專利名稱：一種基于雙酶偶聯(lián)高通量檢測微生物生產(chǎn)乙醇和c3-c6正烷醇的新方法
—種基于雙酶偶聯(lián)高通量檢測微生物生產(chǎn)乙醇和C3-C6正烷醇的新方法技術領域
本發(fā)明屬于工業(yè)微生物篩選和開發(fā)利用領域，特別涉及一種基于雙酶偶聯(lián)反應的高通量檢查微生物生產(chǎn)乙醇和C3-C6正烷醇的檢測方法。技術背景
過去的200多年，建立在煤炭、石油、天然氣等化石燃料基礎的能源體系極大地推動了人類社會的發(fā)展。然而近年來，由于石油、天然氣、煤炭等能源的過量開采與消耗，世界已面臨嚴重的能源危機，而且國際原油價格攀升不下，對石油需求量日益大增，自1993年我國首次成為石油產(chǎn)品凈進口國以來，2010年全年原油進口 21，845萬噸，所以尋找清潔、廉價、可再生的替代能源成為未來能源戰(zhàn)略的關鍵。燃料乙醇和燃料丁醇被認為是可以代替石油、煤炭等化石燃料
作為替代高污染化石燃料的理想選擇，生物燃料早已受到世界各國重視。近年來，美國、巴西、韓國、印尼等國家以及歐盟都相繼出臺了支持生物燃料普及的能源發(fā)展戰(zhàn)略。歐盟計劃到2020年用生物燃料替代20%化石燃料。美國的《國家生物燃料行動計劃》也提出，2020年生物燃料將占其能源總消費量的25%，2050年達到50%。燃料乙醇、燃料丁醇是由生物資源經(jīng)過一系列的物理、生物、化學變化過程而獲得的可再生燃料，具有熱值高、性能好、使用便捷等優(yōu)點。丙醇、戊醇和己醇均是良好的化工原料，廣泛應用于涂料、印刷油墨、日化用品、醫(yī)藥和農(nóng)藥中間體的生產(chǎn)以及合成飼料添加劑和香料等。實現(xiàn)生物燃料生產(chǎn)的核心是獲得性能優(yōu)良的微生物菌種。
在微生物代謝過程中，乙醇作為產(chǎn)物被釋放到培養(yǎng)基中，為了驗證微生物的產(chǎn)乙醇能力，需要測定培養(yǎng)基中的乙醇含量。目前乙醇測定的常用方法主要包括比重法、比色法、氣相色譜法和液相色譜法。比重法操作簡便，可用于高含量乙醇測定，但對乙醇測定特異性，但是微生物代謝過程中，產(chǎn)生的乙醇含量很難達到比重法檢測的最低限；比色法，如重鉻酸鉀比色法和碘量法，顯色緩慢且不穩(wěn)定，受多種因素干擾，操作較為繁瑣；色譜法能檢測微量乙醇，精密度和準確性很高，但儀器昂貴、操作和維護繁瑣。另外，還有紅外光譜、熒光和激光拉曼光譜等乙醇分析方法的報道，但仍處于實驗室研究階段。另外利用醇脫氫酶可以檢測乙醇含量，但是醇脫氫酶需要依賴于NDA+，但是NDA+相當昂貴，且需要在340nm出測定吸光值，因此就需要紫外檢測器，增加了檢測的費用。因此，尋求簡便、快速、準確和應用廣泛的乙醇分析方法倍 受重視。
目前產(chǎn)乙醇菌株的篩選方法比較單一，有報道，根據(jù)TTC(2，3，5_氯化三苯基四氮唑)的顯色反應進行篩選。TTC是一種顯色劑,氧化還原色素,溶于水中成為無色溶液,但還原后即生成紅色而不溶于水的三苯基甲臢(TPF)，TPF比較穩(wěn)定，不會被空氣中的氧自動氧化。TTC能夠被微生物代謝過程中的脫氫酶氧化，發(fā)生顯色反應，但是TTC只能說明菌株具有脫氫酶或脫氫酶活性的高低，不能說明是否能夠產(chǎn)生乙醇。
另外，乙醇和C3-C6正烷醇均可用液相色譜和氣象色譜法檢測，但是這兩種檢測方法樣品的前處理過于麻煩，且儀器價格比較昂貴，操作繁瑣，由此可見目前的篩選方法和乙醇及C3-C6正烷醇檢測方法都不適用于高通量篩選產(chǎn)各種醇的菌株，尋求一種簡便、快速、準確的方法檢測各種正烷醇，對于高通量篩選合適菌株生產(chǎn)乙醇和高級正烷醇具有重要意義。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的
