專利名稱：一種木質(zhì)纖維素糖化水解制備還原糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于木質(zhì)纖維素水解領(lǐng)域，尤其是利用纖維素復(fù)合酶高效降解纖維素為還原糖的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
長期以來，傳統(tǒng)化石能源消耗越來越大，儲量越來越低，而過度利用化石能源，造成嚴(yán)重的溫室效應(yīng)等環(huán)境問題，這成為促進生物質(zhì)能源興起的關(guān)鍵因素。生物能源中，燃料乙醇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展速度快、發(fā)展力度最強，尤其是，以農(nóng)林廢棄物為原料生產(chǎn)燃料乙醇已成為研究開發(fā)的熱點。這類技術(shù)主要包括木質(zhì)纖維素水解糖化、酒精發(fā)酵及乙醇的提純。其中，木質(zhì)纖維素的糖化水解形成還原糖，是技術(shù)關(guān)鍵步驟，它占整個燃料乙醇生產(chǎn)成本的50%，制約著整個纖維素制備乙醇技術(shù)的發(fā)展進程。目前，纖維素制乙醇技術(shù)領(lǐng)域的關(guān)鍵，則主要集中于 原料預(yù)處理、優(yōu)化酶的復(fù)配及激活劑的添加等方面。所研究的最終目的都是為了降低酶的用量，提高還原糖得率及纖維素轉(zhuǎn)化率以及經(jīng)濟效益。由于木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，細(xì)胞壁中的半纖維素和木質(zhì)素通過共價鍵聯(lián)結(jié)成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，纖維素鑲嵌其中，造成纖維素復(fù)合酶與纖維素的有效接觸面積減少；而且纖維素本身的結(jié)晶結(jié)構(gòu)使纖維素聚合物顯示出剛性和高度水不溶性，更增加了纖維素的降解難度。因此，對天然纖維素進行預(yù)處理的目的是，改變該木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)，適度破壞纖維素、半纖維素及木質(zhì)素之間的難以被破壞的連接區(qū)域，降低纖維素的結(jié)晶度，降低木質(zhì)素的含量，增加原料的疏松性，以增加纖維素酶系與纖維素的有效接觸面積，從而提高還原糖得率。玉米芯是剝?nèi)∮衩最w粒后的殘余物，是一種木質(zhì)纖維素，通常采用燃燒、堆肥等處理方法得到部分利用。這種玉米芯經(jīng)過機械破碎形成50 200目顆粒材料，該顆粒材料采用堿與過氧化物處理后，形成可酶解的纖維素原料。現(xiàn)有技術(shù)用于纖維素預(yù)處理的常用方法有:酸、堿水解、蒸汽爆破、高溫水熱等。纖維素復(fù)合酶的水解過程受水解溫度、pH值、水解時間及底物性質(zhì)與反應(yīng)質(zhì)量濃度等因素的影響。因此，篩選合適的反應(yīng)條件，可以使纖維素復(fù)合酶得到最大化的利用。此外，酶的用量也非常關(guān)鍵，它直接制約著燃料乙醇的生產(chǎn)成本。采用酶的復(fù)配，如添加β -葡聚糖酶，不僅彌補了纖維素復(fù)合酶中β -葡聚糖酶酶活低的缺陷，而且可以避免產(chǎn)物抑制引起的纖維素轉(zhuǎn)化率低?，F(xiàn)有技術(shù)如專利CN1806945公開了一種利用秸桿預(yù)處理和酶解工藝使秸桿纖維素酶解的方法。秸桿首先經(jīng)汽爆處理，然后用熱水洗滌，除去半纖維素多糖，干燥后與離子液體混合，微波加熱或直接加熱，然后將處理后的秸桿用水反復(fù)沖洗，洗滌液中的溶劑可通過蒸餾等方法回收。