專利名稱：用于造血譜系細(xì)胞生長和分化的細(xì)胞培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于造血譜系(hematopoietic lineage)細(xì)胞生長和/或分化的細(xì)胞
培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
本領(lǐng)域持續(xù)大量需求易分解的血液制品，特別是為了輸血目的，目前天然人血液的供給不能充分滿足此目的。因此，已經(jīng)研究了許多天然血液的替代品。然而，穩(wěn)定的或重組的血紅蛋白已經(jīng)示出令人失望的性質(zhì)，人工氧轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的適應(yīng)癥是有限的并且通過酶處理或抗原掩蔽而與ABO系統(tǒng)和/或RhD抗原相容的“通用”紅細(xì)胞的開發(fā)緩慢。因此需要這些方法的替代方法。因此特別希望的是嘗試從干細(xì)胞體外產(chǎn)生紅系細(xì)胞(erythroid cells)如紅細(xì)胞。然而，體外再現(xiàn)在體內(nèi)需要幾個(gè)月的自然構(gòu)建是一個(gè)相當(dāng)大的挑戰(zhàn)。事實(shí)上，在其在人類中的發(fā)生過程中，紅細(xì)胞生成涉及在兩個(gè)波段(wave)從中胚層進(jìn)化。原始的(primitive)紅細(xì)胞生成早在妊娠第三周在卵黃囊(胚胎外組織)中開始，并且產(chǎn)生原始成核紅細(xì)胞巨幼紅細(xì)胞，其合成GowerIU 2 ε 2)和Gower II ( α 2 ε 2)型胚胎血紅蛋白。確定的(definitive)紅細(xì)胞生成在妊娠第五周期間在主動脈-性腺-中腎(AGM)區(qū)開始,之后遷移至胎肝，然后至骨髓。產(chǎn)生的紅系細(xì)胞逐漸成熟，導(dǎo)致產(chǎn)生無核紅細(xì)胞(RBC)，其是正常紅細(xì)胞并且含有胎兒(α2γ2)及然后成人(α2β2)血紅蛋白。迄今為止，已經(jīng)報(bào)道了從人胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生紅細(xì)胞的一些嘗試，如Maetal. (2008) Proc. Na tl. Acad. Sc1. USA 105:13087-13092 所述。然而，這些實(shí)驗(yàn)通常依賴于在存在基質(zhì)細(xì)胞條件下的共培養(yǎng)步驟，這樣難以按比例擴(kuò)大生產(chǎn)。發(fā)明概沭本發(fā)明由本發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，包含胰島素、運(yùn)鐵蛋白和血漿或血清的細(xì)胞培養(yǎng)基可用于從人胚胎干細(xì)胞、人誘導(dǎo)的多能干(iPS)細(xì)胞或者人造血干細(xì)胞大量產(chǎn)生紅細(xì)胞或者網(wǎng)織紅細(xì)胞，而不需要在細(xì)胞基質(zhì)上共培養(yǎng)。因此，本發(fā)明涉及用于造血譜系細(xì)胞生長和/或分化的細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含-胰島素，濃度為1-50μ g/ml ；-運(yùn)鐵蛋白，濃度為 100 μ g/ml-2000 μ g/ml ;及-血漿或血清，濃度為1%_30%。本發(fā)明還涉及如上所述細(xì)胞培養(yǎng)基在造血譜系細(xì)胞的生長和/或分化中的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及生長和/或分化造血譜系細(xì)胞的方法，其包含至少一個(gè)用上述細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞的步驟。附圖簡沭

圖1示出紅系細(xì)胞的擴(kuò)增和分化。通過G-CSF動員的白細(xì)胞去除術(shù)(LK)獲得的人CD34+細(xì)胞根據(jù)三階段方案擴(kuò)增并且在存在5%人血漿條件下培養(yǎng)(見“材料和方法”章節(jié))。點(diǎn)是四個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的平均值。圖2示出在第18天⑶71、⑶36、血型糖蛋白A和RhD表達(dá)的流式細(xì)胞計(jì)量分析。實(shí)心柱表示相關(guān)mAb，空心柱表示不相關(guān)mAb的陰性對照。該圖示出代表四個(gè)單獨(dú)分析的一個(gè)實(shí)驗(yàn)。圖3示出在第18天在培養(yǎng)基(左側(cè))和對照RBC (右側(cè))上LK衍生的網(wǎng)織紅細(xì)胞的變形性譜。滲透梯度的細(xì)胞變形計(jì)量法(ektacytometry)用于測量無核紅細(xì)胞的伸長(見“材料與方法”章節(jié))。曲線是指osmoscan變量，即分別在等滲、高滲和低滲條件下確定的最大變形指數(shù)(DImax)及0hypCT和0min。所述變量的正常值通過檢測來自144個(gè)正常成年人的樣品獲得，DImax范圍在O. 41-0. 53，Omin的范圍是143-163m0sm/Kg，Ohyper的范圍是335_375m0sm/Kg。圖4示出通過HPLC分析確定的網(wǎng)織紅細(xì)胞在第18天的血紅蛋白狀態(tài)(Bio-RadVariant II)。洗脫峰中血紅蛋白的百分比表示HbF、HbAlc、HbA2和總HbA級分。圖5示出在37°C網(wǎng)織紅細(xì)胞懸浮液(三角形)和對照RBC懸浮液在含有150mM NaCl的IOmM Hepes緩沖液(ρΗ7· 4)中在不同DPG/Hb4比率的張力測量氧結(jié)合曲線。RBC等溫線根據(jù)10個(gè)不同血液樣品的平均MWC參數(shù)模擬。圖6示出用于從hESC產(chǎn)生紅系細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)步驟的示意圖。將未分化的hESC簇在“EB培養(yǎng)基”中培養(yǎng)20天。然后將解離的第15-20天的EB在液體培養(yǎng)基中在存在細(xì)胞因子相繼混合物的條件下培養(yǎng)直 至28天(見“材料和方法”章節(jié))。圖7示出在第6-20天的EB ( —個(gè)代表性實(shí)驗(yàn))中，在EB分化期間hESC衍生的細(xì)胞的造血標(biāo)志物⑶45、⑶34和⑶45/⑶34的表達(dá)百分比(左側(cè)y軸)以及CFC形成的動力學(xué)(右側(cè)y軸)。圖8示出在EB分化期間hESC衍生的細(xì)胞的紅系細(xì)胞標(biāo)志物CD71、CD36和GlycoA。圖9示出在液體培養(yǎng)基中紅系細(xì)胞系的定型(commitment)。在指定時(shí)間取等份液體培養(yǎng)物，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析。原成紅細(xì)胞(ProE)，嗜堿性成紅細(xì)胞(BasoE)，多染性成紅細(xì)胞(PolyE)，正染性成紅細(xì)胞(OrthoE)，培養(yǎng)的血細(xì)胞(cRBC)。一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)。圖10示出在衍生自EWC的cRBC中RhD抗原表達(dá)。將產(chǎn)生自EB的去核cRBC用抗-Rh D 抗體(Biotest, Seraclone Reagents for ABO Blood Typing)標(biāo)記。用二級藻紅蛋白綴合的兔抗人抗體(Beckman)顯示細(xì)胞。圖11示出在不同培養(yǎng)條件下在第25天液體培養(yǎng)基中的紅系細(xì)胞大小。細(xì)胞大小用光學(xué)顯微鏡測量，每次測量100個(gè)細(xì)胞。AD(貼壁細(xì)胞)；NA(非貼壁細(xì)胞)；NA/MS5、NA/MSC、NA/MQ (分別在MS5細(xì)胞、MSC和巨噬細(xì)胞上共培養(yǎng)的非貼壁細(xì)胞)；PB (來自成年人外周血的RBC)。圖12示出通過對衍生自EWC的第25天cRBC的Hb進(jìn)行質(zhì)譜分析和HPLC分析鑒別的球蛋白鏈的代表性RP-HPLC譜。