. 5m2以 下，作為下限優(yōu)選為O. 02m2以上、更優(yōu)選為O. 03m2以上、進一步優(yōu)選為O. 05m2以上。重要的是根據(jù)要降低的HCP量來設(shè)定膜面積。對于本實施方式的使HCP的混入得到降低的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的制造工序來說，只要包含使含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液與尼龍和/或聚醚砜接觸的工序、使得HCP含量相對于該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白10，000U為小于IOng的比率就沒有特別限定，可以示例出以下的制造工序。由(a) (g)構(gòu)成的制造工序，其包括使含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液與尼龍和/或聚醚砜接觸的工序。(a)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細胞并回收培養(yǎng)液(生產(chǎn)液)的工序；(b)過濾生產(chǎn)液得到過濾后生產(chǎn)液的工序；(C)將過濾后生產(chǎn)液供給于陰離子交換柱色譜中，得到粗精制液的工序；(d)將粗精制液供給于負載有抗血栓調(diào)節(jié)蛋白單克隆抗體的親和柱色譜中，得到精制液I的工序；(e)將精制液I供給于陽離子交換柱色譜工序中，得到精制液2的工序；(f)將濃縮后的精制液2供給于凝膠過濾柱色譜中，對其溶出液進行濃縮，得到精制液3的工序；以及(g)利用病毒去除膜和無菌過濾膜對精制液3進行過濾的工序。在上述制造工序中，使含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液與尼龍和/或聚醚砜接觸的工序可以包含在(b) (g)的任一或者2個以上的工序中，優(yōu)選包含在(d) (g)的任一或者2個以上的工序中。為了有效去除HCP，特別優(yōu)選在制造工序的最后工序、即在(g)之后增加與尼龍和/或聚醚砜接觸的工序。另外，為了使牛血清蛋白質(zhì)的混入為0，更優(yōu)選(a)的轉(zhuǎn)化細胞的培養(yǎng)為無血清培養(yǎng)。進一步地，作為本實施方式的使HCP的混入得到降低的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的制造工序，可以舉出以下所示的制造工序。由(a) (g)構(gòu)成的制造工序，其包括使含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液與尼龍和/或聚醚砜接觸的工序。(a)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細胞并回收培養(yǎng)液(生產(chǎn)液)的工序；(b)過濾生產(chǎn)液得到過濾后生產(chǎn)液的工序；(c)將過濾后生產(chǎn)液供給于陰離子交換柱色譜中，得到粗精制液I的工序；(d)將粗精制液I供給于疏水柱色譜中，得到粗精制液2的工序；(e)將粗精制液2供給于負載有抗血栓調(diào)節(jié)蛋白單克隆抗體的親和柱色譜中，得到精制液I的工序；(f)將濃縮后的精制液I供給于凝膠過濾柱色譜中，得到精制液2的工序；以及
(g)利用無菌過濾膜對精制液2進行過濾的工序。在上述制造工序中，使含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液與尼龍和/或聚醚砜接觸的工序可以包含在(b) (g)的任一或者2個以上的工序中，優(yōu)選包含在(e) (g)的任一或者2個以上的工序中。為了有效去除HCP，有時也優(yōu)選在制造工序的最后工序、S卩(g)之后增加與尼龍和/或聚醚砜接觸的工序。另外，為了使牛血清蛋白質(zhì)的混入為0，更優(yōu)選(a)的轉(zhuǎn)化細胞的培養(yǎng)為無血清培養(yǎng)。在確認使含有HCP的含可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液與尼龍和/或聚醚砜接觸后的溶液中的HCP含量相對于可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白10，000U為小于IOng的比率的同時來獲得本實施方式的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，在HCP含量相對于可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白10，000U為IOng以上時停止獲得,或者可將使用中的尼龍和/或聚醚砜變換為未使用品，重新進行高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的獲得。另外，如上所述，對于本實施方式的使HCP的混入得到降低的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的制造工序來說，只要包括使含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液與尼龍和/或聚醚砜接觸的工序、使得HCP含量相對于該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白10，000U為小于IOng的比率就沒有特別限定。即，可以在與尼龍和/或聚醚砜接觸的工序之后存在精制工序，作為結(jié)果，只要可獲得HCP的含量比率為相對于10，000U可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白小于IOng的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白即可。作為可以在與尼龍和/或聚醚砜接觸的工序之后存在的精制工序，可以舉出陰離子交換柱色譜法、親和柱色譜法、陽離子交換柱色譜法、凝膠過濾柱色譜法、或者疏水柱色譜法等柱色譜法工序；膜濃縮工序；病毒去除、無菌過濾等的膜過濾工序；或者它們2種以上的組合，優(yōu)選陽離子交換柱色譜法、凝膠過濾柱色譜法、膜濃縮、病毒去除、無菌過濾、或者它們2種以上的組合。有時優(yōu)選在與尼龍和/或聚醚砜接觸的工序之后存在陽離子交換柱色譜法、凝膠過濾柱色譜法、膜濃縮、病毒去除以及無菌過濾。另外，在與尼龍和/或聚醚砜接觸的工序之后，陽離子交換柱色譜法、凝膠過濾柱色譜法、膜濃縮、病毒去除以及無菌過濾的精制工序可以舉出以陽離子交換柱色譜法、膜濃縮、凝膠過濾柱色譜法、膜濃縮、病毒去除、無菌過濾的順序存在的情況作為更優(yōu)選的實例。另外，作為陽離子交換柱色譜法，可不例出 SP Sepharose FastFlow、DEAE Sepharose Fast Flow、Capto S、CaptoDEAE (GE Healthcare 社)；SHyperCel (Poul 社)；T0Y0PEARL GigaCap S_650(東曹社)，優(yōu)選SP Sepharose FastFlow。作為濃縮膜，可不例出MICROZA UF (旭化成化學(xué)社)、KvickFlow 10KD (GEHealthcare 社)、Pel I icon 2 (Millipore 社)，優(yōu)選 MICR0ZA UF。作為凝膠過濾柱色譜，可不例出 Sephacryl S-300HR、Superose 12pg (GE Healthcare 社)、T0Y0PEARLHW(東曹)，優(yōu)選Sephacryl S-300HR。作為病毒去除膜，可示例出PLANOVA 15N(旭化成醫(yī)療)、Biresolve NFP(Millipore 社)、Ultipor VF(Poul 社)，優(yōu)選 PLANOVA 15N。作為無菌過濾膜，可不例出 MilliPak、Millidisk(Millipore 社)、Supore EVA(Poul 社)、Sartopore2 (Sartorius Stedium 社),優(yōu)選 MilliPak0如此，通過使本實施方式的含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液與尼龍和/或聚醚砜接觸來獲得的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白為HCP含有比率相對于可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白10，OOOU小于IOng的物質(zhì)。本實施方式的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的IU被定義為在以蛋白質(zhì)C的活化為指標的APC分析中在I分鐘內(nèi)產(chǎn)生O. Iymol對硝基苯胺的量，其按照Biologicals (2002) 30、69-76所記載的方法利用包括以下工序的方法進行測定。(a)向含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的待檢測溶液中添加人凝血酶并進行加熱的工序;
(b)添加人蛋白質(zhì)C并進行加熱的工序；(C)添加肝素-抗凝血酶III并進行加熱的工序；(d)添加合成底物S-2366 (pyroGlu-Pro-Arg-pNA · HCl)并進行加熱的工序；(e)添加乙酸，終止底物切斷反應(yīng)的工序；(f)測定405nm的吸光度的工序；以及(g)根據(jù)下式測定含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的待檢測溶液的活性的工序。[數(shù)I]
(AsampIe — Ablaok) X VI 活性(U/mL)=X試樣的稀釋倍數(shù)
MXTXkXV2Asample :試樣溶液的吸光度Ablank :對照(水)的吸光度M :對硝基苯胺的摩爾吸光系數(shù)9. 6X 10_3[1/μ M]V1 :測定吸光度時的液量(L)V2 :試樣溶液的液量(mL)T :底物切斷反應(yīng)時間(分鐘)k:由血栓調(diào)節(jié)蛋白IU生成的活化蛋白質(zhì)C所游離出的對硝基苯胺的摩爾數(shù)O. 1(4 11101/分鐘/^)對于本實施方式的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白來說,可示例出每Img蛋白質(zhì)具有3，OOOU的活性，優(yōu)選為4，OOOU 9，000U、更優(yōu)選為5，OOOU 8，000U、進一步優(yōu)選為6，OOOU 7，OOOU。蛋白質(zhì)濃度可以以牛血清白蛋白為標準品，按照公知的蛋白濃度測定法進行測定。例如，可示例出Lowry法、Bradford法、BCA法等。本實施方式的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的HCP含量利用至少包括以下工序的方法進行測定。(a)將包含編碼可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的堿基序列的DNA轉(zhuǎn)染至宿主細胞，對所得到的轉(zhuǎn)化細胞、或其宿主細胞的任意之一進行無血清培養(yǎng)，由所得到的培養(yǎng)上清來制備宿主細胞來源的蛋白質(zhì)的工序；
(b)用上述(a)的該宿主細胞來源的蛋白質(zhì)使兔致敏，由所得到的抗血清來精制抗宿主細胞來源蛋白質(zhì)的抗體的工序；構(gòu)建包括下述(Cl) (c6)的測定系統(tǒng)的工序(Cl)使上述(b)的該抗宿主細胞來源蛋白質(zhì)的抗體吸附于固相的工序；(c2-l)使懷疑混入了該宿主細胞來源的蛋白質(zhì)的含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的待檢測溶液與吸附有該抗宿主細胞來源蛋白質(zhì)的抗體的該固相進行接觸的工序；(c3)向該固相中添加生物素化的抗宿主細胞來源蛋白質(zhì)的抗體的工序；(c4)向該固相中添加抗生物素蛋白化的過氧化物酶溶液的工序；(c5)添加酶底物溶液進行顯色的工序；以及 (c6)停止顯色，對其吸光度進行測定的工序；(d)利用上述測定系統(tǒng)對懷疑混入了該宿主細胞來源的蛋白質(zhì)的含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的待檢測溶液中的宿主細胞來源的蛋白質(zhì)濃度進行測定，判斷該含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的待檢測溶液中的宿主細胞來源的蛋白質(zhì)濃度是否包含在上述測定系統(tǒng)的可定量范圍中的工序，該可定量范圍是通過利用上述測定系統(tǒng)采用含有濃度已知的宿主細胞來源的蛋白質(zhì)的溶液進行測定而預(yù)先確認的；(e-Ι)在上述(d)中，在懷疑混入了該宿主細胞來源的蛋白質(zhì)的含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的待檢測溶液中的宿主細胞來源的蛋白質(zhì)濃度包含在可定量范圍中的情況下，將該濃度作為該宿主細胞來源的蛋白質(zhì)濃度的工序；(e-2-l)在上述⑷中，在懷疑混入了該宿主細胞來源的蛋白質(zhì)的含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的待檢測溶液中的宿主細胞來源的蛋白質(zhì)濃度未包含在可定量范圍中的情況下，為使其成為包含在上述測定系統(tǒng)的可定量范圍中的可測定濃度，根據(jù)需要對含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的待檢測溶液進行濃縮或稀釋，對該濃縮率或稀釋率進行記錄的工序；(e-2-2)將以上述(cl) (c6)表示的測定系統(tǒng)中的(c2_l)替換為如下所示的(c2-2)，利用該測定系統(tǒng)對在上述(e-2-l)中進行了濃縮或稀釋的含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的待檢測溶液中的宿主細胞來源的蛋白質(zhì)濃度進行測定，考慮濃縮率或稀釋率來求出該宿主細胞來源的蛋白質(zhì)濃度的工序；(c2-2)使根據(jù)需要進行了濃縮或稀釋的含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的待檢測溶液與吸附有該抗宿主細胞來源蛋白質(zhì)的抗體的該固相進行接觸的工序、以及使含有濃度已知的宿主細胞來源的蛋白質(zhì)的溶液與吸附有該抗宿主細胞來源蛋白質(zhì)的抗體的該固相進行接觸的工序；以及(f)另外測定出每單位體積含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的待檢測溶液中的血栓調(diào)節(jié)蛋白的APC活性，計算出(e-Ι)或(e-2-2)中求出的宿主細胞來源的蛋白質(zhì)濃度相對于該APC活性的比率的工序。