沖洗干凈的處理秸桿在50.0°C，ρΗ4.8的緩沖液中用纖維素酶解48.0 72.0小時，纖維素的酶解率達100%，但汽爆處理能耗較大，且設(shè)備要求高，成本較聞?，F(xiàn)有技術(shù)如專利CN102115994公開了一種木質(zhì)纖維素原料的處理方法，該方法通過粉碎，高度分散和高壓破碎將木質(zhì)纖維素原料分散到粒徑為10 40 μ m,并通過酶的復(fù)配，添加β -葡聚糖酶和木聚糖酶，最終使水解率達95 % 98 %，但該方法預(yù)處理能耗大，預(yù)處理并沒有使半纖維素得到有效的分離，經(jīng)木聚糖酶得到的木糖，在后續(xù)的發(fā)酵過程中不能得到有效的利用。針對木質(zhì)纖維素的水解糖化工藝，現(xiàn)有技術(shù)存在的問題可歸結(jié)為:(I)大多數(shù)預(yù)處理工藝對設(shè)備要求高，能耗高，成本高，并且不能將半纖維素得到很好的分離和利用。(2)大多數(shù)工藝中，未對纖維素復(fù)合酶的最佳反應(yīng)條件進行試驗，造成酶不能得到有效利用。
(3)現(xiàn)有技術(shù)采用酶的復(fù)配技術(shù)，所添加酶的種類較多，但其應(yīng)用有效性和成本沒有得到充分考慮。這些現(xiàn)有技術(shù)的問題導(dǎo)致迄今仍不能規(guī)模化有效處理和經(jīng)濟性轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素，顯著降低現(xiàn)有技術(shù)的創(chuàng)造性和實用性。由于木質(zhì)纖維素各品種之間結(jié)構(gòu)的差異性以及半纖維素形態(tài)與分布的不同，對它們采用的處理方法也不相同。尤其是，處理木屑與處理玉米芯的方法，就有很大差異。針對現(xiàn)有技術(shù)的問題，尤其是現(xiàn)有處理木質(zhì)纖維素技術(shù)未能有效利用酶的問題，本發(fā)明技術(shù)提出在預(yù)處理木質(zhì)纖維素時采用非離子型表面活性劑，促進酶的有效分散，主要是基于纖維素復(fù)合酶與反應(yīng)底物中的木質(zhì)素?zé)o效吸附，會造成部分酶的失活問題而提出的有效方法。本發(fā)明所述的非離子型表面活性劑，可以優(yōu)先與木質(zhì)素進行吸附結(jié)合，優(yōu)先占據(jù)木質(zhì)素活性反應(yīng)位置產(chǎn)生占位效應(yīng)，避免了酶的浪費，減少了纖維素的轉(zhuǎn)化成本，提高還原糖的得率。

發(fā)明內(nèi)容
為了最大化的利用纖維素復(fù)合酶，降低成本，提高纖維素轉(zhuǎn)化率及還原糖得率，本發(fā)明對木質(zhì)纖維素采用2 步法的預(yù)處理工藝，所述的預(yù)處理過程為:在IL圓底燒瓶中，力口入一定量的木質(zhì)纖維素，加入濃度為1.2%氫氧化鈉和濃度為0.225%雙氧水，以1: 20固液比加入蒸餾水，溫度70.(TC，轉(zhuǎn)速300r/min，反應(yīng)3.0小時。離心后，倒掉上清液，以固液比為1: 20加入濃度1.0%的稀硫酸，溫度120.(TC，反應(yīng)1.0小時，用堿調(diào)節(jié)pH至7.0
9.0,干燥備用。所述的一種木質(zhì)纖維素糖化水解制備還原糖的方法，其特征在于所述的木質(zhì)纖維素原料為由經(jīng)2步法預(yù)處理得到的玉米芯，該預(yù)處理玉米芯的過程為:將玉米芯材在低于100.(TC烘干后粉碎至80目，用濃度1.2%氫氧化鈉和濃度0.225%雙氧水于70.(TC水浴中處理3.0小時，過濾，烘干得到初級處理產(chǎn)品；該產(chǎn)品用濃度1.0%的稀硫酸120.(TC處理
