專利名稱：農(nóng)用抗生素多氧霉素p及其生物合成方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種農(nóng)用抗生素多氧霉素P及其生物合成方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多氧霉素是由可可鏈霉菌(Sti^ptomyces cacaoi)產(chǎn)生的核苷肽類抗生素，由核苷和肽基兩部分通過肽鍵縮合而成(

圖1)。由于它在結(jié)構(gòu)上與幾丁質(zhì)合成酶的天然底物 UDP-N-乙酰葡萄糖胺類似，因此能夠競爭性地抑制幾丁質(zhì)的合成，從而抑制真菌、昆蟲等的生長。多氧霉素已經(jīng)作為ー種重要的農(nóng)用抗真菌抗生素進行了大規(guī)模的應(yīng)用，用于防治稻瘟病、梨黒斑病、蘋果斑點落葉病和白粉病、煙草赤星病、蔬菜白粉病、菌核病等真菌性植物 ラ丙ゼ。尼可霉素(Nikkomycin)是由圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces ansochromogenes 7100)產(chǎn)生的ー種核苷肽類抗真菌抗生素，結(jié)構(gòu)與多氧霉素非常類似(圖1)。在尼可霉素生物合成途徑中，SanN催化肽基部分的前體吡啶酰CoA形成吡啶醛。在sanN基因阻斷突變株(AsanN)中，由于肽基部分合成的阻斷而喪失了產(chǎn)生尼可霉素的能力，但是核苷部分的合成不受影響。且在多氧霉素生物合成基因簇中，并不存在sanN的同源基因，不會由于同源基因的互補導(dǎo)致尼可霉素的恢復(fù)產(chǎn)生，從而降低了分離純化的難度。多氧霉素的核苷部分為5-氨基己糖醛酸以N-糖苷鍵連接尿嘧啶，在尿嘧啶C-5 位經(jīng)常有甲基、羧基、羥甲基等修飾。而其肽基部分N端氨基酸為CP0AA，C端氨基酸為Ρ0ΙΑ， 它們分別以肽鍵與核苷部分相連，形成多種多氧霉素組分(多氧霉素A-M)。這些多氧霉素組分均易溶于水，難溶于甲醇、乙醇、丁醇、丙酮、氯仿、苯、乙醚等常見有機溶剤。不同結(jié)構(gòu)的多氧霉素對不同真菌的抑制作用存在差異。因此，為了擴大多氧霉素的抑菌譜范圍，合成新的多氧霉素組分是必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的ー個目的是提供ー種化合物。本發(fā)明提供的化合物，其結(jié)構(gòu)式為如下式1
權(quán)利要求
1. ー種化合物，其結(jié)構(gòu)式為如下式1
2.ー種制備權(quán)利要求1所述化合物的方法，包括如下步驟發(fā)酵圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(Sti^ptomyces ansochromogenes) 7100 Δ sanN/pol，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到權(quán)利要求1所述化合物；所述圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(Sti^ptomyces ansochromogenes) 7100 Δ sanN/pol 為將質(zhì)粒 pPOL導(dǎo)入圈卷產(chǎn)色鏈霉菌sanN阻斷突變株Δ sanN中得到的重組菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在干所述圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(Sti^ptomyces ansochromogenes) 7100 Δ sanN/pol 的保藏號為 CGMCC No. 5520 ；所述發(fā)酵的溫度為觀で，所述發(fā)酵時間為4天-6天；所述發(fā)酵為震蕩培養(yǎng)，所述震蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為220rpm，所述震蕩培養(yǎng)的旋轉(zhuǎn)半徑為30mm。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于在所述收集發(fā)酵產(chǎn)物的步驟后，還包括如下步驟1)將所述發(fā)酵產(chǎn)物離心取上清液、過濾，收集濾液；2)將步驟1)得到的濾液經(jīng)乙酸乙酯萃取，收集水相，濃縮，得到濃縮液；3)將步驟幻得到的濃縮液經(jīng)吸附樹脂純化，收集流穿液；4)將步驟幻得到的流穿液經(jīng)陽離子交換樹脂純化，收集洗脫液；5)將步驟4)得到的洗脫液經(jīng)無水乙醇沉淀、離心、沉淀溶解、過濾，收集濾液1；6)將步驟幻得到的濾液1經(jīng)HPLC純化，收集洗脫液，得到權(quán)利要求1所述的化合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述離心的時間為5min-10min，所述離心的離心カ為4000g_8000g ；所述過濾采用孔徑為3mm濾紙；步驟幻中，所述乙酸乙酯和所述濾液的體積比為1 3，萃取3次；所述濃縮為旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮；步驟幻中，所述吸附樹脂純化為將所述濃縮液經(jīng)大孔吸附樹脂HP20分離，收集流穿液；所述分離的流速為15ml/min ；步驟4)中，所述陽離子交換樹脂純化為將所述流穿液經(jīng)強酸性陽離子交換樹脂Dowex 50WX 2分離，用0. 