本說明書中，HCP為制作用于產(chǎn)生可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的基因重組細胞時所用的宿主細胞來源的的蛋白質(zhì)，其不含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白。HCP可以由下述培養(yǎng)上清來制備，該培養(yǎng)上清為對于與包含編碼血栓調(diào)節(jié)蛋白的堿基序列的DNA的轉(zhuǎn)染中所用為同種的宿主細胞進行培養(yǎng)而得到的。對于所謂同種的宿主細胞，例如在CHO細胞的情況下，其表示包含分類為CHO-Kl株(ATCC編號CCL-61)、CHO-S株(美國、Invitrogen目錄編號11619-012)、CHO-DXBIK CH0-DG44 株(美國、Invitrogen 目錄編號 12610-010)等 CHO 細胞的菌株的概念，只要是分類為CHO細胞的菌株，可以使用任一菌株進行制備。若說到CHO細胞，則優(yōu)選使用作為同種宿主細胞的DXBll株或CHO-Kl株、更優(yōu)選使用DXBll株。另外，也有優(yōu)選使用CHO-Kl株的其它方式。HCP為制作產(chǎn)生可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的基因重組細胞時所用的宿主細胞來源的的蛋白質(zhì)，其被定義為利用至少含有上述(a) (f)的工序的方法而測定出的物質(zhì)，作為HCP的構(gòu)成要件，可以舉出試驗例6所示的組蛋白H2B (Biochimie, 61(1)，61-69 (1979))。另外，在將包含編碼血栓調(diào)節(jié)蛋白的堿基序列的DNA轉(zhuǎn)染至同種的宿主細胞中，對所得到的轉(zhuǎn)化細胞進行培養(yǎng)并由所得到的培養(yǎng)上清進行制備的情況下，只要將該培養(yǎng)上清供給于采用與血栓調(diào)節(jié)蛋白特異性結(jié)合的抗體作為配位體的抗體柱中，對非吸附級分進行回收即可。在確認到該非吸附級分檢測不出血栓調(diào)節(jié)蛋白的APC活性之后，可作為HCP進行使用。HCP優(yōu)選根據(jù)需要利用超濾膜進行濃縮。需要說明的是，對于在培養(yǎng)宿主細胞或轉(zhuǎn)化細胞時所使用的培養(yǎng)基，為了避免其它蛋白質(zhì)的混入，優(yōu)選為無血清培養(yǎng)基，更優(yōu)選無血清培養(yǎng)基為無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基。用HCP使兔致敏，由所得到的抗HCP抗血清精制抗HCP抗 體時可以利用柱色譜法，進一步可示例出硫酸銨鹽析法和柱色譜法的組合?？笻CP抗體精制中的柱色譜優(yōu)選使用蛋白質(zhì)A柱。在制備HCP時，在使用將包含編碼血栓調(diào)節(jié)蛋白的堿基序列的DNA轉(zhuǎn)染至宿主細胞而得到的轉(zhuǎn)化細胞的情況下，在精制抗HCP抗體時，也有優(yōu)選在利用蛋白質(zhì)A柱精制后使用血栓調(diào)節(jié)蛋白柱、獲得該非吸附級分來制成抗HCP抗體的其它方式。在構(gòu)筑HCP濃度測定系統(tǒng)時，需要明確其可定量范圍，只要可對相對于每10，000U血栓調(diào)節(jié)蛋白HCP含量小于IOng的情況進行測定，可定量范圍就沒有限定，但越可測定至低濃度越優(yōu)選。對于可定量范圍，作為下限可示例出100ng/mL以上，優(yōu)選為50ng/mL以上、更優(yōu)選為25ng/mL以上，作為上限可示例出500ng/mL。在對被測溶液進行濃縮的情況下，只要按照通常的蛋白質(zhì)濃縮法進行即可，沒有特別限定，但優(yōu)選利用超濾膜進行濃縮。另外，也有優(yōu)選通過在冷凍干燥后利用少量的水或緩沖液進行溶解來濃縮的方法的其它方式。另外，通過濃縮，HCP以外的成分也被濃縮，其可能會對HCP測定系統(tǒng)帶來影響，因而被檢溶液需要在不會對HCP測定系統(tǒng)帶來影響的范圍內(nèi)進行濃縮。例如，作為不會對HCP測定系統(tǒng)帶來影響的含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的待檢測溶液濃度范圍的上限，可以舉出5mg/mL。每10，000U血栓調(diào)節(jié)蛋白中的HCP含量根據(jù)下式計算出。a/bX10,000a :每ImL試樣中的HCP含量(ng/mL)b :每ImL試樣中的血栓調(diào)節(jié)蛋白的APC活性(U/mL)本實施方式的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白促進基于該凝血酶的蛋白質(zhì)C的活化，大量產(chǎn)生顯示出抗血液凝固作用與血栓溶解作用的活性型蛋白質(zhì)C。因而，本實施方式的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白大大有助于生物體中的抗血液凝固和血栓溶解。由于本實施方式的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白具有抗血液凝固作用以及血小板聚集抑制作用和血栓溶解作用，因而可作為用于調(diào)節(jié)血液凝固的、或者用于調(diào)節(jié)血小板聚集的藥物組合物來使用，具體地說，可用于例如心肌梗塞、血栓癥、塞栓癥、末梢血管閉塞癥、閉塞性動脈硬化癥、血管內(nèi)血液凝固綜合癥(DIC)、心絞痛、暫時性腦缺血發(fā)作、妊娠中毒癥等疾病的治療和預(yù)防。
在制備本實施方式的藥物組合物時，只要將本實施方式的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白與可藥用載體混合即可。即，可以將在治療或預(yù)防上述疾病中為有效量的本實施方式的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白與適當量的載體混合，來制備出適于有效施用至患者的藥物組合物。作為本實施方式的藥物組合物，優(yōu)選制成冷凍干燥的制劑。另外，本實施方式的藥物組合物優(yōu)選用作血管內(nèi)注射用制劑。進一步優(yōu)選制成點滴靜注用制劑。另外，在制造冷凍干燥制劑時，可以參考W003/061687所記載的方法來進行。作為注射劑使用的情況下，上述的載體可以藥劑形式進行給藥，且優(yōu)選為可溶解于生理食鹽水或葡萄糖注射液中的載體，作為該載體，可示例出選自由蔗糖、精制明膠、白蛋白、甘露醇、葡萄糖和氯化鈉組成的組中的I種以上，并且也可以舉出添加各種無機鹽的PH調(diào)節(jié)劑等方法作為優(yōu)選的實例，這種情況下，在與本實施方式的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的組合中，作為藥物組合物整體為可溶性的，且可徹底進行冷凍干燥，因此是優(yōu)選的。另外，在本實施方式中，上述載體另外還優(yōu)選為甘油。上述的載體優(yōu)選在制備制劑時添加，但在用時進行溶解時添加也是允許的。本實施方式的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白對于成人每I次的給藥量根據(jù)年齡、性 別、體重、癥狀等的不同而不同，通常為約O. Img 200mg，可示例出每天給藥一次或根據(jù)需要給藥數(shù)次、例如通過血管內(nèi)注射、優(yōu)選通過點滴靜注進行給藥的方法。對于本實施方式的藥物組合物，可以以作為有效成分的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白換算按每天O. Img 200mg給藥一次或根據(jù)需要給藥數(shù)次、通過例如血管內(nèi)注射、優(yōu)選通過點滴靜注進行給藥。實施例通過以下的實施例更為具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍并不受它們的任何限定。(參考例I)血栓調(diào)節(jié)蛋白的APC活性的測定方法按照Biologicals (2002) 30, 69-76,對于以蛋白質(zhì)C的活化為指標的血栓調(diào)節(jié)蛋白的APC活性進行測定。向20mM氯化鈣溶液75 μ L中添加利用含有O. 05%聚山梨醇酯20的Tris-咪唑緩沖液進行稀釋的試樣溶液25 μ L并用冰進行冷卻，之后添加40U/mL的人凝血酶(美國、Sigma)溶液25 μ L進行攪拌，在37°C進行加熱。自添加人凝血酶溶液起10分鐘后添加12U/mL的人蛋白質(zhì)C(美國、Enzyme Research)溶液25 μ L進行攪拌,在37°C進行加熱。自添加人蛋白質(zhì)C溶液起10分鐘后，添加肝素-抗凝血酶III溶液100 μ L進行攪拌，在37°C進行加熱。自添加肝素-抗凝血酶III溶液起10分鐘后，添加預(yù)先加熱至37°C的合成底物S-2366(瑞典、ChiOmogenix)溶液250 μ L進行攪拌，在37°C進行加熱。自添加底物溶液起
10分鐘后,添加50%乙酸I. 5mL進行攪拌，以水為對照，測定405nm的吸光度。血栓調(diào)節(jié)蛋白的APC活性根據(jù)下式計算出。另外，血栓調(diào)節(jié)蛋白IU被定義為I分鐘生成O. I μ mo I對硝基苯胺的量。[數(shù)2]
(AsanM)Ie — Abknk) X VI
活性(U/mL)= --X試樣的稀釋倍數(shù)
MXTXkXV2Asample :試樣溶液的吸光度
Ablank :對照(水)的吸光度M :對硝基苯胺的摩爾吸光系數(shù)9. 6X 10_3[1/μ M]V1 :測定吸光度時的液量2. OX KT3(L)V2 :試樣溶液的液量O. 025 (mL)T :底物切斷反應(yīng)時間10(分鐘)k:由血栓調(diào)節(jié)蛋白IU生成的活化蛋白質(zhì)C所游離出的對硝基苯胺的摩爾數(shù)O. 1(μπιο1/*#/υ)另外，試劑如下所述。