圖13示出對衍生自臍帶血細(xì)胞的第24天cRBC的Hb進(jìn)行質(zhì)譜分析和HPLC分析鑒別的球蛋白鏈的代表性RP-HPLC譜。圖14示出在cRBC血紅蛋白(三角形黑色曲線)和來自對照天然RBC的血紅蛋白(圓形黑色曲線)閃光光解之后的CO重結(jié)合動力學(xué)。這兩個(gè)樣品示出相似的結(jié)合性質(zhì)，包括別構(gòu)轉(zhuǎn)換。通過改變光解脈沖能量，可以改變解離的血紅蛋白的總分?jǐn)?shù)(fraction)，由此詳細(xì)探查各種部分結(jié)合的群。在高光解水平，產(chǎn)生更多的單結(jié)合四聚體，其轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗鯓?gòu)象(T-態(tài))并且重結(jié)合配體更緩慢。在中等水平(中)，可以更好探查雙重結(jié)合的四聚體，這種形式難以用平衡技術(shù)研究。在足夠低光解水平，主要的光產(chǎn)物是三重結(jié)合的四聚體，其快速重結(jié)合配體(R態(tài))。顯示在CO光解離的不同強(qiáng)度的R->T別構(gòu)轉(zhuǎn)換百分比。CO重結(jié)合動力學(xué)可以用針對R態(tài)構(gòu)象中的四聚體種類固有的快速速率和T態(tài)構(gòu)象固有的慢速率的兩個(gè)指數(shù)期模擬。R態(tài)速率典型是6X106/ms，而T態(tài)速率大約慢20倍。由于別構(gòu)轉(zhuǎn)換偏移所致，在激光光解離的不同強(qiáng)度T態(tài)四聚體的分?jǐn)?shù)對于來自cRBC-EWC的HbF和Hb比HbA高得多。在加入ImM IHP (肌醇六磷酸)后，增加的向低親和性T態(tài)四聚體的別構(gòu)轉(zhuǎn)換對于HbA要高于來自cRBC-EWC的HbF和Hb。這可以通過HbF對于IHP的更低的親和性而解釋，如針對2，3DPG所報(bào)道的那樣，和/或通過在別構(gòu)效應(yīng)物不存在下與HbA相比HbF的R->T轉(zhuǎn)換百分比更聞而解釋。發(fā)明詳沭如本文所述，“造血譜系細(xì)胞”是指在哺乳動物、特別是人的血液中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞，以及在分化時(shí)可產(chǎn)生這種血細(xì)胞的細(xì)胞。更特別地，本發(fā)明的“造血譜系細(xì)胞”涉及紅系細(xì)胞，即紅細(xì)胞及在分化時(shí)直接即一步或者間接即在幾個(gè)步驟中可產(chǎn)生紅細(xì)胞的細(xì)胞。如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，根據(jù)增加的分化程度分類，紅系細(xì)胞系細(xì)胞主要包含胚胎干細(xì)胞、造血干細(xì)胞(HSC)、原成紅細(xì)胞、成紅細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞、無核細(xì)胞，特別是無核網(wǎng)織紅細(xì)胞，及紅細(xì)胞。本發(fā)明的造血譜系細(xì)胞因此主要包含干細(xì)胞，特別是胚胎干細(xì)胞(ESC)，成人干細(xì)胞，如造血干細(xì)胞(HSC)，誘導(dǎo)的多能干(iPS)細(xì)胞，以及擬胚體，也包含原成紅細(xì)胞、成紅細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞及無核細(xì)胞，特別是無核網(wǎng)織紅細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明的造血譜系細(xì)胞是人細(xì)胞。iPS細(xì)胞為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。其可以通過許多方法及從許多細(xì)胞類型獲得。例如，iPS 細(xì)胞可以根據(jù) Takahashi & Yamanaka (2006) Cell 126:663-676 及 Yamanaka etal. (2007)Nature 448: 313-317 的教導(dǎo)而獲得。如本文所述，術(shù)語“生長”涉及培養(yǎng)細(xì)胞的增殖。如本文所述，術(shù)語“分化”涉及在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞獲得在最初用于接種細(xì)胞培養(yǎng)基的細(xì)胞中不存在的細(xì)胞特性。如本文所述，“分化”特別是指獲得進(jìn)一步使細(xì)胞定型為朝向分化為紅細(xì)胞的途徑中的特性。因此，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基可特別用于使生長未分化的細(xì)胞，如胚胎干細(xì)胞，成人干細(xì)胞，如造血干細(xì)胞，誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPS)，或者擬胚體，以及將其分化為網(wǎng)織紅細(xì)胞、無核細(xì)胞或者紅細(xì)胞。如本文所述，“細(xì)胞培養(yǎng)基”涉及任何培養(yǎng)基，特別是任何液體培養(yǎng)基，其可以維持真核細(xì)胞、特別是哺乳動物細(xì)胞、更特別是人細(xì)胞的生長。優(yōu)選地，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基由其中添加如下成分的基本培養(yǎng)基組成-胰島素，濃度為1-50μ g/ml ；-運(yùn)鐵蛋白，濃度為100 μ g/ml-2000 μ g/ml ;及-血漿或血清，濃度為1%_30%。優(yōu)選地，所述基本培養(yǎng)基自身通?？删S持真核細(xì)胞、特別是哺乳動物細(xì)胞、更特別是人細(xì)胞的生長。這種基本培養(yǎng)基為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。例如，可以是Iscove' sModified Dulbecco/ s培養(yǎng)基(IMDM)，任選補(bǔ)加了谷氨酰胺或者含有谷氨酰胺的肽。因此，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)選進(jìn)一步包含Iscove' s Modified Dulbecco ' s培養(yǎng)基(IMDM)，任選補(bǔ)加谷氨酰胺或者含有谷氨酰胺的肽。優(yōu)選本發(fā)明的胰島素是人重組胰島素。優(yōu)選胰島素的濃度為5 μ g/ml-20 μ g/ml,更優(yōu)選濃度為8 μ g/ml-12 μ g/ml,及最優(yōu)選濃度為大約10 μ g/ml。優(yōu)選運(yùn)鐵蛋白是人運(yùn)鐵蛋白。優(yōu)選運(yùn)鐵蛋白是鐵飽和的。優(yōu)選運(yùn)鐵蛋白濃度為200μ g/ml-1000 μ g/ml,更優(yōu)選濃度為300 μ g/ml-500 μ g/ml,及最優(yōu)選濃度為大約330 μ g/ml或450 μ g/ml。所述運(yùn)鐵蛋白可以是重組的。優(yōu)選血漿或血清是人血漿或血清。優(yōu)選血漿或血清濃度為1%_20%，更優(yōu)選濃度為4%-12%，甚至更優(yōu)選濃度為5%-10%，最優(yōu)選濃度為大約5%或10%。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)一步包含肝素，特別是濃度為O. 5UI/ml-5n/ml，更特別濃度為1. 5-3. 5Π/πι1，最優(yōu)選濃度為大約2Π/πι1。優(yōu)選當(dāng)血清也包含于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基中時(shí)，所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含肝素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)一步包含紅細(xì)胞生成素(Epo)，特別是人重組紅細(xì)胞生成素，優(yōu)選濃度為O. 5Π/πι1-20Π/πι1，更優(yōu)選濃度為2. 5UI/ml-3. 5UI/ml,最優(yōu)選濃度為大約3UI/ml。