1.0小時，并用堿調(diào)至pH為7.0 9.0，再經(jīng)烘干即得到2步法預(yù)處理的玉米芯。利用上述預(yù)處理得到的玉米芯纖維素，設(shè)計處理2步法預(yù)處理反應(yīng)過程。利用正交實驗方法優(yōu)化實驗組成及酶反應(yīng)過程，分析優(yōu)化合適的酶反應(yīng)條件，添加β -葡聚糖酶和非離子型表面活性劑，提高纖維素復(fù)合酶的利用率。所述的一種木質(zhì)纖維素糖化水解制備還原糖的方法，其特征在于所述的復(fù)合酶用量為 15.0 120.0FPU/g ο所述的一種木質(zhì)纖維素糖化水解制備還原糖的方法，其特征在于所述的底物質(zhì)量濃度為10.0 200.0g/L
所述的一種木質(zhì)纖維素糖化水解制備還原糖的方法，其特征在于所述的反應(yīng)溫度為 30.0 70.(TC所述的一種木質(zhì)纖維素糖化水解制備還原糖的方法，其特征在于所述的反應(yīng)pH值為3.5 5.5。所述的一種木質(zhì)纖維素糖化水解制備還原糖的方法，其特征在于所述的反應(yīng)時間為 6.0 72.0h0所述的一種木質(zhì)纖維素糖化水解制備還原糖的方法，其特征在于，所采用的氫氧化鈉濃度為1.2%，雙氧水濃度為0.225%。實施例中還原糖的測定采用DNS法。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的描述，但本發(fā)明的實施方式并不僅局限于此。實施例1 玉米芯粉碎成80目粉末，加入濃度1.2%的氫氧化鈉和濃度0.225%的雙氧水，于70.(TC水浴中處理3.0小時，過濾，烘干；用濃度1.0 %的稀硫酸于120.(TC油浴處理1.0小時，并用堿調(diào)至pH為7.0 9.0，烘干即可。實施例2配制好pH為4.8的檸檬酸-磷酸緩沖液，稱取質(zhì)量濃度為40.0g/L的2步法預(yù)處理的玉米芯分散在緩沖液中，加入30.0FPU/g的纖維素復(fù)合酶，置于搖床中45.(TC，轉(zhuǎn)速150r/min,反應(yīng)48.0h,還原糖得率為30.7 %。實施例3步驟如實施例2，只是將酶用量改為45.0FPU/g,其還原糖得率為48.0%。實施例4步驟如實施例2，只是將酶用量改為60.0FPU/g,其還原糖得率為56.8%。實施例5步驟如實施例2，只是將酶用量改為75.0FPU/g，其還原糖得率為61.0%。實施例6步驟如實施例2，只是將酶用量改為90.0FPU/g,其還原糖得率為58.9%。實施例7配制pH為4.8的檸檬酸-磷酸緩沖液，稱取質(zhì)量濃度為20.0g/L的2步法預(yù)處理的玉米芯分散在緩沖液中，加入75.0FPU/g的纖維素復(fù)合酶，置于搖床中45.(TC，轉(zhuǎn)速150r/min,反應(yīng)48.0h,還原糖得率為58.9 %。實施例8步驟如實施例7，將底物質(zhì)量濃度改變?yōu)?0.0g/L,還原糖得率為61.0%。實施例9步驟如實施例7，將底物質(zhì)量濃度改變?yōu)?0.0g/L,還原糖得率為60.5%。實施例10步驟如實施例7，將底物質(zhì)量濃度改變?yōu)?0.0g/L,還原糖得率為56.6%。
實施例11步驟如實施例7，將底物質(zhì)量濃度改變?yōu)?00.0g/L,還原糖得率為53.0%。實施例12配制好pH為3.6的檸檬酸-磷酸緩沖液，稱取質(zhì)量濃度為40.0g/L的2步法預(yù)處理的玉米芯分散在緩沖液中，分別加入75.0FPU/g的纖維素復(fù)合酶，置于搖床中45.(TC，轉(zhuǎn)速150r/min，反應(yīng)48.0h，實驗所得的還原糖得率為46.8%。實施例13步驟如實施例12，所述的緩沖液的pH值為4.0，實驗所得的還原糖得率為55.9%。實施例14步驟如實施例12，所述的緩沖液的pH值為4.4，實驗所得的還原糖得率為60.2%。