本發(fā)明的目的在于提供一種基于雙酶偶聯(lián)反應的高通量檢測微生物生產(chǎn)乙醇和C3-C6正烷醇的新方法。通過醇氧化酶和過氧化氫酶偶聯(lián)的方法測定乙醇和C3-C6正烷醇，高通量篩選目標微生物。與傳統(tǒng)微生物篩選方法相比，基于雙酶偶聯(lián)反應的高通量篩選方法成本低、效率高、目的性更強，能夠從廣泛的自然界中篩選性能優(yōu)良的菌株。
本發(fā)明的思路
利用醇氧化酶和過氧化氫酶偶聯(lián)的方法，測定乙醇和C3-C6正烷醇含量。在氧氣存在條件下，醇被醇氧化酶氧化，形成醛和過氧化氫，形成的過氧化氫與4-安替比林和苯酚在過氧化氫酶作用下形成一種紅色物質(zhì)醌亞胺。醌亞胺是一種紅色物質(zhì)，在500nm處有特征吸收值。微生物代謝產(chǎn)生乙醇和其他C3-C6的有機醇，通過96孔酶標板和微孔讀板器，利用雙酶偶聯(lián)方法分析檢測代謝產(chǎn)物，篩選高產(chǎn)各種醇的菌株，為基礎研究提供寶貴的菌種資源。
本發(fā)明的技術路線
本發(fā)明的技術路線如下:
(I)利用培養(yǎng)基將篩選樣品進行富集培養(yǎng)48h ；
(2)將富集培養(yǎng)的混合菌利用無菌水進行稀釋(獲得單菌落)，涂布到固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h ；
(3)將固體培養(yǎng)基上長出的單菌落轉(zhuǎn)接到含有液體培養(yǎng)基的96深孔培養(yǎng)板中，每個孔接種一個單菌落，用硅膠蓋蓋好，培養(yǎng)48h ；
(4)將96深孔培養(yǎng)板利用冷凍離心機進行離心，使菌體沉淀；
(5)取96深孔培養(yǎng)板中的上清液與醇氧化酶和過氧化氫酶在96孔酶標板中反應，30°C保溫 30min ；
(6)將反 應結(jié)束的96孔酶標板利用微孔讀板器測定在500nm處的吸光值，并將測定的吸光值與利用醇氧化酶和過氧化氫酶測定醇的標準曲線進行對比，查到醇的濃度；
(7)將測定產(chǎn)乙醇或高級正烷醇濃度高的生產(chǎn)菌株進行保存。
本發(fā)明的優(yōu)點
本發(fā)明的優(yōu)點是:
(I)效率高，醇氧化酶和過氧化氫酶偶聯(lián)能夠快速檢測乙醇或高級正烷醇的含量。
(2)通量高，96深孔培養(yǎng)板和96孔酶標板并結(jié)合微孔讀板器一起使用，使得目的菌株的篩選范圍更廣。
(3)成本低，能夠以較低成本獲得大量菌種。
(4)可以獲得更多菌株，為基礎研究提供菌種資源。
具體實施
以下為列舉的實施例，以便于更好地理解本發(fā)明。
實施例1
利用醇氧化酶和過氧化氫酶偶聯(lián)的方法測定乙醇的標準曲線。Buffer I (200 μ L)中各物質(zhì)含量為:苯酚:6mmol/ml, EDTA:75mg/L,磷酸鹽緩沖液:pH = 7.5,0.lmol/L。BufferII(IOOyL)中各物質(zhì)含量為:醇氧化酶:3000u/L，過氧化氫酶:600u/L，4-安替比林:3.5m mol/L，磷酸鹽緩沖液0.lmol/L pH = 7.5。配制標準乙醇濃度分別為0,0.1,0.5，1.0,1.5,2.0,2.5g/L0步驟:在96孔酶標板中先加入Buffer I溶液200 μ L，再加入不同濃度的乙醇10 μ L,最后加上BufferII溶液100 μ L,所用過程均在冰上進行,混勻之后用封膜封好，30°C保溫30min，在500nm下，測定吸光值，建立0D500nm吸光值與乙醇濃度的標準曲線，R2 = 0.999 (附圖1)，說明乙醇濃度與500nm處的吸收值呈顯著線性關系。