4M氨水洗脫，所述洗脫流速為8ml/min-10ml/min ；步驟5)中，所述沉淀的溫度為4°C，所述沉淀的時間為12h，所述離心的溫度為4°C，所述離心的離心カ為8000g-13000g，所述離心的時間為20min ；所述溶解采用的溶劑為水，所述過濾采用2.2μπι微孔濾膜；步驟6)中，所述HPLC純化為將所述濾液1經(jīng)HPLC分離，用體積比為90 10的三氟乙酸水溶液和甲醇組成的混合物進行洗脫，收集洗脫液為收集15. Omin-15. 5min的洗脫液； 所述洗脫的流速0. 3ml/min，所述三氟乙酸溶液為體積濃度為1%。的三氟乙酸水溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于步驟1)中，在所述過濾前，還包括將所述上清液調(diào)PH值至4. 5后靜置12h的步驟；在所述步驟3)和步驟4)間，還包括將所述流穿液調(diào)pH至4. 5的步驟；在步驟4)和步驟5)之間，還包括將所述洗脫液調(diào)解pH值至4.5的步驟。
7.一種重組菌，為將質(zhì)粒pPOL導(dǎo)入圈卷產(chǎn)色鏈霉菌sanN阻斷突變株AsanN中得到的重組菌。
8.圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(Sti^ptomycesansochromogenes) 7100 Δ sanN/pol，其保藏號為 CGMCC No. 5520。
9.一種抑菌劑，其活性成分為權(quán)利要求1所述的化合物或權(quán)利要求2-6中任一所述的方法中的所述圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(Str印tomyces ansochromogenes) 7100 Δ sanN/pol發(fā)酵產(chǎn)物或權(quán)利要求7所述的重組菌或權(quán)利要求8所述的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces ansochromogenes)7100 Δ sanN/pol CGMCC No. 5520 ；所述菌具體為長柄鏈格孢 OUternaria longipes)。
10.權(quán)利要求1所述的化合物或權(quán)利要求2-6中任一所述的方法中的所述圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces ansochromogenes) 7100 Δ sanN/pol發(fā)酵產(chǎn)物或權(quán)利要求7所述的重組菌或權(quán)利要求8所述的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(Str印tomyces ansochromogenes) 7100 Δ sanN/ pol CGMCC No. 5520在抑菌和/或制備抑菌劑中的應(yīng)用；所述菌具體為長柄鏈格孢 OUternaria longipes)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種農(nóng)用抗生素多氧霉素P及其生物合成方法與應(yīng)用。本發(fā)明提供了的化合物，其結(jié)構(gòu)式為如下式1本發(fā)明還提供了一種制備上述化合物的方法，包括如下步驟發(fā)酵重組菌7100ΔsanN/pol，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到上述化合物；上述重組菌7100ΔsanN/pol為將pPOL導(dǎo)入圈卷產(chǎn)色鏈霉菌sanN阻斷突變株中得到的重組菌。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提供了一種新的化合物——多氧霉素P，其為發(fā)酵重組菌7100ΔsanN/pol制備得到的發(fā)酵產(chǎn)物，該化合物具有抑制真菌生長的活性。
文檔編號C12R1/465GK102532277SQ20111044111
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者李磊, 李金娥, 譚華榮 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所