實施例15步驟如實施例12，所述的緩沖液的pH值為4.8，實驗所得的還原糖得率為61.0%。實施例16步驟如實施例12，所述的緩沖液的pH值為5.2，實驗所得的還原糖得率為51.0%。實施例17配制好pH為4.8的檸檬酸-磷酸緩沖液，稱取質(zhì)量濃度為40.0g/L的2步法預(yù)處理的玉米芯分散在緩沖液中，加入75.0FPU/g的纖維素復(fù)合酶，置于搖床中35.(TC，轉(zhuǎn)速150r/min，反應(yīng)48.0h，還原糖得率為54.4%。實施例18步驟如實施例17，只改變溫度為40.(TC，還原糖得率為58.7%。實施例19步驟如實施例17，只改變溫度為45.(TC，還原糖得率為61.0%。實施例20步驟如實施例17，只改變溫度為50.(TC，還原糖得率為64.1 %。實施例21步驟如實施例17，只改變溫度為55.(TC，還原糖得率為51.9%。實施例22配制好pH為4.8的檸檬酸-磷酸緩沖液，稱取質(zhì)量濃度為40.0g/L的2步法預(yù)處理的玉米芯分散在緩沖液中，加入75.0FPU/g的纖維素復(fù)合酶，置于搖床中45.(TC，轉(zhuǎn)速150r/min，反應(yīng)時間為6.0h，實驗得到的還原糖得率為43.8%。實施例23
實驗步驟如實施例22，只是將反應(yīng)時間確定為12.0h,實驗得到的還原糖得率為54.7%。實施例24實驗步驟如實施例22，只是將反應(yīng)時間確定為24.0h,實驗得到的還原糖得率為56.5%。實施例25實驗步驟如實施例22，只是將反應(yīng)時間確定為36.0h,實驗得到的還原糖得率為59.3%。
實施例26實驗步驟如實施例22，只是將反應(yīng)時間確定為48.0h,實驗得到的還原糖得率為61.0%。實施例27配制好pH為4.8的檸檬酸-磷酸緩沖液，稱取質(zhì)量濃度為40.0g/L的2步法預(yù)處理的玉米芯分散在緩沖液中，加入75.0FPU/g的纖維素酶，再加入1.5CBU/g β -葡聚糖酶置于搖床中50.(TC，轉(zhuǎn)速150r/min，反應(yīng)48.0h，實驗得到的還原糖得率為71.5%實施例28實驗步驟如實施例27，只是將β -葡聚糖酶加量改變?yōu)?.5CBU/g,實驗得到的還原糖得率為73.2%。實施例29實驗步驟如實施例27，只是將β -葡聚糖酶加量改變?yōu)?.5CBU/g,實驗得到的還原糖得率為73.8%。
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實施例30實驗步驟如實施例27，只是將β -葡聚糖酶加量改變?yōu)?.5CBU/g,實驗得到的還原糖得率為75.1 %。實施例31實驗步驟如實施例27，只是將β -葡聚糖酶加量改變?yōu)?.5CBU/g,實驗得到的還原糖得率為75.7%。實施例32實驗步驟如實施例27，只是將β -葡聚糖酶加量改變?yōu)?.5CBU/g,實驗得到的還原糖得率為78.1 %。實施例33實驗步驟如實施例27，只是將β -葡聚糖酶加量改變?yōu)?.5CBU/g,實驗得到的還原糖得率為76.9%。實施例34實驗步驟如實施例27，只是將β -葡聚糖酶加量改為8.5CBU/g,實驗得到的還原糖得率為76.0%。實施例35配制好pH為4.8的檸檬酸-磷酸緩沖液，稱取質(zhì)量濃度為40.0g/L的2步法預(yù)處理的玉米芯分散在緩沖液中，加入75.0FPU/g的纖維素酶和6.5CBU/g β -葡聚糖酶，然后加Λ 0.075g/g的聚乙二醇置于搖床中50.(TC，轉(zhuǎn)速150r/min，反應(yīng)48.0h，所得的還原糖得率為 80.5%。實施例36實驗步驟如實施例35，只是將聚乙二醇加量改變?yōu)?.150g/g，所得的還原糖得率為 86.4%0實施例37實驗步驟如實施例35，只是將聚乙二醇加量改變?yōu)?.225g/g，所得的還原糖得率為 89.3%。