實施例2
稱取溫泉土樣10g，利用培養(yǎng)基在60°C，200rpm條件下進行富集培養(yǎng)24h ;將富集培養(yǎng)的菌群稀釋105、106、107倍，涂布到固體培養(yǎng)基上，601:靜止培養(yǎng)2411。將每孔體積為3mL的96深孔培養(yǎng)板加入ImL的培養(yǎng)基，并將單菌落接種到其中，60°C靜止培養(yǎng)24h。利用Eppendorf冷凍離心機將96深孔培養(yǎng)板在4000rpm, 4°C條件下離心30min。
在96孔酶標板中先加入Buffer I溶液200 μ L，再加入上清液10 μ L，最后加上Buffer II溶液100 μ L，所用過程均在冰上進行，混勻之后用封膜封好，30°C保溫30min，在500nm下，測定吸光值。根據(jù)乙醇標準曲線計算96株菌乙醇產(chǎn)量，得到一株乙醇產(chǎn)量最高的菌株。
實施例3
將上述篩選得到的菌株接種到培養(yǎng)基中，在200rpm，6(TC條件下進行培養(yǎng)24h ;取IOmL培養(yǎng)基，IOOOOrpm離心5min,分別利用醇氧化酶和過氧化氫酶偶聯(lián)的方法以及高效液相法測定乙醇濃度，得到濃度分別為2.32g/L和2.39g/L，兩個數(shù)據(jù)基本吻合，在誤差范圍內(nèi)，說明雙酶偶聯(lián)的方 法測定乙醇可靠。
實施例4
取純正丙醇配制成濃度分別為0.8,1.6,3.2,4.8,6.4,8.0g/Lo在96孔酶標板中先Buffer I溶液200 μ L，再加入不同濃度的正丙醇10 μ L，最后加上BufferII溶液100 μ L，所用過程均在冰上進行，混勻之后用封膜封好，30°C保溫30min，在500nm下測定吸光值，建立0D500nm吸光值與正丙醇濃度的標準曲線(附圖2)，R2 = 0.999，說明在一定范圍內(nèi)，正丙醇濃度與500nm處的吸收值呈顯著線性關系。
實施例5
取純正丁醇配制成濃度分別為0，1.6,3.2,4.8,6.4,8.lg/L。在96孔酶標板中先Buffer I溶液200 μ L，再加入不同濃度的正丁醇10 μ L，最后加上BufferII溶液100 μ L，所用過程均在冰上進行，混勻之后用封膜封好，30°C保溫30min，在500nm下測定吸光值，建立0D500nm吸光值與正丁醇濃度的標準曲線(附圖3)，R2 = 0.998，說明在一定范圍內(nèi)，正丁醇濃度與500nm處的吸收值呈顯著線性關系。
實施例6
取純正戊醇配制成濃度分別為40.0,48.5，65.0,70.0,81.0g/L。在96孔酶標板中先Buffer I溶液200 μ L，再加入不同濃度的正戊醇10 μ L，最后加上BufferII溶液100 μ L，所用過程均在冰上進行，混勻之后用封膜封好，30°C保溫30min，在500nm下測定吸光值，建立0D500nm吸光值與正戊醇濃度的標準曲線(附圖4)，R2 = 0.981，說明在一定范圍內(nèi)，正戊醇濃度與500nm處的吸收值呈顯著線性關系。
實施例7
取純正己醇配制成濃度分別為40.0,48.5，65.0,70.0,81.0g/L。在96孔酶標板中先Buffer I溶液200 μ L，再加入不同濃度的正己醇10 μ L，最后加上Buffer II溶液100 μ L，所用過程均在冰上進行，混勻之后用封膜封好，30°C保溫30min，在500nm下測定吸光值，建立0D500nm吸光值與正己醇濃度的標準曲線(附圖5)，R2 = 0.984，說明在一定范圍內(nèi)，正己醇濃度與500mn處的吸收值呈線性關系。