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)一步包含干細(xì)胞因子(SCF)，特別是人重組干細(xì)胞因子，優(yōu)選濃度為50ng/ml-200ng/ml,更優(yōu)選濃度為80ng/ml-120ng/ml,最優(yōu)選濃度為大約100ng/ml。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)一步包含白細(xì)胞介素-3 (IL-3)，特別是人重組白細(xì)胞介素-3,優(yōu) 選濃度為lng/ml-30ng/ml,更優(yōu)選濃度為4ng/ml-6ng/ml,最優(yōu)選濃度為大約5ng/ml。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)一步包含氫化可的松，優(yōu)選濃度為5. 1(Γ-5. 10_6M，更優(yōu)選濃度為大約10_6M。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)一步包含選自如下的至少一種化合物-血小板生成素(TPO)，特別是重組人血小板生成素，優(yōu)選濃度為20ng/ml-200ng/ml,更優(yōu)選濃度為80ng/ml-120ng/ml,最優(yōu)選濃度為大約100ng/ml ；-FMS-樣酪氨酸激酶3 (FLT3)配體，特別是重組人FLT3配體，優(yōu)選濃度為20ng/ml-200ng/ml,更優(yōu)選濃度為80ng/ml-120ng/ml,最優(yōu)選濃度為大約100ng/ml ；-骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP4)，特別是重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白4，優(yōu)選濃度為Ing/ml-20ng/ml,更優(yōu)選濃度為8ng/ml-12ng/ml,最優(yōu)選濃度為大約10ng/ml ；-血管內(nèi)皮生長因子A165(VEGF-A165)，特別是重組人VEGF-A165，優(yōu)選濃度為lng/ml-20ng/ml,更優(yōu)選濃度為4ng/ml-6ng/ml,最優(yōu)選濃度為大約5ng/ml ;及-白細(xì)胞介素-6(IL-6)，特別是重組人IL-6，優(yōu)選濃度為lng/ml-20ng/ml，更優(yōu)選濃度為4ng/ml-6ng/ml,最優(yōu)選濃度為大約5ng/ml。優(yōu)選本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基用于生長造血干細(xì)胞(HSC)及使HSC分化為網(wǎng)織紅細(xì)胞、無核細(xì)胞和/或紅細(xì)胞。優(yōu)選本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基用于生長擬胚體(EB)，特別是得自胚胎干細(xì)胞的EB，及使EB分化為網(wǎng)織紅細(xì)胞、無核細(xì)胞和/或紅細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員明了網(wǎng)織紅細(xì)胞、無核細(xì)胞和/或紅細(xì)胞可以是以基本純的細(xì)胞群形式獲得或者作為網(wǎng)織紅細(xì)胞、無核細(xì)胞和/或紅細(xì)胞的混合物獲得。優(yōu)選本發(fā)明的方法將HSC分化為網(wǎng)織紅細(xì)胞、無核細(xì)胞、紅細(xì)胞，或者其混合物，所述方法包括-在第一步驟中，將HSC在包含如下成分的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-9天，特別是培養(yǎng)7天-胰島素，濃度為8-12μ g/ml ；-運(yùn)鐵蛋白，濃度為300-350μ g/ml ；-血漿，濃度為3%_7%；-肝素，濃度為1. 5UI/ml-2. 5UI/ml ；-氫化可的松，濃度為5.1(Γ-5.1O-6M ；-SCF,濃度為 80ng/ml_l20ng/ml ；-1L-3,濃度為 4ng/ml_6ng/ml ;-Epo，濃度為 2. 5-3. 5UI/ml-在第二步驟中，將在第一步驟中獲得的細(xì)胞在包含如下成分的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)2_5天，特別是3_4天-胰島素，濃度為8-12μ g/ml ；

-運(yùn)鐵蛋白，濃度為300-350μ g/ml ；-血漿，濃度為3%_7%；-肝素，濃度為1. 5UI/ml-2. 5UI/ml ；-氫化可的松，濃度為5.10〃-5.1O^6M ；-SCF,濃度為 80ng/ml_l20ng/ml ；-Epo，濃度為 2. 5-3. 5UI/ml ；-在第三步驟中，將在第二步驟中獲得的細(xì)胞在包含如下成分的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)6-10天,特別是至自第一步驟起第18-21天-胰島素，濃度為8-12μ g/ml ；-運(yùn)鐵蛋白，濃度為300-350μ g/ml ；-血漿，濃度為3%_7%；-肝素，濃度為1. 5UI/ml-2. 5UI/ml ；-氫化可的松，濃度為5.10〃-5.1O^6M ；-Epo，濃度為 2. 5-3. 5UI/ml ；-從而獲得網(wǎng)織紅細(xì)胞、無核細(xì)胞、紅細(xì)胞，或者其混合物。優(yōu)選本發(fā)明的方法用于使EB分化為紅細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞、無核細(xì)胞，或者其混合物，所述方法包括-在第一步驟中，將EB在包含如下成分的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)15-25天，特別是20天-胰島素，濃度為8-12μ g/ml ；-運(yùn)鐵蛋白，濃度為425-475μ g/ml ；-血漿，濃度為3%_7%；-肝素，濃度為1. 5UI/ml-2. 5UI/ml ；
-SCF，濃度為 80ng/ml-120ng/ml ；-TP0,濃度為 80ng/ml_120ng/ml ；-FLT3 配體，濃度為 80ng/ml_120ng/ml ；-BMP4,濃度為 8ng/ml_12ng/ml ;-VEGF-A165,濃度為 4ng/ml_6ng/ml ；-1L-3,濃度為 4ng/ml_6ng/ml ;-1L-6,濃度為 4ng/ml_6ng/ml ;-Epo，濃度為 2. 5-3. 5UI/ml ；-在第二步驟中，將在第一步驟中獲得的細(xì)胞解離并將解離的細(xì)胞在包含如下成分的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)6-10天，特別是培養(yǎng)8天-胰島素，濃度為8-12μ g/ml ；-運(yùn)鐵蛋白，濃度為425-475μ g/ml ；-血漿，濃度為8%-12%；-肝素，濃度為2. 5UI/ml-3. 5UI/ml ；-SCF,濃度為 80ng/ml_120ng/ml ；-1L-3,濃度為 4ng/ml_6ng/ml ;-Epo，濃度為 2· 5-3. 5UI/ml-在第三步驟中，將在第二步驟中獲得的細(xì)胞在包含如下成分的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-4天，特別是培養(yǎng)3天-胰島素，濃度為8-12μ g/ml ;-運(yùn)鐵蛋白，濃度為425-475μ g/ml ；-血漿，濃度為8%-12%；-肝素，濃度為2. 5UI/ml-3. 5UI/ml ；-SCF,濃度為 80ng/ml_120ng/ml ；-Epo，濃度為 2. 5-3. 5UI/ml ；-在第四步驟中，將在第三步驟中獲得的細(xì)胞在包含如下成分的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-4天，特別是培養(yǎng)3天_膜島素，濃度為8-12 μ g/ml ;-運(yùn)鐵蛋白，濃度為425-475μ g/ml ；-血衆(zhòng)，濃度為8%-12%；