實施例38實驗步驟如實施例35，只是將聚乙二醇加量改變?yōu)?.300g/g，所得的還原糖得率為 89.5%。實施例39實驗步驟如實施例35，只是將聚乙二醇加量改變?yōu)?.375g/g，所得的還原糖得率為 89.8%比較例I玉米芯原料烘干，粉碎至80目，備用。配制好pH為4.8的檸檬酸-磷酸緩沖液，稱取質(zhì)量濃度為40.0g/L的玉米芯分散在上述配制的緩沖液中，加入75.0FPU/g的纖維素酶，置于搖床中45.(TC，轉(zhuǎn)速150r/min，反應(yīng)48.0h，還原糖得率為35.2%。比較例2玉米芯原料烘干，粉碎至80目，加入濃度1.2%的氫氧化鈉和濃度0.225%的雙氧水，于70.(TC水浴中處理3.0小時，過濾，烘干。配制好pH為4.8的檸檬酸-磷酸緩沖液，稱取質(zhì)量濃度為40.0g/L的上述堿氧處理玉米芯分散在配制的緩沖液中，加入75.0FPU/g的纖維素酶，置于搖床中45.(TC，轉(zhuǎn)速150r/min，反應(yīng)48.0h，還原糖得率為58.2%。比較例3玉米芯原料烘干，粉碎至80目，加入濃度1.0%的稀硫酸120.(TC油浴處理1.0小時，并用堿調(diào)至pH為7.0 9.0，烘干備用。配制好pH為4.8的檸檬酸-磷酸緩沖液，稱取質(zhì)量濃度為40.0g/L的上述稀硫酸處理玉米芯分散在配制的緩沖液中，加入75.0FPU/g的纖維素酶，置于搖床中45.(TC，轉(zhuǎn)速150r/min，反應(yīng)48.0h，還原糖得率為51.3%。表1實施例2-權(quán)利要求
1.一種木質(zhì)纖維素糖化水解制備還原糖的方法，其特征在于所述的木質(zhì)纖維素是采用2步法預(yù)處理木質(zhì)纖維素，預(yù)處理木質(zhì)纖維素的質(zhì)量組成為: 纖維素35 50% ;半纖維素20 35% ;木質(zhì)素15 25%及其它； 所述的2步法預(yù)處理木質(zhì)纖維素的處理劑組成(按質(zhì)量份為):堿0.5~2.0過氧化物0.02 0.5硫酸0.5 6.0木質(zhì)纖維素100.0 按上述處理劑的組成，進行木質(zhì)纖維素的2步法預(yù)處理過程為:在IL圓底燒瓶中，加入一定量的木質(zhì)纖維素，加入濃度為0.5% 2.0% (優(yōu)選1.2%)氫氧化鈉和濃度為0.02% 0.5% (優(yōu)選0.225% )雙氧水，以1: 20固液比加入蒸餾水，溫度70.(TC，轉(zhuǎn)速300171^11，反應(yīng)3.0小時。離心后，倒掉上清液，以固液比為1: 20加入濃度為0.5% 6.0% (優(yōu)選1.0%)的稀硫酸，溫度120.(TC，反應(yīng)1.0小時，用堿調(diào)節(jié)pH至7.0 9.0，干媒備用； 然后，將2步法預(yù)處理的木質(zhì)纖維素分散于檸檬酸與磷酸組成的緩沖溶液中，加入下列所述組分，其質(zhì)量份為:2步法預(yù)處理的纖維素g/L10.0-200.0纖維素復(fù)合酶FPU/g15.0 120.0 β-葡聚糖酶 CBU/g1.5-8.5非離子表面活性劑g/g0.075 0.375反應(yīng)溫度°C30.0-70.0pH3.5 5.5 反應(yīng)時間h6.0-72.0 按上述組份添加后，進行木質(zhì)纖維素的酶解過程:在IOOml三角瓶中，加入2步法預(yù)處理的木質(zhì)纖維素10.0 200.0g/L，纖維素復(fù)合酶15.0 120.0FPU/g (相對于底物的添加量)，β -葡聚糖酶1.5 8.5CBU/g(相對于底物的添加量)，聚乙二醇0.075 0.375g/g(相對于底物的添加量)，調(diào)整反應(yīng)液pH為3.5 5.5,置于搖床反應(yīng)器內(nèi)，設(shè)置溫度為30.0 70.