〈Tris-咪唑緩沖液〉在B液IOOmL中加入A液，調(diào)整至pH8. 4，利用水稀釋至10倍。A液將2-氨基-2-羥基甲基-1，3-丙二醇3. 03g和咪唑I. 70g溶解在IM鹽酸50mL中，加水成為lOOmL，添加氯化鈉11. 7g并溶解。B液將2-氨基-2-羥基甲基-1，3-丙二醇4. 04g、咪唑2. 27g和氯化鈉I. 95g溶解在水中，使其為lOOmL，添加氯化鈉11. 7g并溶解。<20mM氯化鈣溶液>向60mM氯化I丐溶液ImL中加入Tris-咪唑緩沖液2mL。 <肝素-抗凝血酶111溶液>加入2U/mL 的抗凝血酶 III (日本、Mitsubishi Pharma)溶液 7· 5 μ L、Tris_ 咪唑緩沖液42. 5yL和30U/mL的肝素(日本、持田制藥)溶液50 μ L進行振蕩混合。用時制備，直至要使用前用冰冷卻。(參考例2)HCP濃度的測定方法對于導(dǎo)入有血栓調(diào)節(jié)蛋白基因的基因重組CHO細胞進行無血清培養(yǎng)。將培養(yǎng)上清供給于抗血栓調(diào)節(jié)蛋白抗體柱中，得到非吸附級分。對于該非吸附級分，按照參考例I來測定血栓調(diào)節(jié)蛋白的APC活性，確認到無活性檢出后，利用超濾膜進行濃縮，制得HCP。以HCP為抗原對兔進行致敏，利用硫酸銨鹽析和蛋白質(zhì)A柱對所得到的抗HCP抗血清進行精制后，供給于以血栓調(diào)節(jié)蛋白為配位體的親和柱中，得到非吸附級分。如此得到不會識別血栓調(diào)節(jié)蛋白的兔抗HCP抗體。利用含有O. 05%聚山梨醇酯80的PBS進行稀釋，以使所預(yù)測的HCP濃度為O 500ng/mL,制成試樣溶液。另外，在試樣溶液的HCP濃度低的情況下，使用超濾膜等濃縮至適當?shù)臐舛?。另外向HCP中加入含有O. 05%聚山梨醇酯80的PBS，制備其ImL中含有500、400、300、200、100、50、25以及Ong的8種溶液，制成標準溶液。在聚苯乙烯制96孔微板中加入經(jīng)碳酸鈉緩沖液稀釋的25 μ g/mL的兔抗HCP抗體溶液，每I孔中各加入100 μ L，之后在25°C靜置約2小時。接下來，利用250 μ L的含有O. 05%聚山梨醇酯80的PBS對各孔進行5次清洗后，各加入200 μ L含有1%明膠的PBS，在25°C靜置約I小時。利用250 μ L的含有O. 05%聚山梨醇酯80的PBS對各孔進行5次清洗后，在各孔中加入100 μ L的試樣溶液和標準溶液，在25°C靜置約16小時。接下來，利用250 μ L的含有O. 05%聚山梨醇酯80的PBS對各孔進行5次清洗之后，各加入100 μ L生物素化的兔抗HCP抗體溶液，在25°C靜置約2小時。利用250 μ L的含有O. 05%聚山梨醇酯80的PBS對各孔進行5次清洗后，各加入100 μ L的抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，在25°C靜置約2小時。利用250 μ L的含有O. 05%聚山梨醇酯80的PBS對各孔進行5次清洗后，各加入100 μ L酶底物溶液,室溫下暗處靜置。適度顯色后，各加入50 μ L的25%硫酸使反應(yīng)停止，利用96孔微板用吸光度計(日本、Tecan Japan)測定492nm的吸光度。由基于標準溶液得到的校正曲線求出ImL試樣中的HCP含量。需要說明的是，本測定法的定量極限的一例為25ng/mL。根據(jù)需要，按照下式計算出每10，000U血栓調(diào)節(jié)蛋白中的HCP含量。每10，000U血栓調(diào)節(jié)蛋白中的HCP含量(ng/10, 000U)=a/bX10,000a :每ImL試樣中的HCP含量(ng/mL)b :每ImL試樣中的血栓調(diào)節(jié)蛋白的APC活性(U/mL)另外，試劑如下所述。 <碳酸鈉緩沖液>向無水碳酸鈉O. 16g和碳酸氫鈉O. 29g中加入水進行溶解，制成為lOOmL。<抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液>利用含有O. 05%聚山梨醇酯80的PBS將結(jié)合有抗生物素蛋白D的辣根過氧化物酶原液(美國、Vector Laboratories)稀釋至約30, 000倍。<酶底物溶液>將鄰苯二胺二鹽酸鹽IOmg加入到檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(將檸檬酸一水合物2. 56g和磷酸氫二鈉十二水合物9. 12g溶解在水中，制成為500mL)20mL中進行溶解，在要使用前加入雙氧水10 μ L0(參考例3)小鼠IgG濃度的測定方法以小鼠IgG為抗原，對兔進行致敏，利用硫酸銨鹽析和蛋白質(zhì)A柱對所得到的抗小鼠IgG抗血清進行精制，得到兔抗小鼠IgG抗體。利用含有0. 05%聚山梨醇酯80的PBS進行稀釋，以使所預(yù)測的小鼠IgG濃度為O 25ng/mL,制成試樣溶液。另外，在試樣溶液的IgG濃度低的情況下,使用超濾膜等濃縮至適當?shù)臐舛取Ａ硗庀蛐∈驣gG中加入含有0. 05%聚山梨醇酯80的PBS，制備其ImL中含有25、20、15、10、5、2. 5、I. 25,0. 63和Ong的9種溶液，制成標準溶液。在聚苯乙烯制96孔微板中加入經(jīng)碳酸鈉緩沖液稀釋的I. 5 μ g/mL的兔抗小鼠IgG抗體溶液，每I孔中各加入100 μ L，之后在25°C靜置約2小時。接下來，利用250 μ L的含有0. 05%聚山梨醇酯80的PBS對各孔進行5次清洗，各加入200 μ L含有1%明膠的PBS，在25°C靜置約I小時。利用250 μ L的含有0. 05%聚山梨醇酯80的PBS對各孔進行5次清洗后，在各孔中加入100 μ L的試樣溶液和標準溶液，在25°C靜置約16小時。接下來，利用250 μ L的含有0. 05%聚山梨醇酯80的PBS對各孔進行5次清洗后，各加入100 μ L生物素化的兔抗小鼠IgG抗體溶液，在25°C靜置約2小時。利用250 μ L的含有0. 05%聚山梨醇酯80的PBS對各孔進行5次清洗后，各加入100 μ L抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，在25°C靜置約2小時。利用250 μ L的含有0. 05%聚山梨醇酯80的PBS對各孔進行5次清洗之后，各加入100 μ L的酶底物溶液，室溫下暗處靜置。適度顯色后，各加入50μ L的25%硫酸使反應(yīng)停止，利用96孔微板用吸光度計(日本、Tecan Japan)測定492nm的吸光度。由基于標準溶液得到的校正曲線求出ImL試樣中的小鼠IgG含量。本測定法的定量極限的一例為0. 63ng/mL。根據(jù)需要，按照下式計算出每10，000U血栓調(diào)節(jié)蛋白中的小鼠IgG含量。
每10，OOOU血栓調(diào)節(jié)蛋白中的小鼠IgG含量(ng/10，000U)=a/bX10,000a :每ImL試樣中的小鼠IgG含量(ng/mL)b :每ImL試樣中的血栓調(diào)節(jié)蛋白的APC活性(U/mL)另外，試劑如下所述。<碳酸鈉緩沖液>向無水碳酸鈉O. 16g和碳酸氫鈉O. 29g中加入水進行溶解,制成為lOOmL。<抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液> 利用含有O. 05%聚山梨醇酯80的PBS將結(jié)合有抗生物素蛋白D的辣根過氧化物酶原液(美國、Vector Laboratories)稀釋至約30, 000倍?！疵傅孜锶芤骸祵⑧彵蕉范}酸鹽IOmg加入到檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(將檸檬酸一水合物2. 56g和磷酸氫二鈉十二水合物9. 12g溶解在水中，制成為500mL)20mL中進行溶解，在要使用前加入雙氧水10 μ L0(參考例4)牛血清蛋白質(zhì)濃度的測定方法以牛血清為抗原，對兔進行致敏，利用硫酸銨鹽析和蛋白質(zhì)A柱對所得到的抗牛血清蛋白質(zhì)抗血清進行精制，得到兔抗牛血清蛋白質(zhì)抗體。利用含有0. 05%聚山梨醇酯80的PBS進行稀釋，以使所預(yù)測的牛血清蛋白質(zhì)濃度為O 25ng/mL,制成試樣溶液。另外，在試樣溶液的牛血清蛋白質(zhì)濃度低的情況下，使用超濾膜等濃縮至適當?shù)臐舛?。另外向牛血清中加入含?. 05%聚山梨醇酯80的PBS，制備其ImL中含有25、20、15、10、5、2. 5、I. 25和Ong的8種溶液，制成標準溶液。在聚苯乙烯制96孔微板中加入經(jīng)碳酸鈉緩沖液稀釋的10 μ g/mL的兔抗牛血清蛋白質(zhì)抗體溶液，每I孔中各加入100 μ L，之后在25°C靜置約2小時。接下來，利用250 μ L的含有0. 05%聚山梨醇酯80的PBS對各孔進行5次清洗，各加入200 μ L含有1%明膠的PBS，在25°C靜置約I小時。利用250 μ L的含有0. 05%聚山梨醇酯80的PBS對各孔進行5次清洗后，在各孔中加入100 μ L的試樣溶液和標準溶液，在25°C靜置約16小時。接下來，利用250 μ L的含有0. 05%聚山梨醇酯80的PBS對各孔進行5次清洗后，各加入100 μ L生物素化的兔抗牛血清蛋白質(zhì)抗體溶液，在25°C靜置約2小時。利用250 μ L的含有0. 05%聚山梨醇酯80的PBS對各孔進行5次清洗后，各加入100 μ L的抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，在25°C靜置約2小時。利用250 μ L的含有0. 05%聚山梨醇酯80的PBS對各孔進行5次清洗后，各加入100 μ L酶底物溶液,室溫下暗處靜置。適度顯色后，各加入50μ L的25%硫酸使反應(yīng)停止，利用96孔微板用吸光度計(日本、Tecan Japan)測定492nm的吸光度。由基于標準溶液得到的校正曲線求出ImL試樣中的牛血清蛋白質(zhì)含量。本測定法的定量極限的一例為I. 25ng/mL。根據(jù)需要，按照下式計算出每10，000U血栓調(diào)節(jié)蛋白中的牛血清蛋白質(zhì)含量。每10，000U血栓調(diào)節(jié)蛋白中的牛血清蛋白質(zhì)含量(ng/10，000U)=a/bX10,000a :每ImL試樣中的牛血清蛋白質(zhì)含量(ng/mL)b :每ImL試樣中的血栓調(diào)節(jié)蛋白的APC活性(U/mL)
另外，試劑如下所述。<碳酸鈉緩沖液>向無水碳酸鈉O. 16g和碳酸氫鈉O. 29g中加入水進行溶解，制成為lOOmL。<抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液>利用含有O. 05%聚山梨醇酯80的PBS將結(jié)合有抗生物素蛋白D的辣根過氧化物酶原液(美國、Vector Laboratories)稀釋至約30, 000倍。<酶底物溶液>將鄰苯二胺二鹽酸鹽IOmg加入到檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(將檸檬酸一水合物2. 56g和磷酸氫二鈉十二水合物9. 12g溶解在水中，制成為500mL)20mL中進行溶解，在要使用前加入雙氧水10 μ L0 (比較例I)可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的制造I按照日本特開平11-341990號公報的實施例I,將編碼序列編號9所記載的氨基酸序列的DNA通過基因操作技術(shù)進行重組來制作基因重組CHO細胞，之后播種在含有150mg/L的L-脯氨酸(日本、味之素)、60mg/L的卡那霉素硫酸鹽(日本、明治制果)、lmg/L的酒石酸泰樂菌素(日本、Mercian)以及10%牛血清(美國、HyClone)的DMEM培養(yǎng)基(美國、Invitrogen)中，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)于37°C進行培養(yǎng)。對培養(yǎng)液進行離心分離，將所得到的細胞懸浮在含有150mg/L的L-脯氨酸(日本、味之素)、60mg/L的卡那霉素硫酸鹽(日本、明治制果)、lmg/L的酒石酸泰樂菌素(日本、Mercian)、10% 二甲基亞砜(德國、默克)以及10%牛血清(美國、HyClone)的DMEM培養(yǎng)基(美國、Invitrogen)中，之后分注到小瓶中(4X IO7Cells/支)，冷凍保存在液氮中。將日本特開平11-341990號公報的成分表2中所示的培養(yǎng)基的NaHCO3濃度變?yōu)?，700mg/L、將NaCl濃度變?yōu)?，410mg/L，將所得培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)。對于增殖培養(yǎng)基，向基本培養(yǎng)基中添加60mg/L的卡那霉素硫酸鹽(美國、Invitrogen)、lmg/L的酒石酸泰樂菌素(美國、Sigma-Aldrich)以及8%牛血清(美國、HyClone)進行使用。另外，對于生產(chǎn)培養(yǎng)基，使增殖培養(yǎng)基的血清濃度為3%。將I支細胞小瓶融解，將該細胞播種至IOOmL的增殖培養(yǎng)基中，使用懸浮培養(yǎng)瓶在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)于37°C進行5天攪拌培養(yǎng)。在活細胞密度為7. OX IO5ceIlsAiL以上的時刻，將培養(yǎng)液總量傳代至O. 9L的增殖培養(yǎng)基中，使用懸浮培養(yǎng)瓶在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)于37°C進行5天攪拌培養(yǎng)。在活細胞密度為7. OX IO5ceIlsAiL以上的時刻，將培養(yǎng)液總量傳代至9L的增殖培養(yǎng)基中，使用培養(yǎng)槽，在37°C、pH7. 2、溶解氧50%的條件下進行5天攪拌培養(yǎng)。在活細胞密度為7. OX IO5ceIlsAiL以上的時刻，將培養(yǎng)液總量傳代至120L的增殖培養(yǎng)基中，使用灌流培養(yǎng)槽，在37°C、pH7. 2、溶解氧50%的條件下進行7天攪拌培養(yǎng)。在活細胞密度為7. OX IO5ceIlsAiL以上的時刻，開始灌流培養(yǎng)，連續(xù)進行生產(chǎn)培養(yǎng)基的添加與培養(yǎng)上清液的回收。培養(yǎng)條件為37°C、pH7. 2、溶解氧50%、培養(yǎng)基交換130 200L/天、上面加壓O 0. 2MPa。在活細胞密度達到7. 5X IO6ceIlsAiL后繼續(xù)進行36天培養(yǎng)，將培養(yǎng)上清液作為生產(chǎn)液進行回收。使用過濾器SUPRAdisc II (美國、Pali)以及Supor EBV(美國、Pali)對回收的生產(chǎn)液進行澄清化，制成過濾后生產(chǎn)液在2 10°C保存。將約700L的過濾后生產(chǎn)液供給于利用含有150mM氯化鈉的20mM Tris鹽緩沖液(ρΗ7· 7)進行了平衡化的Q-Sepharose Fast Flow(美國、GE Healthcare)柱(直徑63cm、高度25cm)中。接下來，利用6柱容積(CV)的含有180mM氯化鈉的20mM乙酸緩沖液(pH5. 