-肝素，濃度為2. 5UI/ml-3. 5UI/ml ；_Epo,濃度為 2. 5-3. 5UI/ml ；-在第五步驟中，將在第三 步驟中獲得的細(xì)胞(i)在包含如下成分的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)8-12天，特別是培養(yǎng)10天-胰島素，濃度為8-12μ g/ml ;-運(yùn)鐵蛋白，濃度為425-475μ g/ml ；-血衆(zhòng)，濃度為8%-12%；-肝素，濃度為2. 5UI/ml-3. 5UI/ml ；-Epo，濃度為 2. 5-3. 5UI/ml ；
或者(ii)在貼壁基質(zhì)層上培養(yǎng)8-12天，特別是培養(yǎng)10天；從而獲得紅細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞、無核細(xì)胞，或者其混合物。
實(shí)施例實(shí)施例1 :在體外從誥血干細(xì)朐產(chǎn)牛網(wǎng)織紅細(xì)朐材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)用G_CSF[白細(xì)胞去除術(shù)(LK)細(xì)胞]動員的正常外周血得自知情同意的健康供體。使用 Min1-MACS 柱(Miltenyi Biotech, Bergisch Glodbach, Germany)通過超磁性微珠選擇法分離⑶34+細(xì)胞(純度>94±3%)。將細(xì)胞在IMDM(Iscove 修改的 Dulbecco’ s 培養(yǎng)基，Biochrom, Germany)中培養(yǎng)，其中補(bǔ)加了 2mM L-谷氨酸胺(Invitrogen, Cergy-Pontoise, France)、330 μ g/ml 鐵飽和的人運(yùn)鐵蛋白、10 μ g/ml 膜島素(Sigma, Saint-Quentin Fallavier, France)、2IU/ml肝素Choay (Sanofi, France)以及5%溶劑/洗漆劑病毒失活的(S/D)血衆(zhòng)。擴(kuò)增程序包括三個(gè)步驟。在第一個(gè)步驟中(0-7天)，將104/ml⑶34+細(xì)胞在存在1(Γ6Μ氫化可的松(HC)(Sigma)、100ng/ml SCF (由 Amgen, Thousand Oaks, CA 惠贈)、5ng/ml IL-3(R&DSystems, Abingdon, UK.)和 3IU/ml Epo (Eprex,由 Janssen-Cilag, Issy-les-Moulineaux,France惠贈)的條件下培養(yǎng)。在第4天，將I體積的細(xì)胞培養(yǎng)物在4體積的含有HC、SCF、IL-3和Epo的新鮮培養(yǎng)基中稀釋。在第二個(gè)步驟中(3-4天)，將細(xì)胞在補(bǔ)加SCF和Epo的新鮮培養(yǎng)基中以105/ml重懸。在第三個(gè)步驟中(直至第18-21天)，將細(xì)胞在新鮮培養(yǎng)基中在只存在Epo的條件下培養(yǎng)。在第11和14天，將細(xì)胞計(jì)數(shù)分別調(diào)節(jié)為5x10s和1. 5xl06個(gè)細(xì)胞/ml。將培養(yǎng)物維持在37° C及5%C02空氣中，結(jié)果以鋪板后實(shí)際擴(kuò)增率表示。

將細(xì)胞用May-Griinwald-Giemsa及新亞甲藍(lán)試劑(Sigma)染色，以進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，同時(shí)使用 XE2100 自動裝置(Sysmex, Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)監(jiān)測無核細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)血液學(xué)參數(shù)，包括MCV (fL)、MCHC (%)和MCH (pg/細(xì)胞)。流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)將細(xì)胞用未綴合的或者異硫氰酸熒光素(FITC)-或藻紅蛋白(PE)-綴合的抗體標(biāo)記。CD71-FITC抗體和 CD36-FITC抗體(Becton Dickinson, San Jose, CA)、血型糖蛋白 A-PE抗體、CD45-FITC 抗體和 CD34-PE 抗體(Beckman Coulter, Marseille, France)用于表型分型(phenotyping)。一抗人抗-RhD抗體和二抗山羊PE綴合的抗人抗體(Beckman Coulter)用于RhD確定。在FACSCalibur流式細(xì)胞計(jì)量儀(Becton Dickinson)上使用Cell Quest軟件進(jìn)行分析。變形性測量通過經(jīng)過去白細(xì)胞濾膜(LeucolabLCG2, Macopharma, Tourcoing, France)將在培養(yǎng)第18天獲得的網(wǎng)織紅細(xì)胞與有核細(xì)胞分離并通過細(xì)胞變形計(jì)量法(ektacytometry,一種激光衍射方法)檢驗(yàn)無核細(xì)胞。在細(xì)胞變形計(jì)量儀中(Technicon, BayerCorp. , Diagnostics Division, Tarrytown, NY),將細(xì)胞懸浮于4%聚乙烯卩比咯燒酮溶液中，并暴露于增加的滲透梯度^0-450m0sm/Kg)。記錄細(xì)胞的激光衍射模式的改變。這種光度測量產(chǎn)生稱作變形性指數(shù)(DI)的信號。DI曲線的分析提供了對細(xì)胞膜動態(tài)變形性的測量，其是在170達(dá)因/cm2恒定外加剪切應(yīng)力的重量摩爾滲透壓濃度的函數(shù)。DImax,以任意單位表示并且定義為DI的最大值，其通常涉及紅細(xì)胞的平均表面積。Omin定義為重量摩爾滲透壓濃度，在該濃度，在低滲條件下獲得DI最小值并且依賴于起始表面/體積比。0HypCT是重量摩爾滲透壓濃度，在該濃度DI降低為在高滲曲線區(qū)域中一半DImax值，與MCHC反相關(guān)。酶活性將毛地黃皂苷(O. 2%)加入到白細(xì)胞耗竭后獲得的紅細(xì)胞中，用Drabkin’s試劑經(jīng)分光光度法定量Hb。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和丙酮酸激酶活性通過使用分別來自RandoxLaboratories (Crumlin, UK)和 Roche Diagnostics 的 Synchron CX4Beckman 分光光度計(jì)和試劑測量340nm處NADPH吸收的增加率而確定。結(jié)果表示為單位/克Hb。Hb 分析Hb級分用離子交換高效液相色譜分離和定量。在洗滌的細(xì)胞沉淀上用Bio-RadVariant II dual program (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)根據(jù)廠商指導(dǎo)進(jìn)行分析。溶液中氧結(jié)合平衡在70ml張力計(jì)中用Icm徑長比色杯經(jīng)張力測量法確定氧結(jié)合曲線。光譜測量用Cary 50分光光度計(jì)進(jìn)行，溫度用Peltier模塊控制。分析在37°C在含有140mM NaCl和2mM葡萄糖的50mM bis-Tris(pH 7.2)中進(jìn)行。在氮?dú)夥障鲁浞置撗鹾?，紅細(xì)胞懸液在不同氧分壓下經(jīng)使用Hamilton注射器通過橡膠蓋注射已知體積的純氧進(jìn)入張力計(jì)而平衡。飽和分?jǐn)?shù)(fractional saturation)通過模擬可見及Soret區(qū)的吸收光譜為RBC懸液的完全脫氧和充氧光譜的線性組合而評估 ，使用Scientist軟件的最小二乘法擬合程序(MicromathScientific Software, Salt Lake City, UT)。結(jié)果1.1.造血干細(xì)胞分化為網(wǎng)織紅細(xì)胞從衍生自用G-CSF (LK細(xì)胞)動員后的健康供體的外周血的⑶34+HSC開始，設(shè)計(jì)在存在5%溶劑/洗滌劑病毒失活的血漿(S/D血漿)條件下的三步方案。首先，用SCF、IL-3和Epo誘導(dǎo)7天以使細(xì)胞增殖和紅系細(xì)胞定型。其次，用SCF和Epo使紅系細(xì)胞增殖擴(kuò)大