(TC，轉(zhuǎn)速150r/min，反應(yīng)時間6.0 72.0h，得到還原糖溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，其特征是將木質(zhì)纖維素的預(yù)處理與糖化水解方法組合，形成組合一體的工藝方法。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種木質(zhì)纖維素糖化水解制備還原糖的方法，其特征在于所述的木質(zhì)纖維素質(zhì)量濃度為10.0 200.0g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種木質(zhì)纖維素糖化水解制備還原糖的方法，其特征在于所述的纖維素復(fù)合酶用量為15.0 120.0FPU/g。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種木質(zhì)纖維素糖化水解制備還原糖的方法，其特征在于所述的反應(yīng)溫度為30.0 70.0℃。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種木質(zhì)纖維素糖化水解制備還原糖的方法，其特征在于所述的反應(yīng)PH值為3.5 5.5。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種木質(zhì)纖維素糖化水解制備還原糖的方法，其特征在于所述的反應(yīng)時間為6.0 72.0h。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種木質(zhì)纖維素糖化水解制備還原糖的方法，其特征在于所述的非離子表面活性劑為聚乙二醇。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種木質(zhì)纖維素糖化水解制備還原糖的方法，其特征在于所述的木質(zhì)纖維素原料為玉米芯。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種木質(zhì)纖維素糖化水解制備還原糖的方法，其特征在于采用玉米芯，經(jīng)2步法預(yù)處理和水解糖化后，形成的以還原糖為主成份的水解液，用于直接發(fā)酵制備乙 醇。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種木質(zhì)纖維素糖化水解制備還原糖的方法，首先，通過堿氧預(yù)處理與硫酸預(yù)處理的2步法預(yù)處理纖維素原料，再優(yōu)選纖維素復(fù)合酶質(zhì)量份為15.0～120.0FPU/g及其最佳反應(yīng)條件，加入β-葡聚糖酶質(zhì)量份為1.5～8.5CBU/g和表面活性劑質(zhì)量份為0.075～0.375g/g在緩沖液反應(yīng)，促進預(yù)處理纖維素的反應(yīng)，實現(xiàn)木質(zhì)纖維素的高效糖化水解。本發(fā)明在纖維素復(fù)合酶水解的最佳反應(yīng)條件下，采用β-葡聚糖酶，彌補纖維素復(fù)合酶中β-葡聚糖酶酶活低的缺陷，非離子表面活性劑避免了纖維素酶與木質(zhì)纖維素中木質(zhì)素的吸附，使纖維素復(fù)合酶水解纖維素的效率提高，還原糖轉(zhuǎn)化率可達89.8％，所制成的還原糖用于直接發(fā)酵制乙醇，形成乙醇新能源的重要技術(shù)方法。
文檔編號C12P7/10GK103184258SQ20111044921
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者柯?lián)P船, 呂海丹 申請人:中國石油大學(xué)(北京)