5)進行清洗，進一步利用含有180mM氯化鈉的20mM Tris鹽緩沖液(pH7. 7)進行清洗直至280nm的吸收回復(fù)到基線為止，利用含有300mM氯化鈉的20mM Tris鹽緩沖液(pH7. 7)開始洗脫。得到洗脫液的吸光度在280nm的峰開始上升起的O. 5柱容積容量的洗脫液作為粗精制液。反復(fù)實施6次同樣的操作，獲得6批次的粗精制液。另外，在溫度為2°C 10°C、柱流速(々口 7卜流速)為109L/小時的條件下進行實施。按照日本特開平11-341990號公報的實施例10，以人肺來源的血栓調(diào)節(jié)蛋白為抗原來制作抗血栓調(diào)節(jié)蛋白單克隆抗體，與CNBr-activated Sepharose (溴化氰活化瓊脂糖凝膠)4Fast Flow(美國、GE Healthcare)進行接觸反應(yīng),進行抗血栓調(diào)節(jié)蛋白單克隆抗體的偶聯(lián)，制作抗血栓調(diào)節(jié)蛋白單克隆抗體結(jié)合Sepharose 4Fast Flow,填充至柱中，制成單克隆抗體柱。將約40L的粗精制液供給于經(jīng)含有O. 3M氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(pH7. 3)平衡化的單克隆抗體柱(直徑44cm、高度13cm)中。流通6CV的含有I. OM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(PH7. 3)、進一步流通3CV的O. IM乙酸緩沖液(pH5. O)進行清洗，利用含有O. 3M 氯化鈉的O. IM甘氨酸鹽酸緩沖液(pH3. O)開始洗脫。得到洗脫液的吸光度在280nm的峰從開始上升起至開始下降為止的洗脫液，向洗脫液中添加1/10容量的O. 5M磷酸緩沖液(PH7.3)以精制液I的形式獲取。反復(fù)實施6次同樣的操作，獲得6批次的精制液I。需要說明的是，在溫度為2°C 10°C、柱流速為46L/小時的條件下進行實施。利用I. OM甘氨酸鹽酸緩沖液(pH2. O)將6批次的精制液I約170L調(diào)整成pH3. 5，供給于利用含有O. 3M NaCl的O. IM甘氨酸鹽酸緩沖液(pH3. 5)平衡化的SP-SepharoseFF(美國 GE Healthcare Bioscience)柱(直徑 45cm、高度 IOcm)中。利用含有O. 3M NaCl的O. IM甘氨酸鹽酸緩沖液(pH3. 5)開始進行清洗，得到吸光度在280nm的峰從開始上升起至開始下降為止的流通(素通>9 )級分，立即用O. 5M磷酸緩沖液(ρΗ7·3)中和至PH7，以精制液2的形式獲取。需要說明的是，在溫度為2V 10°C、柱流速為160L/小時的條件下進行實施。將約200L的精制液2利用超濾膜Microza UF組件SIP_2013(日本、旭化成化學(xué))濃縮至約IOL后，供給于利用含有50mM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(pH7. 3)平衡化的Sephacryl S-300HR(美國 GE Healthcare Bioscience)柱(直徑 63cm、高度 94cm)中。在將280nm的吸收最大的洗脫峰分出之后，利用超濾膜MicrozaUF組件SIP_1013(日本、旭化成化學(xué))濃縮至約12L，以精制液3的形式獲取。需要說明的是，在溫度為2V 10°C、柱流速為6. 2L/小時的條件下進行實施。在室溫下，在O. IMPa以下的壓力下使精制液3通過利用含有50mM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(PH7. 3)平衡化的病毒去除膜PLANOVA 15N(日本、旭化成醫(yī)療、膜面積Im2)，之后進一步通過O. 22 μ m的PVDF制過濾膜(美國、Millipore)，回收總量。將其作為可溶性血檢調(diào)節(jié)蛋白精制品。通過同樣的操作，獲得3批次(Al、A2、A3)的精制品。Al、A2、A3 的血栓調(diào)節(jié)蛋白的 APC 活性分別為 69000U/mL、68000U/mL、72000U/mL。Al、A2、A3的溶液中的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白濃度分別為10. 5mg/mL、10. 2mg/mL、10.3mg/mL。(比較例2)可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的制造2
使用日本特開平11-341990號公報的成分表2所不的培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基。對于增殖培養(yǎng)基，向基本培養(yǎng)基中添加60mg/L的卡那霉素硫酸鹽(美國、Invitrogen)、lmg/L的酒石酸泰樂菌素(日本、鹽野義制藥)以及8%牛血清(美國、HyClone)進行使用。另夕卜，對于生產(chǎn)培養(yǎng)基，使增殖培養(yǎng)基的血清濃度為4%。將比較例I中制作的I支細胞小瓶融解，將該細胞播種至IOOmL的增殖培養(yǎng)基中，使用懸浮培養(yǎng)瓶在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)于37°C進行3天攪拌培養(yǎng)。在活細胞密度為5. 0X105cells/mL以上的時刻，將培養(yǎng)液總量傳代至400mL的增殖培養(yǎng)基中，使用懸浮培養(yǎng)瓶在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)于37°C進行3天攪拌培養(yǎng)。在活細胞密度為5. OX IO5ceIlsAiL以上的時刻，將培養(yǎng)液總量傳代至2L的增殖培養(yǎng)基中，使用球形瓶在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)于37°C進行3天攪拌培養(yǎng)。在活細胞密度為5. OX IO5ceIlsAiL以上的時刻，將培養(yǎng)液總量傳代至7. 5L的增殖培養(yǎng)基中，使用球形瓶在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)于37 °C進行4天攪拌培養(yǎng)。在活細胞密度為5. OX IO5ceIlsAiL以上的時刻，開始灌流培養(yǎng)，連續(xù)進行生產(chǎn)培養(yǎng)基的添加與培養(yǎng)上清液的回收。培養(yǎng)條件為37°C、pH7. 2、溶解氧50%、培養(yǎng)基交換IOL/天、上面加壓O O. 2MPa。在活細胞密度達到7. 5X IO6ceIlsAiL后繼續(xù)進行40天培養(yǎng)，將培養(yǎng)上清液作為生產(chǎn)液進 行回收。回收的生產(chǎn)液使用孔徑為0.7 μ m和0.22 μ m的過濾器(美國、Pali)進行澄清化，制成過濾后生廣液在2 C 10 C保存。將約400L的過濾后生產(chǎn)液供給于利用含有150mM氯化鈉的20mM Tris鹽緩沖液(pH7. 4)平衡化的 Q-Sepharose Fast Flow(美國、GE Healthcare)柱(直徑 44cm、高度26cm)中。接下來，利用6CV的含有180mM氯化鈉的20mM乙酸緩沖液(pH5. 5)進行清洗，進一步利用含有180mM氯化鈉的20mM Tris鹽緩沖液(pH7. 4)進行清洗，直至280nm的吸收回復(fù)到基線為止，利用含有300mM氯化鈉的20mM Tris鹽緩沖液(pH7. 4)開始洗脫，得到洗脫液的吸光度在280nm的峰開始上升起的O. 5柱容積容量的洗脫液作為粗精制液。另外，在溫度為2°C 10°C、柱流速為45L/小時的條件下進行實施。將約20L的粗精制液供給于利用含有O. 3M氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(pH7. 3)平衡化的單克隆抗體柱(直徑44cm、高度12cm)中。流通6CV的含有I. OM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(PH7. 3)、進一步流通3CV的O. IM乙酸緩沖液(pH5. O)進行清洗，利用含有O. 3M氯化鈉的O. IM甘氨酸鹽酸緩沖液(pH3. O)開始洗脫。得到洗脫液的吸光度在280nm的峰從開始上升起至開始下降為止的洗脫液，向洗脫液中添加1/10容量的O. 5M磷酸緩沖液(pH7. 3)，以精制液I的形式獲取。另外，在溫度為2°C 10°C、柱流速為45L/小時的條件下進行實施。利用I. OM甘氨酸鹽酸緩沖液(pH2. O)將約12L的精制液I調(diào)整成pH3. 5，供給于利用含有O. 3M NaCl的O. IM甘氨酸鹽酸緩沖液(ρΗ3· 5)平衡化的SP-S印haroseFF(美國GE Healthcare Bioscience)柱(直徑 14cm、高度 13cm)中。利用含有 O. 3M NaCl 的 O. IM甘氨酸鹽酸緩沖液(PH3. 5)開始清洗，得到吸光度在280nm的峰從開始上升起至開始下降為止的流通級分，立即用O. 5M磷酸緩沖液(pH7. 3)中和至pH7，以精制液2的形式獲取。另夕卜，在溫度為2°C 10°C、柱流速為15L/小時的條件下進行實施。將約16L的精制液2利用超濾膜Microza UF組件SIP-1013 (日本、旭化成化學(xué))濃縮至約I. 2L后，供給于利用含有50mM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(pH7. 3)平衡化的Sephacryl S-300HR(美國 GE Healthcare Bioscience)柱(直徑 25cm、高度 85cm)中。在將280nm的吸收最大的洗脫峰分出之后，利用超濾膜Microza UF組件SIP_1013(日本、旭化成化學(xué))濃縮至約O. 8L，以精制液3的形式獲取。另外，在溫度為2°C 10°C、柱流速為IL/小時的條件下進行實施。在室溫下，在O. IMPa以下的壓力下使精制液3通過利用含有50mM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(PH7. 3)平衡化的病毒去除膜PLANOVA 15N(日本、旭化成醫(yī)療、膜面積O. 3m2)，之后進一步通過O. 22 μ m的PVDF制過濾膜(美國、Millipore)，回收總量。將其作為可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白精制品(批次B1)。BI的血栓調(diào)節(jié)蛋白的APC活性為79000U/mL。BI的溶液中的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白濃度為12. 6mg/mL。(比較例3)可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的制造3
使用DMEM培養(yǎng)基(美國、Invitrogen)作為基本培養(yǎng)基。對于增殖培養(yǎng)基，向基本培養(yǎng)基中添加150mg/L的L-脯氨酸(日本、味之素)、60mg/L的卡那霉素硫酸鹽(日本、明治制果)、lmg/L的酒石酸泰樂菌素(日本、Mercian)以及10%牛血清(美國、HyClone)進行使用。另外，對于生產(chǎn)培養(yǎng)基，使增殖培養(yǎng)基的血清濃度為1% 3%。將比較例I中制作的I支細胞小瓶融解，將該細胞播種至IOOmL的增殖培養(yǎng)基中，使用懸浮培養(yǎng)瓶在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)于37°C進行5天攪拌培養(yǎng)。將培養(yǎng)液總量傳代至400mL的增殖培養(yǎng)基中，使用懸浮培養(yǎng)瓶在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)于37°C進行5天攪拌培養(yǎng)。將培養(yǎng)液總量傳代至I. 6L的增殖培養(yǎng)基中，一邊吹入空氣與CO2, —邊使用球形瓶于37°C進行5天攪拌培養(yǎng)。將培養(yǎng)液總量傳代至6L的增殖培養(yǎng)基中，一邊吹入空氣、CO2和氧，一邊使用球形瓶于37°C進行5天攪拌培養(yǎng)。將培養(yǎng)液總量傳代至56L的增殖培養(yǎng)基中，一邊吹入空氣、CO2和氧，一邊使用球形瓶于37°C進行4天攪拌培養(yǎng)。進行總量培養(yǎng)基交換后進行3天培養(yǎng)，進一步進行總量培養(yǎng)基交換后，在活細胞密度達到I X IO6ceIlsAiL之后替換為生產(chǎn)培養(yǎng)基。使用CC-100連續(xù)離心分離機(瑞典、Alfa Laval)，對每天的生產(chǎn)液進行回收，交換為新鮮培養(yǎng)基。生產(chǎn)培養(yǎng)實施100天。回收的生產(chǎn)液使用孔徑為O. 7μπι和O. 22μπι的過濾器(美國、Pali)進行澄清化，制成過濾后生產(chǎn)液在2°C 10°C保存。將約2400L的過濾后生產(chǎn)液供給于利用含有150mM氯化鈉的20mM Tris鹽緩沖液(ρΗ7· 4)平衡化的 Q-Sepharose Fast Flow(美國、GE Healthcare)柱(直徑 44cm、高度25cm)中。接下來，利用6CV的含有180mM氯化鈉的20mM乙酸緩沖液(pH5. 