3-4天。在第三個(gè)步驟中，在只存在Epo的條件下維持細(xì)胞直至18-21天至終末成熟。在第18天，獲得⑶34+細(xì)胞平均擴(kuò)大倍數(shù)為66，200 ±24，000倍(圖1)的平穩(wěn)期，及第18天無核細(xì)胞的百分比為74土5%。在此階段，所有細(xì)胞均示出網(wǎng)織紅細(xì)胞特性，通過聚甲炔染料(XE2IOO-Sysmex)流式分析及通過新亞甲藍(lán)染色評定。平均細(xì)胞體積(MCV)為141±6fL，平均細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)為30±2%，平均細(xì)胞血紅蛋白(MCH)為42±lpg。對這個(gè)細(xì)胞群進(jìn)行的免疫學(xué)鑒定證實(shí)細(xì)胞的網(wǎng)織紅細(xì)胞譜(圖2)，其表達(dá)血型糖蛋白A(GPA)、CD71 (運(yùn)鐵蛋白受體)和CD36(血小板糖蛋白IV)，分別為99 ±1%、44±10%和11 ±4%。1.2.產(chǎn)生自造血干細(xì)胞的網(wǎng)織紅細(xì)胞的功能分析為了進(jìn)行精確的功能分析，將在培養(yǎng)第18天獲得的網(wǎng)織紅細(xì)胞通過經(jīng)過去白細(xì)胞濾膜(Leucolab LCG,Macopharma)而與有核細(xì)胞分離。這些網(wǎng)織紅細(xì)胞的葡萄糖_6_磷酸脫氫酶(G6PD)的含量為65±3單位，丙酮酸激酶(PK)水平為94±7單位/g血紅蛋白(Hb),以保持幼同質(zhì)紅細(xì)胞群的性質(zhì)(Jansen et al. Am J Hematol 1985 ;20，203-215)。這表明其能降低谷胱甘肽水平及維持ATP水平，因此保證2，3-二磷酸甘油酯(2，3-DPG)的正常水平。
網(wǎng)織紅細(xì)胞膜變形性通過滲透性掃描細(xì)胞變形計(jì)量法分析，其測量紅細(xì)胞伸長。這產(chǎn)生了稱作變形性指數(shù)(DI)的信號，最大伸長(DImax)是指細(xì)胞的平均表面積(Clark etal. Blood 1983 ;61，899-910和Mohandas et al. J Clin Invest 1980 ;66，563-573)。具有更高平均體積的網(wǎng)織紅細(xì)胞的DImax(O. 63)相應(yīng)于預(yù)期水平并證實(shí)這些細(xì)胞的正常變形性(圖3)。低于80m0sm/kg的Omin表明網(wǎng)織紅細(xì)胞的增大的表面積/體積比率及降低的滲透脆性，而正常Ohype,值(362m0sm/kg)證實(shí)其正常水合。這些數(shù)據(jù)示出在培養(yǎng)的網(wǎng)織紅細(xì)胞中保持流變性質(zhì)。在體外產(chǎn)生的網(wǎng)織紅細(xì)胞含有成人血紅蛋白A(HbA) (96 + 0. 1%)，表明在這些條件下Hb合成的正常過程(圖4)。張力測量氧平衡測量示出網(wǎng)織紅細(xì)胞懸浮液以與天然RBC懸浮液相同方式結(jié)合及釋放氧。網(wǎng)織紅細(xì)胞的氧親和性(P5tl)為28_ Hg，天然RBC的氧親和性為26±1_Hg(Kister et al. J Biol Chem 1987 ;262，12085-12091 和Girard et al. Respir Physiol
1987;68，227-238)，而這兩個(gè)樣品的Hill系數(shù)(n5Q)均等于2. 4±0.1。圖5示出在不同DPG/Hb4比率的氧結(jié)合等溫線(從左至右〈O. 2 ;正常比率& I; 2. 4)，使用MWC模型參數(shù)從氧結(jié)合曲線模擬(Girard et al. Respir Physiol 1987 ;68，227-238)。這些結(jié)果表明網(wǎng)織紅細(xì)胞中2，3-DPG 水平可能接近Hb四聚體濃度，如對于天然RBC糖酵解比率觀測的那樣。與正常濃度相比2，3-DPG的耗竭使P5tl降低兩倍，而在RBC與IOmM葡萄糖延長保溫后2，3-DPG增加使P5tl升高大約60%。實(shí)施例2 :在體外從胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生紅細(xì)胞材料與方法未分化的hESC培養(yǎng)物將hES 細(xì)胞系 Hl (National Institute of Health [NIH] code WAOI,傳代 23-45代)維持在未分化狀態(tài)，通過在補(bǔ)加20%敲除(knockout)血清替代物(Invitrogen)和重組人(rhu) FGF2 (10ng/mL ；Peprotech, Neuilly-sur-Seine, France)的敲除 Dulbecco，s 修改的 Eagle’ s 培養(yǎng)基(DMEM, Invitrogen, Cergy Pontoise, France)中每周在用絲裂霉素(20 μ g/mL ；Sigma, Saint-Quentin Fallavier, France)處理的原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)飼養(yǎng)細(xì)胞上機(jī)械傳代進(jìn)行。擬胚體(EB)形成在第一天,將未分化的hESC用膠原酶IV(lmg/mL ;Invitrogen)處理并轉(zhuǎn)移至低吸附平板(Nunc, Dutscher, Brumath, France)以使得在分化培養(yǎng)基(敲除DMEM培養(yǎng)基，補(bǔ)加20%非熱失活胎牛血清，1%非必需氨基酸，ImML-谷氨酰胺，及0.1mM β-巰基乙醇，Invitrogen)中過夜保溫期間形成擬胚體(EB)。第二天,將EB懸浮于液體培養(yǎng)基(LCM) (IMDM-glutamax, Biochrom, Berlin, Germany)中，所述培養(yǎng)基含有 450 μ g/mL 鐵飽和的人運(yùn)鐵蛋白(Sigma)、10 μ g/mL 胰島素(Sigma)、5% 人血漿和 2U/mL 肝素，存在 SCF、ΤΡ0、FLT3配體(100ng/mL)，rhu 骨形態(tài)發(fā)生蛋白 4(BMP4 ；10ng/mL)，rhuVEGF_A165，IL-3, IL-6 (5ng/mL) (Peprotech)和 Epo (3U/mL) (Eprex, Janssen-Cilag, France 惠贈)(后文稱作 EB 培養(yǎng)基)。將EB在37°C在濕潤的5%C02空氣中培養(yǎng)20天，每2天或3天更換培養(yǎng)基和細(xì)胞因子。通過與膠原酶 B (0. 4U/mL ;Roche Diagnostics, Laval, QC, Canada)在 37°C保溫 30 分鐘及隨后在細(xì)胞解離緩沖液(Invitrogen)中在37°C水浴中保溫10分鐘，隨后輕輕抽吸及經(jīng)過70 μ m篩,從而將細(xì)胞解離為單細(xì)胞懸浮液。cRBC 的產(chǎn)生第0-8天計(jì)數(shù)解離的EB，并在含有10%人血漿和3U/mL肝素的LCM中在存在SCF(100ng/mL)、IL-3(5ng/mL)和 Epo (3U/mL)條件下以 IxlO6 個(gè)細(xì)胞/mL 密度鋪板。在第I天將非貼壁(NA)細(xì)胞(4xl05/mL)和貼壁(AD)細(xì)胞(106/mL)分別接種在相同培養(yǎng)基和細(xì)胞因子中，培養(yǎng)8天。在第4天，將I體積的細(xì)胞培養(yǎng)物用4體積含有SCF、IL-3和Epo的新鮮培養(yǎng)基稀釋。在第8-11天將細(xì)胞以3x105(NA)或IO5(AD)個(gè)細(xì)胞/mL的密度懸浮并在補(bǔ)加SCF和Epo的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在第11-15天將細(xì)胞以106/mL懸浮(NA和AD細(xì)胞)并在補(bǔ)加Epo的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在第15-25天將NA和AD細(xì)胞在含有10%人血漿和Epo的LCM中以2xl06個(gè)細(xì)胞/mL懸浮，或者在貼壁基質(zhì)層上共培養(yǎng)。將該培養(yǎng)物保持在37 °C的5%C02空氣中?