附圖1:乙醇濃度與雙酶偶聯(lián)反應產(chǎn)物在500nm處吸光值建立的標準曲線。
附圖2:正丙醇濃度與雙酶偶聯(lián)反應產(chǎn)物在500nm處吸光值建立的標準曲線。
附圖3:正丁醇濃度與雙酶偶聯(lián)反應產(chǎn)物在500nm處吸光值建立的標準曲線。
附圖4:正戊醇濃度與雙酶偶聯(lián)反應產(chǎn)物在500nm處吸光值建立的標準曲線。
附圖5:正己醇濃度與雙酶偶聯(lián) 反應產(chǎn)物在500nm處吸光值建立的標準曲線
權利要求
1.一種利用醇氧化酶和過氧化酶偶聯(lián)反應的檢測微生物生產(chǎn)乙醇和C3-C6正烷醇的高通量檢測新方法，步驟如下: (1)將培養(yǎng)基富集菌群經(jīng)稀釋后涂布到固體培養(yǎng)基中，待單菌落長出后接種到96深孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)； (2)將96深孔培養(yǎng)板利用冷凍離心機在合適的條件下離心，取其上清液進行測定； (3)利用雙酶偶聯(lián)的方法，在96孔酶標板中結(jié)合BufferI和Buffer II測定上述上清液中醇含量。
2.按權利要求1中所述的方法，其特征是:所述的96深孔培養(yǎng)板是體積為3mL，但是每孔中加入0.5-2.5mL的培養(yǎng)基。
3.按權利要求1中所述的方法，其特征是:所述的冷凍離心機是能夠直接離心96深孔培養(yǎng)板。
4.按權利要求1中所述的方法，其特征是:所述的離心條件為4°C，4000rpm離心10_60min。
5.按權利要求1中所述的方法，其特征是:所述的上清液中不能含有菌體。
6.按權利要求1中所述的方法，其特征是:所述的雙酶是醇氧化酶和過氧化氫酶。
7.按權利要求1中所述的方法，其特征是:所述的BufferI中各物質(zhì)含量為:苯酚:l-10mmol/ml, EDTA:25_150mg/L，磷酸鹽緩沖液:pH7.5,0.05-0.5mol/L。
8.按權利要求1中所述的方法，其特征是:所述的BufferII中各物質(zhì)含量為:醇氧化酶:500-6000U/L，過氧化氫酶:100-1000U/L，4-安替比林:l-5mmol/L，磷酸鹽緩沖液0.05-0.5mol/L, pH = 7.5。
9.按權利要求1中所述的方法，其特征是:所述的96孔酶標板需要放置冰上，待Buffer I和Buffer II及樣品加入到其中后在30°C下反應5_60min。
10. 按權利要求1中所述的方法，其特征是:所述的測定波長為500nm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于雙酶偶聯(lián)反應的高通量檢測微生物生產(chǎn)乙醇和C3-C6正烷醇的新方法，具體涉及利用醇氧化酶和過氧化氫酶偶聯(lián)，在相應緩沖溶液中與乙醇或C3-C6正烷醇的反應，產(chǎn)生紅色物質(zhì)醌亞胺。雙酶偶聯(lián)反應在96孔酶標板中進行，利用微孔讀板器讀取在500nm處的吸光值。乙醇和C3-C6正烷醇與雙酶偶聯(lián)反應生成產(chǎn)物在500nm處的吸光值與其濃度成線性關系，能夠根據(jù)標準曲線計算濃度，并利用微孔讀板器和96孔酶標板進行高通量檢測。
文檔編號C12Q1/30GK103146803SQ20111043291
公開日2013年6月12日 申請日期2011年12月7日 優(yōu)先權日2011年12月7日
發(fā)明者王欽宏, 齊顯尼, 涂然, 孫琳, 姜丹 申請人:天津工業(yè)生物技術研究所