5)進行清洗，進一步利用2CV的含有180mM氯化鈉的20mM Tris鹽緩沖液(pH7. 4)進行清洗，利用含有300mM氯化鈉的20mM Tris鹽緩沖液(pH7. 4)開始洗脫，得到洗脫液的吸光度在280nm的峰開始上升起的約15L的洗脫液作為粗精制液I。另外，在溫度為2V 10°C、柱流速為45L/小時的條件下進行實施。將上述粗精制液I供給于利用含有O. 3M NaCl的20mM磷酸緩沖液(pH7. O)平衡化的 Butyl-Sepharose FF(美國 GE Healthcare Bioscience)柱(直徑 25cm、高度 IOcm)中。利用含有O. 3M NaCl的20mM磷酸緩沖液(pH7. O)開始清洗，得到吸光度在280nm的峰從開始上升起至開始下降為止的流通級分作為粗精制液2。另外，在溫度為2V 10°C、柱流速為13L/小時的條件下進行實施。將約20L的粗精制液供給于利用含有O. 3M氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(pH7. 3)平衡化的單克隆抗體柱(直徑44cm、高度18cm)中。流通6CV的含有I. OM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(PH7. 3)、進一步流通3CV的O. IM乙酸緩沖液(pH5. O)進行清洗，利用含有O. 3M氯化鈉的O. IM甘氨酸鹽酸緩沖液(pH3. O)開始洗脫。得到洗脫液的吸光度在280nm的峰從開始上升起至開始下降為止的洗脫液，向洗脫液中添加1/10容量的IM甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(PH9. O)與1/25容量的O. 5M磷酸緩沖液(pH7. 3)以精制液I的形式獲取。另外，在溫度為2°C 10°C、柱流速為50L/小時的條件下進行實施。將約15L的精制液I利用超濾膜Microza UF組件SIP-1013 (日本、旭化成化學(xué))濃縮至約IL后，供給于利用含有150mM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(pH7. 3)平衡化的Sephacryl S-300HR(美國 GE Healthcare Bioscience)柱(直徑 25cm、高度 80cm)中。另夕卜，在溫度為2V 10°C、柱流速為IL/小時的條件下進行實施。在將280nm的吸收最大的洗脫峰分出之后，使液體通過O. 22 μ m的PVDF制過濾膜(美國、Millipore)，回收約3L。將其作為可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白精制品(批次B2)。B2的血栓調(diào)節(jié)蛋白的APC活性為28000U/mL。 B2的溶液中的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白濃度為3. 8mg/mL。(比較例4)可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的制造4 將I支在比較例I中冷凍保存的細胞小瓶融解，播種在含有8mM L-谷氨酰胺(美國、Invitrogen)、50 μ M次黃嘌呤(美國、Invitrogen)以及8 μ M胸腺卩密唳脫氧核苷(美國、Invitrogen)的無血清培養(yǎng)基IS CH0-CD(美國、Irvine Scientific)中，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)于37°C進行培養(yǎng)。對培養(yǎng)液進行離心分離，將所得到的細胞懸浮在含有8mM L-谷氨酰胺(美國、Invitrogen) >50 μ M次黃嘌呤(美國、Invitrogen)、8 μ M胸腺卩密唳脫氧核苷(美國、Invitrogen)以及10% 二甲基亞諷(美國、Sigma-AIdrich)的無血清培養(yǎng)基ISCH0-CD(美國、Irvine Scientific)中，之后分注到小瓶中(2X IO7Cells/支)，冷凍保存在液氮中。增殖培養(yǎng)基是在IL水中溶解20. 78g的IS CH0-CD-A3 (美國、IrvineScientific)、4.06g的氯化鈉(日本、富田制藥)以及2. 20g的碳酸氫鈉(日本、和光純藥工業(yè))來制作的。另外，生產(chǎn)培養(yǎng)基是在IL水中溶解20. 78g的IS CHO-⑶-A3(美國、IrvineScientific)、2· 63g的氯化鈉(日本、富田制藥)以及4. 40g的碳酸氫鈉(日本、和光純藥工業(yè))來制作的。將I支細胞小瓶融解，將該細胞播種至IOOmL的增殖培養(yǎng)基中，使用T-燒瓶在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)于36°C進行5天靜置培養(yǎng)。在活細胞密度為7.0X105cells/mL以上的時刻，將培養(yǎng)液40mL傳代至360mL的增殖培養(yǎng)基中，使用懸浮培養(yǎng)瓶在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)于36°C進行7天攪拌培養(yǎng)。在活細胞密度為7. OX IO5ceIlsAiL以上的時刻，將培養(yǎng)液80mL傳代至720mL的增殖培養(yǎng)基中，使用懸浮培養(yǎng)瓶在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)于36°C進行6天攪拌培養(yǎng)。在活細胞密度為7. OX IO5ceIlsAiL以上的時刻，將培養(yǎng)液總量傳代至9. 2L的增殖培養(yǎng)基中，使用灌流培養(yǎng)槽，在36°C、pH7. I、溶解氧50%的條件下進行8天攪拌培養(yǎng)。在活細胞密度為7. OX IO5ceIlsAiL以上的時刻，開始灌流培養(yǎng)，連續(xù)進行生產(chǎn)培養(yǎng)基的添加與培養(yǎng)上清液的回收。培養(yǎng)條件為36°C、pH7. I、溶解氧50%、培養(yǎng)基交換10L/天、上面加壓O 0. 2MPa。在活細胞密度達到7. 5X IO6ceIlsAiL后繼續(xù)進行26天培養(yǎng)，將培養(yǎng)上清液作為生產(chǎn)液進行回收。使用過濾器SupraCap (美國、Pali)以及Supor EBV (美國、Pali)對回收的生產(chǎn)液進行澄清化，制成過濾后生產(chǎn)液在2°C 10°C保存。將約250L的過濾后生產(chǎn)液供給于利用含有150mM氯化鈉的20mM Tris鹽緩沖液(pH7. 7)平衡化的 Q-Sepharose Fast Flow(美國、GE Healthcare)柱(直徑 25cm、高度25cm)中。接下來利用6CV的含有180mM氯化鈉的20mM乙酸緩沖液(pH5. 6)進行清洗，進一步利用4CV的含有180mM氯化鈉的20mM Tris鹽緩沖液(pH7. 7)進行清洗，利用含有290mM氯化鈉的20mM Tris鹽緩沖液(pH7. 7)開始洗脫，得到洗脫液的吸光度在280nm的峰開始上升起的O. 5柱容積容量的洗脫液作為粗精制液。另外，在溫度為2V 10°C、柱流速為18L/小時的條件下進行實施。將約6L的上述粗精制液供給于利用含有O. 3M氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(pH7. 3)平衡化的單克隆抗體柱(直徑44cm、高度8cm)中。流通6CV的含有I. OM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(PH7. 3)、進一步流通3CV的O. IM乙酸緩沖液(pH5. O)進行清洗，利用含有O. 3M氯化鈉的O. IM甘氨酸鹽酸緩沖液(pH3. O)開始洗脫。得到洗脫液的吸光度在280nm的峰從開始上升起至開始下降為止的洗脫液，向洗脫液中添加1/10容量的O. 5M磷酸緩沖液 (pH7. 3)，作為精制液I來獲取。另外，在溫度為2°C 10°C、柱流速為46L/小時的條件下進行實施。利用I. OM甘氨酸鹽酸緩沖液(pH2. O)將約14L的精制液I調(diào)整成pH3. 5，供給于利用含有O. 3M NaCl的O. IM甘氨酸鹽酸緩沖液(ρΗ3· 5)平衡化的SP-S印haroseFF(美國GE Healthcare Bioscience)柱(直徑 14cm、高度 13cm)中。利用含有 O. 3M NaCl 的 O. IM甘氨酸鹽酸緩沖液(PH3. 5)開始清洗，得到吸光度在280nm的峰從開始上升起至開始下降為止的流通級分，立即用O. 5M磷酸緩沖液(pH7. 3)中和至pH7，作為精制液2來獲取。另夕卜，在溫度為2°C 10°C、柱流速為15L/小時的條件下進行實施。將約20L的精制液2利用超濾膜Microza UF組件SIP-1013 (日本、旭化成化學(xué))濃縮至約IL后,供給于利用含有50mM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(pH7. 3)平衡化的SephacrylS-300HR(美國 GE Healthcare Bioscience)柱(直徑 25cm、高度 79cm)中。在將 280nm 的吸收最大的洗脫峰分出之后，利用超濾膜Microza UF組件SIP-1013 (日本、旭化成化學(xué))濃縮至約O. 7L，作為精制液3來獲取。另外，在溫度為2V 10°C、柱流速為IL/小時的條件下進行實施。在室溫下，在O. IMPa以下的壓力下使精制液3總量通過利用含有50mM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(pH7. 3)平衡化的病毒去除膜PLANOVA 15N(日本、旭化成醫(yī)療、膜面積O. 12m2)，之后進一步通過O. 22μπι的PVDF制過濾膜(美國、Millipore)，回收總量。將其作為可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白精制品(批次Β3)。(實施例I)高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的制造I將日本特開平11-341990號公報的成分表2所示的培養(yǎng)基的NaHCO3濃度變?yōu)?，700mg/L、將NaCl濃度變?yōu)?，410mg/L，將所得培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)。對于增殖培養(yǎng)基，向基本培養(yǎng)基中添加60mg/L的卡那霉素硫酸鹽(美國、Invitrogen)、lmg/L的酒石酸泰樂菌素(美國、Sigma-Aldrich)以及8%牛血清(美國、HyClone)進行使用。另外，對于生產(chǎn)培養(yǎng)基，使增殖培養(yǎng)基的血清濃度為3%。將比較例I中制作的I支細胞小瓶融解，將該細胞播種至IOOmL的增殖培養(yǎng)基中，使用懸浮培養(yǎng)瓶在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)于37°C進行5天攪拌培養(yǎng)。在活細胞密度為7.0X105cells/mL以上的時刻，將培養(yǎng)液總量傳代至O. 9L的增殖培養(yǎng)基中，使用懸浮培養(yǎng)瓶在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)于37°C進行5天攪拌培養(yǎng)。在活細胞密度為7. OX IO5ceIlsAiL以上的時刻，將培養(yǎng)液總量傳代至9L的增殖培養(yǎng)基中，使用培養(yǎng)槽在37°C、pH7. 2、溶解氧50%的條件下進行5天攪拌培養(yǎng)。在活細胞密度為7. OX IO5ceIlsAiL以上的時刻，將培養(yǎng)液總量傳代至120L的增殖培養(yǎng)基中，使用灌流培養(yǎng)槽，在37°C、pH7. 2、溶解氧50%的條件下進行7天攪拌培養(yǎng)。在活細胞密度為7. OX IO5ceIlsAiL以上的時刻，開始灌流培養(yǎng)，連續(xù)進行生產(chǎn)培養(yǎng)基的添加與培養(yǎng)上清液的回收。培養(yǎng)條件為37°C、pH7. 2、溶解氧50%、培養(yǎng)基交換130 200L/天、上面加壓O O. 2MPa。在活細胞密度達到7. 5X 106cells/mL后繼續(xù)進行40天培養(yǎng)，將培養(yǎng)上清液作為生產(chǎn)液進行回收。使用過濾器SUPRAdisc II (美國、Pali)以及Supor EBV(美國、Pali)對回收的生產(chǎn)液進行澄清化，制成過濾后生產(chǎn)液在2°C 10°C保存。將約700L的過濾后生產(chǎn)液供給于利用含有150mM氯化鈉的20mM Tris鹽緩沖液(pH7. 7)平衡化的 Q-Sepharose Fast Flow(美國、GE Healthcare)柱(直徑 63cm、高度25cm)中。接下來利用6CV的含有180mM氯化鈉的20mM乙酸緩沖液(pH5. 5)進行清洗，進 一步利用含有180mM氯化鈉的20mM Tris鹽緩沖液(pH7. 7)進行清洗直至280nm的吸收回復(fù)至基線為止，利用含有300mM氯化鈉的20mM Tris鹽緩沖液(pH7. 7)開始洗脫，得到洗脫液的吸光度在280nm的峰開始上升起的O. 