；|(zhì)細(xì)胞評估貼壁細(xì)胞層的三個(gè)來源(i)MS_5基質(zhì)細(xì)胞系，(ii)間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(MSC)(Prockop Science 1997 ;276，71-74)，在補(bǔ)加 10% 胎牛血清(FCS)的 alpha MEM 培養(yǎng)基(Invitrogen)中從完全正常成人骨髓建立(貼壁MSC被擴(kuò)增并通過至少兩個(gè)連續(xù)傳代純化)及(iii)來自在含有 20%FCS 的 MDM-glutamax 中在 SCF(50ng/mL)、FLT3_ 配體(30ng/mL)和 TP0(15ng/mL)存在 10 天及 SCF (30ng/mL)、IL-3 (30ng/mL)和 M-CSF (30ng/mL)存在I周的條件下從CD34+骨髓細(xì)胞建立的巨噬細(xì)胞的基質(zhì)細(xì)胞。貼壁細(xì)胞的FACS染色用于證實(shí)CD 14和HLA-DR表達(dá)。半固體培養(yǎng)測定在甲基纖維素培養(yǎng)物中測定BFU-E、CFU-E和CFU-GM祖細(xì)胞。解離的EB的濃度為IxlO5個(gè)細(xì)胞/mL，在培養(yǎng)第7天和14天對集落評分。

未分化的hESC、EB及分化的細(xì)胞的流式細(xì)胞計(jì)量分析將細(xì)胞在含有O. 1%BSA的PBS中制備，及用單克隆抗體(mAb)混合物標(biāo)記。使用具備CellQuest采集軟件的FACSCalibur流式細(xì)胞計(jì)量儀(Becton Dickinson,San Jose, CA，USA)分析樣品。如下抗體用于對未分化的hESC、收獲的解聚的第2-20天EB及分化期間的紅系細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)量分析SSEA4-PE(藻紅蛋白)和SSEAl-PE(Clinisciences, Montrouge, France) ;TRA-1_60, TRA-1-81,山羊抗小鼠 IgM-PE及山羊抗小鼠 IgG-PE(Chemicon, Saint-Quentin en Yvelines, France) ；CD34-PE,CD45-PE, CD45-PC7, CD117-PE， CD71-FITC， CD36-FITC 和 CD235a_PE(血型糖蛋白 A)(Beckman Coulter-1mmunotech, Marseille, France) ；CD133-PE(Miltenyi Biotech,Glodbach, Germany)。門控活細(xì)胞用于分析并且用合適的同種型匹配的對照mAb染色確定陽性染色和背景的閾值。通過層析和質(zhì)譜測量分析cRBC的血紅蛋白組成各個(gè)血紅蛋白級分的百分比通過CE-HPLC測量，使用Bio-Rad VariantII Hb分析儀(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)進(jìn)行。得自培養(yǎng)第 15 天和第 25 天的 hES 細(xì)胞的cRBC中包含的不同球蛋白鏈級分的分離通過反相液體層析(RP-LC)和光譜分析進(jìn)行。在 C4Uptisphere ( 二氧化娃珠 5 μ m ;平均孔徑300A ) (Interchim, Montlufon, France)(4. 6X250mm)上進(jìn)行RP-LC分析。通過兩個(gè)溶劑系統(tǒng)獲得洗脫液(A: 10%CH3CN(乙腈)在O.3%TFA (三氟乙酸)中，及B: 70%CH3CN在O. 3%TFA中)。不同RP-LC峰的積分可以確定每個(gè)分離的球蛋白鏈級分的面積百分比。其鑒別和鑒定在分離和收集球蛋白鏈后通過電噴霧離子化質(zhì)譜分析(ES1-MS)進(jìn)行。將結(jié)果與用產(chǎn)生自人CD34+臍帶血細(xì)胞的cRBC獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行對比。cRBC的血紅蛋白的功能性血紅蛋白(Hb)與一氧化碳的結(jié)合通過閃光光解研究，使用4x10mm光學(xué)比色杯(4mm用于透射光,及IOmm用于激光束)。簡言之，在532nm用10_ns脈沖對配體進(jìn)行光解離之后，在436nm分析CO重結(jié)合Hb四聚體的動力學(xué)(Marden et al. Biochemistry
1988;27，1659-1664)。將RBC在低滲緩沖液中在冰上裂解30分鐘。在15，OOOg離心后，從膜和細(xì)胞碎片中取出含Hb的上清，在Hb樣品中加入IHP(肌醇六磷酸，ImM)。使用Scientist (Micromath)的非線性最小二乘法程序進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合。結(jié)果2.1.以紅系細(xì)胞定型為條件的hESC分化為hEBEB培養(yǎng)基的確定極早地誘導(dǎo)和刺激紅細(xì)胞生成途徑。鑒于加入BMP4看起來是必不可少的(Chadwick et al. Blood 2003 ;102，906-915)及 VEGF-A 165 (Cerdan et al.Blood 2004 ；103，2504-2512)同樣，進(jìn)行8個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)以檢測兩個(gè)其它參數(shù)-細(xì)胞因子和血清類型-的基本作用。在進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)后，定義了以紅系細(xì)胞定型為條件的EB的培養(yǎng)基(稱作EB培養(yǎng)基)。其含有5%混合的人血漿、高濃度運(yùn)鐵蛋白(450 μ g/mL)及8種細(xì)胞因子的混合物SCF、TP0、FLT3 配體 (100ng/mL)、rhu BMP4 (10ng/mL)、rhu VEGF-A165、IL-3、IL-6 (5ng/mL)和Epo(3U/mL)。如在下文章節(jié)中所述，這些培養(yǎng)條件在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)可以獲得最大數(shù)目的成熟的無核RBC。2. 2. hEB的紅系細(xì)胞潛力的確定首先，鑒別具有最佳紅系細(xì)胞潛力的hEB的一或多個(gè)分化階段。根據(jù)(I)通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析造血和紅細(xì)胞生成的特異性標(biāo)志物的表達(dá)及(2)紅系祖細(xì)胞的形成，分析在培養(yǎng)第2-20天期間hEB分化的動力學(xué)。在分化之前，hESC高水平表達(dá)特異于未分化的細(xì)胞的標(biāo)志物，及不表達(dá)或低水平表達(dá)造血標(biāo)志物。未分化的細(xì)胞的這些標(biāo)志物的表達(dá)逐步下降直至第13天，在至第20天保持微弱陽性。⑶34從第2天至第20天表達(dá)，在第9_13天達(dá)峰值KD45從第6天至第20天表達(dá)，在第13天為峰值(圖7)。令人感興趣地，運(yùn)鐵蛋白受體CD71在整個(gè)培養(yǎng)期間表達(dá)，在第6-20天之間高水平表達(dá)。紅系細(xì)胞標(biāo)志物CD36和⑶235a在第13天微弱表達(dá)(圖8)。總之，在第15-20天，hEB明顯表達(dá)研究的造血和紅系細(xì)胞標(biāo)志物⑶45、⑶34、CD71、CD36和⑶235a。同時(shí)，CFC的數(shù)目保持較低，在第15天是一小峰，表明hEB的弱集落生成潛力(圖7)?；谶@些結(jié)果，使用培養(yǎng)第15-20天的hEB進(jìn)行紅系細(xì)胞分化。2. 3. hEB分化/成熟化為cRBC-產(chǎn)生cRBC的方案本發(fā)明人揭示了簡便的優(yōu)化培養(yǎng)條件，包括在存在10%人血漿及基于SCF、IL_3和Epo的細(xì)胞因子進(jìn)化混合物的條件下在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(圖6)。