5柱容積容量的洗脫液作為粗精制液。反復(fù)實施3次同樣的操作，獲得3批次的粗精制液。另外，在溫度為2V 10°C、柱流速為109L/小時的條件下進行實施。將約20L的粗精制液供給于利用含有O. 3M氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(pH7. 3)平衡化的單克隆抗體柱(直徑44cm、高度13cm)中。流通6CV的含有I. OM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(PH7. 3)、進一步流通3CV的O. IM乙酸緩沖液(pH5. O)進行清洗，用含有O. 3M氯化鈉的O. IM甘氨酸鹽酸緩沖液(pH3. O)開始洗脫。得到洗脫液的吸光度在280nm的峰從開始上升起至開始下降為止的洗脫液，向洗脫液中添加1/10容量的O. 5M磷酸緩沖液(pH7. 3)，作為精制液I來獲取。反復(fù)實施6次同樣的操作，獲得6批次的精制液I。另外，在溫度為2V 10°C、柱流速為46L/小時的條件下進行實施。以5L/分鐘的流速使6批次的精制液I約130L通過尼龍制過濾膜(德國、Sartorius 社、SART0L0N Maxi Caps 5101307H3、孔徑 O. 4 μ m+0. 2 μ m、膜面積 I. 8m2)后(相對于Img HCP使用約O. 07m2膜面積)，利用I. OM甘氨酸鹽酸緩沖液(pH2. O)調(diào)整成pH3. 5，供給于利用含有O. 3M NaCl的O. IM甘氨酸鹽酸緩沖液(pH3. 5)平衡化的SP-SepharoseFF(美國 GE Healthcare Bioscience)柱(直徑 45cm、高度 10cm)中。利用含有O. 3M NaCl的O. IM甘氨酸鹽酸緩沖液(pH3. 5)開始清洗，得到吸光度在280nm的峰從開始上升起至開始下降為止的流通級分，立即用O. 5M磷酸緩沖液(pH7. 3)中和至pH7，作為精制液2來獲取。另外，在溫度為2°C 10°C、柱流速為160L/小時的條件下進行實施。將約160L的精制液2利用超濾膜Microza UF組件SIP-2013 (日本、旭化成化學(xué))濃縮至約IOL后，供給于利用含有50mM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(pH7. 3)平衡化的Sephacryl S-300HR(美國 GE Healthcare Bioscience)柱(直徑 63cm、高度 94cm)中。在將280nm的吸收最大的洗脫峰分出之后，利用超濾膜MicrozaUF組件SIP-IO13 (日本、旭化成化學(xué))濃縮至約6L，作為精制液3來獲取。另外，在溫度為2°C 10°C、柱流速為6. 2L/小時的條件下進行實施。在室溫下，在O. IMPa以下的壓力下使精制液3通過利用含有50mM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(PH7. 3)平衡化的病毒去除膜PLANOVA 15N(日本、旭化成醫(yī)療、膜面積Im2)，之后進一步通過O. 22 μ m的PVDF制過濾膜(美國、Millipore)，回收總量。將其作為高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白精制品(批次A4)。A4的血栓調(diào)節(jié)蛋白的APC活性為60000U/mL。A4的溶液中的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋 白濃度為9. 3mg/mL。(實施例2)高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的制造2將實施例I中獲得的約2，OOOL的過濾后生產(chǎn)液供給于利用含有150mM氯化鈉的20mM Tris 鹽緩沖液(ρΗ7· 7)平衡化的 Q-Sepharose Fast Flow(美國、GE Healthcare)柱(直徑63cm、高度25cm)中。接下來利用6CV的含有170mM氯化鈉的20mM乙酸緩沖液(pH5. 45)進行清洗，進一步利用4CV的含有170mM氯化鈉的20mM Tris鹽緩沖液(pH7. 7)進行清洗，利用含有300mM氯化鈉的20mM Tris鹽緩沖液(pH7. 7)開始洗脫，得到洗脫液的吸光度在280nm的峰開始上升起的O. 5柱容積容量的洗脫液作為粗精制液。反復(fù)實施2次同樣的操作，獲得2批次的粗精制液。另外，在溫度為2°C 10°C、柱流速為109L/小時的條件下進行實施。將約IOL的粗精制液供給于利用含有O. 3M氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(pH7. 3)平衡化的單克隆抗體柱(直徑44cm、高度13cm)中。流通6CV的含有I. OM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(PH7. 3)、進一步流通3CV的O. IM乙酸緩沖液(pH5. O)進行清洗，利用含有O. 3M氯化鈉的O. IM甘氨酸鹽酸緩沖液(pH3. O)開始洗脫。得到洗脫液的吸光度在280nm的峰從開始上升起至開始下降為止的洗脫液，向洗脫液中添加1/10容量的O. 5M磷酸緩沖液(pH7. 3)，作為精制液I來獲取。反復(fù)實施8次同樣的操作，獲得8批次的精制液I。另外，在溫度為2°C 10°C、柱流速為46L/小時的條件下進行實施。以5L/分鐘的流速使6批次的精制液I約180L通過尼龍制過濾膜(德國、Sartorius 社、SART0L0N Maxi Caps 5101307H3、孔徑 O. 4 μ m+0. 2 μ m、膜面積 I. 8m2)后(相對于Img HCP使用約O. 05m2膜面積)，利用I. OM甘氨酸鹽酸緩沖液(pH2. O)調(diào)整成pH3. 5，供給于利用含有O. 3M NaCl的O. IM甘氨酸鹽酸緩沖液(pH3. 5)平衡化的SP-SepharoseFF(美國 GE Healthcare Bioscience)柱(直徑 45cm、高度 IOcm)中。利用含有O. 3M NaCl的O. IM甘氨酸鹽酸緩沖液(pH3. 5)開始清洗，得到吸光度在280nm的峰從開始上升起至開始下降為止的流通級分，立即用O. 5M磷酸緩沖液(pH7. 3)中和至pH7，作為精制液2來獲取。另外，在溫度為2°C 10°C、柱流速為160L/小時的條件下進行實施。將約220L的精制液2利用超濾膜Microza UF組件SIP_2013(日本、旭化成化學(xué))濃縮至約5L后，供給于利用含有50mM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(pH7. 3)平衡化的Sephacryl S-300HR(美國 GE Healthcare Bioscience)柱(直徑 63cm、高度 94cm)中。在將280nm的吸收最大的洗脫峰分出之后，利用超濾膜Microza UF組件SIP-IO13 (日本、旭化成化學(xué))濃縮至約10L，作為精制液3來獲取。另外，在溫度為2V 10°C、柱流速為6. 2L/小時的條件下進行實施。在室溫下，在O. IMPa以下的壓力下使精制液3通過利用含有50mM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(PH7. 3)平衡化的病毒去除膜PLANOVA 15N(日本、旭化成醫(yī)療、膜面積Im2)后，進一步通過O. 22 μ m的PVDF制過濾膜(美國、Millipore)，回收總量。將其作為高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白精制品(批次A5)。A5的血栓調(diào)節(jié)蛋白的APC活性為69000U/mL。A5的溶液中的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白濃度為10. 9mg/mL。(實施例3)高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的制造3將日本特開平11-341990號公報的成分表2中所示的培養(yǎng)基的NaHCO3濃度變?yōu)?，700mg/L、將NaCl濃度變?yōu)?，410mg/L，將所得培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)。對于增殖培養(yǎng)基，向基本培養(yǎng)基中加入60mg/L的卡那霉素硫酸鹽(美國、Invitrogen)、lmg/L的酒石酸泰樂菌素(美國、Sigma-Aldrich)以及8%牛血清(美國、HyClone)進行使用。另外，對于生產(chǎn)培養(yǎng)基，使增殖培養(yǎng)基的血清濃度為3%。將比較例I中制作的I支細胞小瓶融解，將該細胞播種至IOOmL的增殖培養(yǎng) 基中，使用懸浮培養(yǎng)瓶在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)于37°C進行5天攪拌培養(yǎng)。在活細胞密度為7. OX IO5ceIlsAiL以上的時刻，將培養(yǎng)液總量傳代至O. 9L的增殖培養(yǎng)基中，使用懸浮培養(yǎng)瓶在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)于37°C進行5天攪拌培養(yǎng)。在活細胞密度為7. OX IO5ceIlsAiL以上的時刻，將培養(yǎng)液總量傳代至9L的增殖培養(yǎng)基中，使用培養(yǎng)槽在37°C、pH7. 2、溶解氧50%的條件下進行5天攪拌培養(yǎng)。在活細胞密度為7. OX IO5ceIlsAiL以上的時刻，將培養(yǎng)液總量傳代至120L的增殖培養(yǎng)基中，使用灌流培養(yǎng)槽，在37°C、pH7. 2、溶解氧50%的條件下進行7天攪拌培養(yǎng)。在活細胞密度為7. OX IO5ceIlsAiL以上的時刻，開始灌流培養(yǎng)，連續(xù)進行生產(chǎn)培養(yǎng)基的添加與培養(yǎng)上清液的回收。培養(yǎng)條件為37°C、pH7. 2、溶解氧50%、培養(yǎng)基交換130 200L/天、上面加壓O O. 2MPa。在活細胞密度達到7. 5X 106cells/mL后繼續(xù)進行36天培養(yǎng)，將培養(yǎng)上清液作為生產(chǎn)液進行回收。使用過濾器SUPRAdisc II (美國、Pali)以及Supor EBV(美國、Pali)對于回收的生產(chǎn)液進行澄清化，制成過濾后生產(chǎn)液在2°C 10°C保存。將約700L的過濾后生產(chǎn)液供給于利用含有150mM氯化鈉的20mM Tris鹽緩沖液(pH7. 7)平衡化的 Q-Sepharose Fast Flow(美國、GE Healthcare)柱(直徑 63cm、高度25cm)中。接下來利用6CV的含有180mM氯化鈉的20mM乙酸緩沖液(pH5. 5)進行清洗，進一步利用含有180mM氯化鈉的20mM Tris鹽緩沖液(pH7. 7)進行清洗直至280nm的吸收回復(fù)至基線為止，利用含有300mM氯化鈉的20mM Tris鹽緩沖液(pH7. 7)開始洗脫，得到洗脫液的吸光度在280nm的峰開始上升起的O. 5柱容積容量的洗脫液作為粗精制液。反復(fù)實施6次同樣的操作，獲得6批次的粗精制液。另外，在溫度為2°C 10°C、柱流速為109L/小時的條件下進行實施。將約20L的粗精制液供給于利用含有O. 3M氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(pH7. 3)平衡化的單克隆抗體柱(直徑44cm、高度13cm)中。流通6CV的含有I. OM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(PH7. 3)、進一步流通3CV的O. IM乙酸緩沖液(pH5. O)進行清洗，利用含有O. 3M氯化鈉的O. IM甘氨酸鹽酸緩沖液(pH3. O)開始洗脫。得到洗脫液的吸光度在280nm的峰從開始上升起至開始下降為止的洗脫液，向洗脫液中添加1/10容量的O. 5M磷酸緩沖液(pH7. 3)，作為精制液I來獲取。反復(fù)實施12次同樣的操作，獲得12批次的精制液I。另外，在溫度為2°C 10°C、柱流速為46L/小時的條件下進行實施。使12批次的精制液I約270L在5L/分鐘的流速下通過尼龍制過濾膜(德國、Sartorius 社、SARTOLON Maxi Caps 5101307H3、孔徑 0· 4 μ m+0. 2 μ m、膜面積 I. 8m2)后(相對于Img HCP使用約O. 05m2膜面積)，利用I. OM甘氨酸鹽酸緩沖液(pH2. O)調(diào)整成pH3. 5，供給于利用含有O. 3M NaCl的O. IM甘氨酸鹽酸緩沖液(pH3. 5)平衡化的SP-SepharoseFF(美國 GE Healthcare Bioscience)柱(直徑 45cm、高度 IOcm)中。利用含有O. 3M NaCl的O. IM甘氨酸鹽酸緩沖液(pH3. 5)開始清洗，得到吸光度在280nm的峰從開始上升起至開始下降為止的流通級分，立即用O. 5M磷酸緩沖液(pH7. 3)中和至pH7，作為精制液2來獲取。另外，在溫度為2°C 10°C、柱流速為160L/小時的條件下進行實施。將約300L的精制液2利用超濾膜Microza UF組件SIP_2013(日本、旭化成化學(xué))濃縮至約IlL后，供給于利用含有50mM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(pH7. 3)平衡化的Sephacryl S-300HR(美國 GE Healthcare Bioscience)柱(直徑 63cm、高度 94cm)中。在將280nm的吸收最大的洗脫峰分出之后，利 用超濾膜Microza UF組件SIP-IO13 (日本、旭化成化學(xué))濃縮至約13L，作為精制液3來獲取。另外，在溫度為2°C 10°C、柱流速為6. 2L/小時的條件下進行實施。在室溫下，在O. IMPa以下的壓力下使精制液3通過利用含有50mM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(PH7. 3)平衡化的病毒去除膜PLANOVA 15N(日本、旭化成醫(yī)療、膜面積Im2)，之后進一步通過O. 22 μ m的PVDF制過濾膜(美國、Millipore)，回收總量。將其作為高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白精制品(批次A6)。A6的血栓調(diào)節(jié)蛋白的APC活性為81000U/mL。A6的溶液中的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白濃度為11. 9mg/mL。(實施例4)高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的制造4對于增殖培養(yǎng)基，將20. 78g 的 IS CH0-CD-A3 (美國、Irvine Scientific)、4· 06g的氯化鈉(日本、富田制藥)以及2.20g的碳酸氫鈉(日本、和光純藥工業(yè))溶解在IL水中來制作。另外，對于生產(chǎn)培養(yǎng)基，在IL水中溶解20. 78g的IS CHO-⑶-A3(美國、IrvineScientific)、2· 63g的氯化鈉(日本、富田制藥)以及4. 40g的碳酸氫鈉(日本、和光純藥工業(yè))來制作。將I支比較例4中制作的細胞小瓶融解，將該細胞播種至IOOmL的增殖培養(yǎng)基中，使用T-燒瓶在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)于36°C進行5天靜置培養(yǎng)。在活細胞密度為7. OX IO5ceIls/mL以上的時刻，將培養(yǎng)液總量傳代至O. 9L的增殖培養(yǎng)基中，使用懸浮培養(yǎng)瓶在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)于36°C進行5天攪拌培養(yǎng)。在活細胞密度為7. OX IO5ceIlsAiL以上的時刻，將培養(yǎng)液總量傳代至9L的增殖培養(yǎng)基中，使用培養(yǎng)槽，在36°C、pH7. I、溶解氧50%的條件下進行5天攪拌培養(yǎng)。在活細胞密度為7. OX IO5ceIlsAiL以上的時刻，將培養(yǎng)液總量傳代至120L的增殖培養(yǎng)基中，使用灌流培養(yǎng)槽，在36°C、pH7. I、溶解氧50%的條件下進行7天攪拌培養(yǎng)。在活細胞密度為7. OX IO5ceIlsAiL以上的時刻，開始灌流培養(yǎng)，連續(xù)進行生產(chǎn)培養(yǎng)基的添加與培養(yǎng)上清液的回收。培養(yǎng)條件為36°C、pH7. I、溶解氧50%、培養(yǎng)基交換130L/天、上面加壓O 0. 2MPa。在活細胞密度達到7. 5X 106cells/mL后繼續(xù)進行20天培養(yǎng)，將培養(yǎng)上清液作為生產(chǎn)液進行回收。使用過濾器SUPRAdisc II (美國、Pali)以及Supor EBV(美國、Pali)對于回收的生產(chǎn)液進行澄清化，制成過濾后生產(chǎn)液在2°C 10°C保存。將約1，400L的過濾后生產(chǎn)液供給于利用含有150mM氯化鈉的20mM Tris鹽緩沖液(ρΗ7· 7)平衡化的 Q-Sepharose Fast Flow(美國、GE Healthcare)柱(直徑 63cm、高度25cm)中。接下來利用6CV的含有180mM氯化鈉的20mM乙酸緩沖液(pH5. 6)進行清洗，進一步利用4CV的含有180mM氯化鈉的20mM Tris鹽緩沖液(pH7. 7)進行清洗，利用含有290mM氯化鈉的20mM Tris鹽緩沖液(pH7. 7)開始洗脫，得到洗脫液的吸光度在280nm的峰開始上升起的O. 5柱容積容量的洗脫液作為粗精制液。對于約900L的過濾后生產(chǎn)液也進行同樣的操作，獲得2批次的粗精制液。另外，在溫度為2°C 10°C、柱流速為109L/小時的條件下進行實施。將約13L的粗精制液供給于利用含有O. 3M氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(pH7. 3)平衡化的單克隆抗體柱(直徑44cm、高度13cm)中。流通6CV的含有I. OM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(PH7. 3)、進一步流通3CV的O. IM乙酸緩沖液(pH5. O)進行清洗，利用含有O. 3M氯化鈉的O. IM甘氨酸鹽酸緩沖液(pH3. O)開始洗脫。得到洗脫液的吸光度在280nm的峰從開始上升起至開始下降為止的洗脫液，向洗脫液中添加1/10容量的O. 5M磷酸緩沖液(pH7. 3)，作為精制液I來獲取。反復(fù)實施5次同樣的操作，獲得5批次的精制液I。另外，在溫度為2°C 10°C、柱流速為46L/小時的條件下進行實施。
使5批次的精制液I約IlOL以5L/分鐘的流速通過尼龍制過濾膜(德國、Sartorius 社、SARTOLON Maxi Caps 5101307H3、孔徑 O. 4 μ m+0. 2 μ m、膜面積 I. 8m2)后(相對于ImgHCP使用約O. 03m2膜面積)，利用I. OM甘氨酸鹽酸緩沖液(pH2. O)調(diào)整成pH3. 5，供給于利用含有O. 3M NaCl的O. IM甘氨酸鹽酸緩沖液(ρΗ3· 5)平衡化的SP-S印haroseFF (美國 GE Healthcare Bioscience)柱(直徑 45cm、高度 IOcm)中。利用含有 0. 3M NaCl 的0. IM甘氨酸鹽酸緩沖液(pH3. 5)開始清洗，得到吸光度在280nm的峰從開始上升起至開始下降為止的流通級分，立即用0.5M磷酸緩沖液(pH7.3)中和至pH7，作為精制液2來獲取。另外，在溫度為2°C 10°C、柱流速為160L/小時的條件下進行實施。將約120L的精制液2利用超濾膜Microza UF組件SIP_2013(日本、旭化成化學(xué))濃縮至約5L后，供給于利用含有50mM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(pH7. 3)平衡化的Sephacryl S-300HR(美國 GE Healthcare Bioscience)柱(直徑 63cm、高度 94cm)中。在將280nm的吸收最大的洗脫峰分出之后，利用超濾膜Microza UF組件SIP_1013(日本、旭化成化學(xué))濃縮至約5L，作為精制液3來獲取。另外，在溫度為2°C 10°C、柱流速為6. 2L/小時的條件下進行實施。在室溫下，在O. IMPa以下的壓力下使精制液3總量通過利用含有50mM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(pH7. 3)平衡化的病毒去除膜PLANOVA 15N(日本、旭化成醫(yī)療、膜面積Im2)，之后進一步通過O. 22μπι的PVDF制過濾膜(美國、Millipore)，回收總量。將其作為高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白精制品(批次:Α7)。Α7的血栓調(diào)節(jié)蛋白的APC活性為69000U/mL。A7的溶液中的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白濃度為10. 4mg/mL。(試驗例I)基于各種過濾膜的HCP去除評價使比較例I中得到的精制液I (HCP濃度462ng/ml)通過不同材質(zhì)的過濾膜后，對HCP濃度進行比較。即，使5ml的精制液I以Iml/分鐘的流速通過(I)PVDF(聚偏二氟乙烯)制(美國、Millipore、Millex GV)、⑵ CA(乙酸纖維素)制(德國、Sartorius、Minisart)、
(3)PES(聚醚砜)制(德國、Sartorius、Minisart High-Flow)、(4)尼龍制(美國、ThermoFisher Scientific、NALGENE Syringe Filter)、(5) CA+GF (乙酸纖維素 + 玻璃纖維)制(Sartorius、Minisart Plus)的各過濾膜，以過濾液的形式回收總量。對于過濾前后的液體進行蛋白質(zhì)濃度與HCP濃度的測定。蛋白質(zhì)濃度由280nm的吸光度求得，HCP濃度按照參考例2所示的方法進行測定。結(jié)果可知，對于所有的過濾膜，幾乎都未確認到過濾前后蛋白質(zhì)濃度的變化，但尼龍制過濾膜和PES制過濾膜中確認到了較高的HCP去除效果，HCP濃度分別減少到28%和36%(表I)。另外，盡管孔徑相同，但HCP濃度的降低根據(jù)膜材的不同而有較大不同，因而可認為其并非為進行聚集而去除不溶化的HCP，而是HCP基于膜的吸附去除。另外，進行評價的各過濾膜的膜徑為25mm或26mm，根據(jù)各制造商數(shù)據(jù)圖表記載的過濾膜的有效膜面積，相對于Img HCP的膜面積為O. 17m2或O. 23m2。[表 I]
過濾膜 ~IlI~~SI~有效膜相對丁· ImgHCP Ihcp冋收率|蛋白質(zhì)冋收__(pm) (mm)面積(cm2)的膜面積(m2) (%)率(％)
(1)PVDF0.22~ 25 — 3.9 ~ 0.1793 一101
(2)CA0.2 — 26 ~ 5.3 ~0.2369 — 100
(3)PES0.2 — 26 — 5.3 ~0.2336 — 100
(4)尼龍0.2 ~ 25 —示明不明2899
(5)CA+GF0.2265.30.23[ 44 [ 99(試驗例2)基于尼龍制和PES制過濾膜的HCP去除能力比較在試驗例I中，判斷出尼龍制過濾膜與PES制過濾膜具有較高的HCP去除能力，因而對于這些過濾膜，基于通液量進行了 HCP去除能力變化的評價。另外，在過濾膜中，針對各材質(zhì)準備兩種制造商的商品，對于進行通液的精制液1，使用與試驗例2中使用的批次為不同的批次(HCP濃度303ng/ml)。在過濾膜中，作為對照使用PVDF制(美國、Millipore、Millex GV :孔徑0.22 μ m、膜徑25mm、有效膜面積3. 9cm2)，作為尼龍制使用(I)美國、Pall社的Acrodisc 4 -44361':孔徑0.2“111、膜徑25111111、有效膜面積3.90112，以及⑵德國、Sartorius社的Minisart NY25 :孔徑O. 2 μ m、膜徑25mm、有效膜面積4. 8cm2 ;作為PES制使用(3)美國Poul社的Acrodisc PN4612 :孔徑O. 2 μ m、膜徑25mm、有效膜面積2. 8cm2，以及
(4)Sartorius 社的 Minisart High-Flow :孔徑 O. 2 μ m、膜徑 26mm、有效膜面積 5. 3cm2。每一過濾膜中精制液I的通液量在IOml/分鐘的流速下為100ml，每通液20ml，對過濾液進行采樣，按照參考例2所示的方法測定HCP濃度、由280nm的吸收測定蛋白質(zhì)濃度。其結(jié)果，在所有樣品中都未確認到蛋白質(zhì)濃度的變化，但在尼龍制和PES制過濾膜中均確認到了 HCP去除效果(表2)。HCP去除效果在尼龍制過濾膜特別高，HCP濃度最大降低至25%?？芍?，過濾膜中的通液量越少、即相對于Img HCP的過濾膜面積越大，HCP去除效果越聞。[表2]
權(quán)利要求
1.一種高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其為由轉(zhuǎn)化細胞所產(chǎn)生的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，該轉(zhuǎn)化細胞是將包含編碼可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的堿基序列的DNA轉(zhuǎn)染至宿主細胞而得到的，其中，宿主細胞來源的蛋白質(zhì)含量比率為相對于10，OOOU可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白小于IOng0
2.如權(quán)利要求I所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中,可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白為通過對該轉(zhuǎn)化細胞進行無血清培養(yǎng)而產(chǎn)生的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白。
3.如權(quán)利要求I或2所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中，該宿主細胞為中國倉鼠卵巢細胞。