在第15天的最后培養(yǎng)期，檢測對已知其支持造血能力的三種不同基質(zhì)的去核影響鼠源MS5細(xì)胞、人源間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)和巨噬細(xì)胞相對于無基質(zhì)條件。使培養(yǎng)15和20天的hEB解離，將細(xì)胞重懸及培養(yǎng)，根據(jù)成紅細(xì)胞分化/成熟的液體培養(yǎng)方案進(jìn)行。在第I天，可以區(qū)別兩種類型的細(xì)胞，非貼壁細(xì)胞(NA)和貼壁細(xì)胞(AD)，分別代表全部細(xì)胞的10%和90%。將這兩種細(xì)胞類型使用相同方案平行培養(yǎng)。在用MGG染色后根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)定期評估紅細(xì)胞成熟，紅系細(xì)胞膜抗原的表達(dá)通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)確定。2. 4.起始自第15天或第20天hEB的成熟無核cRBC的產(chǎn)生第15天或第20天hEB在4天液體培養(yǎng)之后完成紅系細(xì)胞定型，產(chǎn)生95%以上的成紅細(xì)胞。逐步實(shí)現(xiàn)終末分化/成熟，在第11天呈現(xiàn)出3±2%無核細(xì)胞，在第15天呈現(xiàn)出17±4%無核細(xì)胞，在第18天呈現(xiàn)出31 ±8%無核細(xì)胞及在第21天呈現(xiàn)出48±9%無核細(xì)胞。在第25天培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，該群含有58±2%完全無核RBC(圖9)。無核水平是完全相當(dāng)?shù)?，無論培養(yǎng)的細(xì)胞(NA或AD)、培養(yǎng)條件(有或無基質(zhì))或者基質(zhì)性質(zhì)(MS5、MSC或巨噬細(xì)胞)如何。從第15天或第20天hEB中產(chǎn)生的紅系細(xì)胞能產(chǎn)生cRBC，稱作“無核窗口細(xì)胞”(EWC)。在此液體培養(yǎng)期間唯一顯著的差異是NA細(xì)胞的擴(kuò)增高于AD細(xì)胞的擴(kuò)增(在第20天分別為24-61倍及4-5倍)。因此，起始自衍生自hEB的106細(xì)胞，產(chǎn)生144X106個(gè)紅系細(xì)胞或者82 X 106個(gè)cRBC。2. 5.分析產(chǎn)生自EWC的cRBC -成熟cRBC的膜標(biāo)志物對產(chǎn)生的cRBC的膜抗原進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)量分析證實(shí)其成熟度。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，所有產(chǎn)生的cRBC均強(qiáng)表達(dá)⑶235a和⑶71。⑶36表達(dá)降低而增加細(xì)胞成熟度(在第11天為5%±1，在第25天為7±3%)，RhD抗原在80%以上的細(xì)胞中表達(dá)升高證實(shí)cRBC的高水平膜成熟(圖10)。2.6.cRBC 的大小在第25天液體培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，通過顯微鏡測量cRBC的大小并將其與來自對照成人外周血的RBC相比。在不存在基質(zhì)的條件下或者在MS5細(xì)胞、MSC或巨噬細(xì)胞上共培養(yǎng)之后，cRBC的大小相當(dāng)，平均 直徑IOym(圖11)。2. 7. cRBC的血紅蛋白分析為了分析由cRBC合成的血紅蛋白的類型，將通過反相HPLC和質(zhì)譜分析對球蛋白鏈進(jìn)行的研究與通過HPLC對四聚體血紅蛋白的鑒別相組合。經(jīng)RP-LC和質(zhì)譜鑒別及定量cRBC中的球蛋白鏈經(jīng)RP-LC分離球蛋白鏈允許定量cRBC的血紅蛋白生成1_5% β，19-29% Y -G,36-43% α和11-21% Y-A鏈。還觀察到了在不同實(shí)驗(yàn)中強(qiáng)度可變的兩個(gè)額外峰，從不存在到小于15%，相應(yīng)于胚胎鏈ε和ζ。因此，存在胎兒鏈的大量主要合成(35-50%)，成人鏈的弱生成(2%)和胚胎鏈的可變合成(〈10%)，大約40%是α鏈。這些結(jié)果經(jīng)質(zhì)譜鑒別RP-LC洗脫的級分而證實(shí)，并且與衍生自臍帶血的⑶34+HSC的cRBC獲得的結(jié)果相同(圖12和13)。經(jīng)CE-HPLC研究血紅蛋白合成經(jīng)CE-HPLC分析四聚體Hb顯示合成2. 5%HbA和74_80%HbF，譜與衍生自臍帶血的⑶34+HSC衍生的cRBC獲得的結(jié)果可重疊(圖12和13)。這些結(jié)果與我們用RP-LC和質(zhì)譜的發(fā)現(xiàn)一致，首次證實(shí)在衍生自hESC的cRBC中四聚體形式的胎兒血紅蛋白的合成。2. 8. cRBC血紅蛋白的功能性cRBC血紅蛋白的功能性在閃光光解后經(jīng)配體結(jié)合動力學(xué)評估(圖14)。在CO的光解離后雙分子動力學(xué)提供了血紅蛋白功能的靈敏探針。因此，觀測到兩相，相應(yīng)于用于配體結(jié)合的兩種血紅蛋白四級狀態(tài)。快速成分從R態(tài)四聚體產(chǎn)生，慢成分來自T態(tài)四聚體產(chǎn)生。在高水平光解離下，主要種類是單和雙重配體結(jié)合的，而在低水平主要測量到CO結(jié)合三重配體結(jié)合的種類。因此，對于不同部分配體結(jié)合結(jié)合種類的別構(gòu)平衡可以通過改變光解離水平探查。在正常HbA中的R->T轉(zhuǎn)換發(fā)生在第二個(gè)配體結(jié)合Hb四聚體之后。在存在別構(gòu)效應(yīng)物如IHP時(shí)，轉(zhuǎn)換點(diǎn)在后來發(fā)生并且內(nèi)在R和T親和性也降低。針對來自cRBC的血紅蛋白的CO重結(jié)合動力學(xué)(圖14)幾乎可與胎兒血液樣品的重疊，這與從HPLC分析所預(yù)期的一樣，顯示cRBC中的大量HbF。加入IHP后，R->T轉(zhuǎn)換朝向低親和性四聚體移位，程度與胎兒血液中類似(相同幅度的慢T態(tài)重結(jié)合相)。CO閃光光解實(shí)驗(yàn)因此證實(shí)cRBC中的HbF不僅在生理?xiàng)l件下是有功能 的，而且應(yīng)答強(qiáng)別構(gòu)效應(yīng)物。
權(quán)利要求
1.用于造血譜系細(xì)胞的生長和/或分化的細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含 -胰島素，濃度為I μ g/ml至50 μ g/ml ； -運(yùn)鐵蛋白，濃度為100 μ g/ml至2000 μ g/ml ;以及 -血漿或血清，濃度為1%至30%。
2.權(quán)利要求1的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中胰島素的濃度為8μ g/ml至12 μ g/ml。
3.權(quán)利要求1或2的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中運(yùn)鐵蛋白的濃度為300μ g/ml至500 μ g/ml。
4.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中血漿或血清的濃度為4%至12%。
5.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其進(jìn)一步包含肝素，特別是濃度為O.5UI/ml至5UI/ml，更特別濃度為1. 5UI/ml至3. 5UI/ml。
6.權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其進(jìn)一步包含紅細(xì)胞生成素(Epo)。
7.權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其進(jìn)一步包含干細(xì)胞因子(SCF)。
8.權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其進(jìn)一步包含白細(xì)胞介素-3(IL-3)。
9.權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其進(jìn)一步包含氫化可的松。
10.權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其進(jìn)一步包含選自如下的至少一種化合物血小板生成素(TPO)，F(xiàn)MS-樣酪氨酸激酶3 (FLT3)配體，骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP4)，血管內(nèi)皮生長因子A165 (VEGF-A165)及白細(xì)胞介素_6 (IL-6)。
11.權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含Iscove's Modified Dulbecco' s培養(yǎng)基，任選補(bǔ)加谷氨酰胺或者含有谷氨酰胺的肽。
12.權(quán)利要求1至11任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基在造血譜系細(xì)胞的生長和/或分化中的應(yīng)用。
13.權(quán)利要求12的應(yīng)用，其用于生長造血干細(xì)胞(HSC)及使HSC分化為網(wǎng)織紅細(xì)胞、無核細(xì)胞和/或紅細(xì)胞。
14.權(quán)利要求13的應(yīng)用，其用于生長擬胚體(EB)及使EB分化為網(wǎng)織紅細(xì)胞、無核細(xì)胞和/或紅細(xì)胞。
15.用于生長和/或分化造血譜系細(xì)胞的方法，包括至少一個(gè)用權(quán)利要求1至11任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞的步驟。
16.權(quán)利要求15的方法，用于使HSC分化為網(wǎng)織紅細(xì)胞，所述方法包括 -在第一步驟中，將HSC在包含如下成分的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天 -胰島素，濃度為8 μ g/ml至12 μ g/ml ； -運(yùn)鐵蛋白，濃度為300 μ g/ml至350 μ g/ml ； -血漿，濃度為3%至7%; -肝素，濃度為1. 5UI/ml 至 2. 5UI/ml ； -氫化可的松，濃度為5.1O-7M至5.1O-6M ； -SCF,濃度為 80ng/ml 至 120ng/ml ； -1L-3,濃度為 4ng/ml 至 6ng/ml ；-Epo，濃度為 2. 5UI/ml 至 3. 5UI/ml ； -在第二步驟中，將在第一步驟中獲得的細(xì)胞在包含如下成分的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)3至4天 -胰島素，濃度為8 μ g/ml至12 μ g/ml ；-運(yùn)鐵蛋白，濃度為300 μ g/ml至350 μ g/ml ； -血漿，濃度為3%至7%; -肝素，濃度為1. 5UI/ml 至 2. 5UI/ml ； -氫化可的松，濃度為5.1O-7M至5.1O-6M ； -SCF,濃度為 80ng/ml 至 120ng/ml ；-Epo，濃度為 2. 5UI/ml 至 3. 5UI/ml ； -在第三步驟中，將在第二步驟中獲得的細(xì)胞在包含如下成分的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)直至自第一步驟起第18至21天 -胰島素，濃度為8 μ g/ml至12 μ g/ml ； -運(yùn)鐵蛋白，濃度為300 μ g/ml至350 μ g/ml ； -血漿，濃度為3%至7%; -肝素，濃度為1. 5UI/ml 至 2. 5UI/ml ； -氫化可的松，濃度為5.1O-7M至5.1O-6M ；-Epo，濃度為 2. 5UI/ml 至 3. 5UI/ml ； -從而獲得網(wǎng)織紅細(xì)胞。
17.權(quán)利要求15的方法，用于使EB分化為紅細(xì)胞，所述方法包括 -在第一步驟中，將EB在包含如下成分的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天 -胰島素，濃度為8 μ g/ml至12 μ g/ml ； -運(yùn)鐵蛋白，濃度為425 μ g/ml至475 μ g/ml ； -血漿，濃度為3%至7%; -肝素，濃度為1. 5UI/ml 至 2. 5UI/ml ； -SCF,濃度為 80ng/ml 至 120ng/ml ； -TP0,濃度為 80ng/ml 至 120ng/ml ； -FLT3 配體，濃度為 80ng/ml 至 120ng/ml ； -BMP4,濃度為 8ng/ml 至 12ng/ml ； -VEGF-A165,濃度為 4ng/ml 至 6ng/ml ； -1L-3,濃度為 4ng/ml 至 6ng/ml ； -1L-6,濃度為 4ng/ml 至 6ng/ml ；-Epo，濃度為 2. 5UI/ml 至 3. 5UI/ml ； -在第二步驟中，將在第一步驟中獲得的細(xì)胞解離，并將解離的細(xì)胞在包含如下成分的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)8天 -胰島素，濃度為8 μ g/ml至12 μ g/ml ； -運(yùn)鐵蛋白，濃度為425 μ g/ml至475 μ g/ml ； -血衆(zhòng)，濃度為8%至12%; -肝素，濃度為 2. 5UI/ml 至 3. 5UI/ml ； -SCF,濃度為 80ng/ml 至 120ng/ml ； -1L-3,濃度為 4ng/ml 至 6ng/ml ；-Epo，濃度為 2. 5UI/ml 至 3. 5UI/ml ； -在第三步驟中，將在第二步驟中獲得的細(xì)胞在包含如下成分的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天 -胰島素，濃度為8 μ g/ml至12 μ g/ml ； -運(yùn)鐵蛋白，濃度為425 μ g/ml至475 μ g/ml ； -血衆(zhòng)，濃度為8%至12%; -肝素，濃度為 2. 5UI/ml 至 3. 5UI/ml ； -SCF,濃度為 80ng/ml 至 120ng/ml ；-Epo，濃度為 2. 5UI/ml 至 3. 5UI/ml ； -在第四步驟中，將在第三步驟中獲得的細(xì)胞在包含如下成分的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天 -胰島素，濃度為8 μ g/ml至12 μ g/ml ； -運(yùn)鐵蛋白，濃度為425 μ g/ml至475 μ g/ml ； -血衆(zhòng)，濃度為8%至12%; -肝素，濃度為 2. 5UI/ml 至 3. 5UI/ml ；-Epo，濃度為 2. 5UI/ml 至 3. 5UI/ml ； -在第五步驟中，將在第三步驟中獲得的細(xì)胞(i)在包含如下成分的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天 -胰島素，濃度為8 μ g/ml至12 μ g/ml ； -運(yùn)鐵蛋白，濃度為425 μ g/ml至475 μ g/ml ； -血衆(zhòng)，濃度為8%至12%; -肝素，濃度為 2. 5UI/ml 至 3. 5UI/ml ；-Epo，濃度為 2. 5UI/ml 至 3. 5UI/ml ； 或者(ii)在貼壁基質(zhì)層上培養(yǎng)10天； -從而獲得紅細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于造血譜系細(xì)胞生長和/或分化的細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含-胰島素，濃度為1至50μg/ml；-運(yùn)鐵蛋白，濃度為100μg/ml至2000μg/ml；以及-血漿或血清，濃度為1%至30%。
文檔編號C12N5/0781GK103068972SQ201180015358
公開日2013年4月24日 申請日期2011年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月22日
發(fā)明者L·杜艾, M-C·賈拉塔納 申請人:皮埃爾-瑪麗-居里大學(xué)(巴黎第六大學(xué)), 法國血液研究所, 巴黎公共醫(yī)療救助機(jī)構(gòu)