4.如權(quán)利要求I 3的任一項所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中，該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白為具有下述(I) (5)的性質(zhì)的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白 (1)與凝血酶選擇性結(jié)合的作用； (2)促進基于凝血酶的蛋白質(zhì)C的活化的作用； (3)延長基于凝血酶的凝固時間的作用； (4)抑制基于凝血酶的血小板聚集的作用；以及 (5)抗炎作用。
5.如權(quán)利要求I 4的任一項所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中，該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的分子量為50，000至80，000的范圍。
6.如權(quán)利要求I 5的任一項所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中，該高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白是通過包括以下工序的方法制造的 (a)將包含編碼可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的堿基序列的DNA轉(zhuǎn)染至宿主細胞，獲得轉(zhuǎn)化細胞的工序； (b)培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細胞，獲得含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液的工序；以及 (C)使該含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液與尼龍和/或聚醚砜接觸，得到高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的工序，該高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白中，宿主細胞來源的蛋白質(zhì)含量比率為相對于10，000U可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白小于10ng。
7.權(quán)利要求I 6的任一項所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中，該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白為下述的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白 其為含有(i)序列編號9或序列編號11的任一項所記載的氨基酸序列中的第367 480位氨基酸序列、且含有下述(ii-Ι)或(ii-2)的任意氨基酸序列的肽，該肽具有下述(I) (5)的性質(zhì)， (ii-Ι)序列編號9或序列編號11的任一項所記載的氨基酸序列中的第19 244位氨基酸序列；或 ( -2)上述(ii-Ι)的氨基酸序列中有I個或2個以上的氨基酸發(fā)生取代、缺失、或添加而成的氨基酸序列， (1)與凝血酶選擇性結(jié)合的作用； (2)促進基于凝血酶的蛋白質(zhì)C的活化的作用； (3)延長基于凝血酶的凝固時間的作用； (4)抑制基于凝血酶的血小板聚集的作用；以及 (5)抗炎作用。
8.如權(quán)利要求I 6的任一項所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中，該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白為下述可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白其為具有下述(i-Ι)或(i-2)的任意氨基酸序列的肽，該肽具有下述⑴ (5)的性質(zhì)， (i-Ι)序列編號9或序列編號11的任一項所記載的氨基酸序列中的第19 516位氨基酸序列；或 (i-2)上述(i-Ι)的氨基酸序列中有I個或2個以上的氨基酸發(fā)生取代、缺失、或添加而成的氨基酸序列， (1)與凝血酶選擇性結(jié)合的作用； (2)促進基于凝血酶的蛋白質(zhì)C的活化的作用； (3)延長基于凝血酶的凝固時間的作用； (4)抑制基于凝血酶的血小板聚集的作用；以及 (5)抗炎作用。
9.如權(quán)利要求I 6的任一項所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中，包含編碼該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的堿基序列的DNA為編碼序列編號9或序列編號11的任一項所記載的氨基酸序列的DNA。
10.一種藥物組合物,其含有權(quán)利要求I 9的任一項所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白和可藥用載體。
11.一種制造方法，其是高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的制造方法，所述高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白中，宿主細胞來源的蛋白質(zhì)含量比率為相對于10，000U可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白小于10ng，其中，該方法包括下述工序?qū)幋a可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的堿基序列的DNA轉(zhuǎn)染至宿主細胞，得到轉(zhuǎn)化細胞，使該轉(zhuǎn)化細胞產(chǎn)生的含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液與尼龍和/或聚醚砜接觸。
12.如權(quán)利要求11所述的制造方法，其中，可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白是通過對該轉(zhuǎn)化細胞進行無血清培養(yǎng)而產(chǎn)生的。
13.如權(quán)利要求11或12所述的高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的制造方法，其中，該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白為具有下述(I) (5)的性質(zhì)的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白 (1)與凝血酶選擇性結(jié)合的作用； (2)促進基于凝血酶的蛋白質(zhì)C的活化的作用； (3)延長基于凝血酶的凝固時間的作用； (4)抑制基于凝血酶的血小板聚集的作用；以及 (5)抗炎作用。
14.如權(quán)利要求11 13的任一項所述的制造方法，其中，該宿主細胞為中國倉鼠卵巢細胞。
15.如權(quán)利要求11 14的任一項所述的制造方法，其中，該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的分子量為 50，000 至 80，000。
16.如權(quán)利要求11 15的任一項所述的制造方法，其中，該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白為下述可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白 其為含有(i)序列編號9或序列編號11的任一項所記載的氨基酸序列中的第367 480位氨基酸序列、且含有下述(ii-Ι)或(ii-2)的任意氨基酸序列的肽，該肽具有下述(I) (5)的性質(zhì)， (ii-Ι)序列編號9或序列編號11的任一項所記載的氨基酸序列中的第19 244位氨基酸序列；或 (ii-2)上述(ii-Ι)的氨基酸序列中有I個或2個以上的氨基酸發(fā)生取代、缺失、或添加而成的氨基酸序列， (1)與凝血酶選擇性結(jié)合的作用； (2)促進基于凝血酶的蛋白質(zhì)C的活化的作用； (3)延長基于凝血酶的凝固時間的作用； (4)抑制基于凝血酶的血小板聚集的作用；以及 (5)抗炎作用。
17.權(quán)利要求11 15的任一項所述的制造方法，其中，該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白為下述可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白其為具有下述(i-Ι)或(i-2)的任意氨基酸序列的肽，該肽具有下述(I) (5)的性質(zhì)， (i-Ι)序列編號9或序列編號11的任一項所記載的氨基酸序列中的第19 516位氨基酸序列；或 (i-2)上述(i-Ι)的氨基酸序列中有I個或2個以上的氨基酸發(fā)生取代、缺失、或添加而成的氨基酸序列， (1)與凝血酶選擇性結(jié)合的作用； (2)促進基于凝血酶的蛋白質(zhì)C的活化的作用； (3)延長基于凝血酶的凝固時間的作用； (4)抑制基于凝血酶的血小板聚集的作用；以及 (5)抗炎作用。
18.如權(quán)利要求11 15的任一項所述的制造方法，其中，包含編碼該可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的堿基序列的DNA為編碼序列編號9或序列編號11所記載的氨基酸序列的DNA。
19.如權(quán)利要求11 18的任一項所述的制造方法，其中，尼龍和/或聚醚砜的形態(tài)為過濾膜的形態(tài)。
20.如權(quán)利要求19所述的制造方法，其中，過濾膜的膜面積相對于Img宿主細胞來源的蛋白質(zhì)為O. Olm2至O. 5m2。
21.如權(quán)利要求11 20的任一項所述的制造方法，其中，尼龍和/或聚醚砜為尼龍。
22.如權(quán)利要求11 21的任一項所述的制造方法，其為高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的制造方法，所述高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白中，宿主細胞來源的蛋白質(zhì)含量比率為相對于10, 000U可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白小于10ng，該制造方法包括下述工序 (a)將編碼序列編號9或序列編號11所記載的氨基酸序列的DNA轉(zhuǎn)染至宿主細胞，獲得轉(zhuǎn)化細胞的工序； (b)培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細胞，獲得含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液的工序； (c)將該含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液精制至總蛋白質(zhì)中的血栓調(diào)節(jié)蛋白純度為99%以上的工序；以及 (d)使該含有可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的溶液與尼龍接觸，將高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白分離的工序，該高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白中，宿主細胞來源的蛋白質(zhì)含量比率為相對于.10,OOOU可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白小于10ng， 所述宿主細胞為中國倉鼠卵巢細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及高純度可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，其為由轉(zhuǎn)化細胞所產(chǎn)生的可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，該轉(zhuǎn)化細胞是將包含編碼可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的堿基序列的DNA轉(zhuǎn)染至宿主細胞而得到的，其中，宿主細胞來源的蛋白質(zhì)含量比率為相對于10,000U可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白小于10ng。
文檔編號C12P21/02GK102858978SQ20118002149
公開日2013年1月2日 申請日期2011年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月30日
發(fā)明者上野雄二, 重松弘樹 申請人:旭化成制藥株式會社